Name: 利用颅窗口，在可视化的大脑中动脉内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习利用颅窗口技术在大鼠脑中动脉进行内皮素-1诱导闭塞的可视化方法。通过颞骨开颅术直接观察脑血管反应，为缺血性中风研究提供实时血管动态数据。

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本研究得到了美国心脏协会大东南分会（09GRNT2060421）、美国医学会以及佛罗里达大学临床与转化科学研究所的资助。Adam Mecca 获美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）国家研究服务奖（NRSA）博士前奖学金资助（F30 NS-060335）。Robert Regenhardt 获佛罗里达大学高血压多学科培训项目（T32 HL-083810）博士前奖学金支持。

本方案已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的要求。
材料
<ol>
 <li>动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，Wilmington，MA，美国），手术时体重为250–300 g。</li>
 <li>麻醉
 <ol class="lalpha">
 <li>吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，美国）</li>
 <li>异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>立体定位系统（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国）
 <ol class="lalpha">
 <li>小型动物立体定位仪</li>
 <li>大鼠用无创耳杆</li>
 <li>大鼠用气体麻醉头部固定器</li>
 </ol>
 </li>
 <li>体温调节
 <ol class="lalpha">
 <li>BAT-12微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，美国）</li>
 <li>T/PUMP，TP600温控毯（Gaymar Industries, Inc.，Orchard Park，NY，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术器械
 <ol class="lalpha">
 <li>梅岑鲍姆剪刀、虹膜镊、鳄嘴钳牵开器、10 μl注射器配26号斜面针头、Bovie电凝器套装（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，美国）</li>
 <li>微型电机钻（Stoelting，Wood Dale，IL，美国）</li>
 <li>0.8 mm圆形钻头（Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，Gaithersburg，MD，美国）</li>
 <li>STORZ Bonn缝合镊（Bausch and Lomb, Inc.，Rochester，NY，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术耗材
 <ol class="lalpha">
 <li>3.0尼龙缝线（Oasis，Mettawa，IL，美国）</li>
 <li>棉签、Puralube眼膏（Fisher Scientific，Pittsburg，PA，美国）</li>
 <li>外科缝合钉和胶带（Medtronic Xomed, Inc.，Jacksonville，FL，美国）</li>
 <li>电动剃毛剪（Oster，Providence，RI，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>化学试剂
 <ol class="lalpha">
 <li>内皮素-1（American Peptide，Sunnyvale，CA，美国）</li>
 <li>2%氯己定（Agrilabs，St. Joseph，MO，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>可视化设备
 <ol class="lalpha">
 <li>手术显微镜（Seiler Instrument and Manufacturing；St. Louis，MO，美国）</li>
 <li>Sony Handycam HDR-SR12（Sony，Minato，Tokyo，日本）</li>
 <li>光纤照明器（TechniQuip Corp.，Livermore，CA，美国）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>血管直径测量
 <ol class="lalpha">
 <li>VLC媒体播放器（Paris，法国）</li>
 <li>Image J软件（ImageJ 1.42q软件，美国国立卫生研究院，Bethesda，MA，美国）</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
1. 术前步骤
<ol>
 <li>手术前，大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，可自由获取水和啮齿类动物饲料。</li>
 <li>在诱导舱内使用含4%异氟烷的100% O2气体混合物诱导麻醉。</li>
 <li>使用电动理发剪剃除头顶部的毛发。</li>
 <li>将大鼠俯卧位放置在吸水垫上，垫子置于温度可控的手术台面（加热毯）上，并将大鼠头部固定于立体定位仪中，首先安装气体麻醉面罩。</li>
 <li>随后插入并拧紧耳杆。</li>
 <li>手术过程中，通过含2%异氟烷的100% O2气体混合物维持麻醉状态。</li>
 <li>在双眼涂抹眼用润滑软膏，并闭合眼睑，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
 <li>插入直肠温度探头，以维持动物核心体温恒定在37±0.5 °C。</li>
 <li>将麻醉后的大鼠头部牢固固定于立体定位装置中后，使用氯己定和生理盐水交替清洗手术区域三次。</li>
</ol>
2. 颅窗前准备
在制作颅窗之前，应为大鼠植入其他必需的硬件设备，并完成所有必要的手术操作，以做好实验准备。在本方案中，我们此前已植入导管套管，用于内皮素-1（ET-1）诱导的中动脉闭塞（MCAO），具体方法见配套出版物《大鼠内皮素-1诱导中动脉闭塞缺血性卒中模型的激光多普勒血流仪引导技术》。
 
3. 颅窗的制备
在放置引导套管或实验所需设备后，制备颅窗以在卒中过程中直接观察大脑中动脉的近端部分。
<ol>
 <li>首先，使用剪刀从内侧开始向外侧切开覆盖在颞肌上的皮肤。</li>
 <li>使用电凝刀将颞肌一分为二，然后用3.0尼龙缝线牵拉暴露颞骨的鳞部。</li>
 <li>在眶后方、颧突起始部上方的颞骨鳞部区域，绘制一个约3–4 mm的正方形区域，该区域位于颧突自颞骨延伸出的位置之上。</li>
 <li>使用钻头逐渐将所标记的骨块从颞骨上分离。操作时应避免对钻头施加过大压力，以防损伤硬脑膜或大脑皮层。</li>
 <li>频繁使用无菌生理盐水冲洗，以改善手术视野的可视性，并防止颅骨过热。</li>
 <li>从一个较松动的角开始，使用精细的鼠齿镊小心移除颞骨骨块，同时注意避免撕裂与硬脑膜相关的任何血管。</li>
 <li>保持硬脑膜完整，并用无菌生理盐水冲洗清除碎屑。</li>
</ol>
4. 脑动脉收缩的记录
为了演示如何实时采集图像，本方案采用经ET-1诱导发生大脑中动脉闭塞（MCAO）的大鼠进行实验。
<ol>
 <li>在施用血管活性化合物之前，应至少记录1分钟的基础视频。对于ET-1诱导的MCAO，基础视频记录应在针头已插入脑实质但尚未注射ET-1时进行。</li>
 <li>启动注射泵开始注射，并持续记录1小时，或直至达到预设的实验终点。在视频记录期间，针头应保持原位，以防止焦平面受到干扰。</li>
 <li>大鼠应在该操作结束后，根据批准的实验方案进行深度麻醉并实施安乐死。</li>
</ol>
5. 图像分析
可视化的大脑中动脉（MCA）任意部位的血管直径均可测定。以其中一支MCA分支为例，我们将在ET-1注射前和注射后的时间点测量其血管直径。使用VLC媒体播放器（VideoLAN）以每分钟1帧的间隔从视频中截取静态图像。
<ol>
 <li>安装并打开 VLC 播放器。</li>
 <li>选择“工具”然后选择“偏好设置”，在“显示设置”下将设置更改为“全部”。</li>
 <li>在左侧边栏中展开“视频菜单”，然后展开“输出模块”。选择“场景滤镜”以打开场景视频滤镜菜单。</li>
 <li>在文件名前缀的输入框中输入“Scene”。</li>
 <li>定义一个目录路径前缀，用于保存静止帧图像。</li>
 <li>根据所需的静止帧捕获速率选择录制比率。如果视频的采集速率为每秒 29 帧，则应在输入框中输入“1749”（29 帧/秒 × 60 秒/分钟），以实现每分钟保存一张静止帧。所有更改完成后保存设置。</li>
 <li>随后在 VLC 播放器中打开目标视频，系统将自动每分钟保存一张静止帧图像。</li>
 <li>使用这些图像测量血管直径。首先打开 ImageJ 软件（NIH）。</li>
 <li>然后在 ImageJ 中打开需要测量的静止帧图像。</li>
 <li>选择“分析”菜单，打开“设置测量”选项，并取消勾选所有复选框。</li>
 <li>接下来选择直线工具。</li>
 <li>根据需要使用键盘快捷键“Ctrl +”放大图像，并绘制一条垂直于血管走向的直线以测量血管直径。</li>
 <li>最后，通过选择“分析”菜单中的“测量”选项（ctrl+M），获得血管直径的测量值。</li>
 <li>对每一幅静止帧中的每个待测血管，重复此过程至少三次，并取平均值。</li>
 <li>将每个时间点的血管直径归一化为基线血管直径，以便在多只大鼠之间进行比较。具体计算方法为：当前直径 / 基线直径 × 100%，得到每个血管相对于基线的百分比直径。</li>
</ol>

<ol><li>Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+description+of+a+cranial+window+technique+for+acute+and+chronic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments.</a> Stroke. 6, 308-317 (1975).</li>
<li>Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cerebral+arterioles+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats.</a> Circ. Res. 62, 56-64 (1988).</li>
<li>Regrigny, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+melatonin+on+rat+pial+arteriolar+diameter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo.</a> Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).</li>
<li>Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candesartan+pretreatment+is+cerebroprotective+in+a+rat+model+of+endothelin-1-induced+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion.</a> Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).</li>
<li>Mecca, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroprotection+by+angiotensin-%281-7%29+in+endothelin-1-induced+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke.</a> Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

总之，这种颅窗制备技术具有很高的通用性，只需进行少量修改即可适应多种实验需求4, 5。例如，我们已成功利用激光多普勒血流仪，通过颅窗直接观察大脑中动脉的特定分支，监测其局部脑血流量（Mecca AP 2009 和 2011）。此外，若在制备过程中切开硬脑膜，则可结合局部应用血管活性化合物，构建一个体内血管反应性灌流环境3。在制备颅窗时，应考虑多个因素，以降低该技术的失败率。其中许多因素与能否清晰观察脑动脉密切相关。首先，在进行颅骨切除时必须小心操作，避免钻头损伤其上方的硬脑膜或血管。这一点可通过频繁使用无菌生理盐水冲洗以清除碎屑并冷却颅骨来实现。其次，移除骨瓣时应轻柔操作。若骨瓣不易剥离，则应使用钻头进一步去除周围骨质。最后，少量血液或脑脊液都可能在操作过程中显著影响颅窗的观察效果。本方法所实施的颅骨切除范围略大于实际观察所需，因此可在手术区域的低垂部位放置若干吸水海绵，防止液体积聚。在更换这些海绵时，只要注意避免手术器械遮挡观察窗，即可根据需要随时更换。

<table><tbody><tr><td>吸入麻醉系统</td><td>VetEquip 公司，普莱森顿，加利福尼亚州，美国</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂</td><td>Baxter Pharmaceutics，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪 </td><td>David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>非穿孔式耳杆，大鼠</td><td>David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>大鼠气体麻醉头部固定器 </td><td>David Kopf Instruments，美国加利福尼亚州图洪加</td><td>1929</td><td></td></tr><tr><td>BAT-12 微探针温度计</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMP，保温毯</td><td>Gaymar Industries, Inc.，美国纽约州奥查德帕克</td><td>T/PUMP，TP600</td><td></td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司</td><td>501254</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>布狗钳拉钩</td><td>世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国</td><td>14119-G</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;1 支 26 号针头注射器</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司</td><td>SGE010RNS</td><td></td></tr><tr><td>Bovie，高温电灼套装</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司</td><td>500392</td><td></td></tr><tr><td>大鼠牙科镊 0.12</td><td>Stotz</td><td>E1811</td><td></td></tr><tr><td>微型马达钻机</td><td>Stoelting，Wood Dale，IL，美国</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm圆形钻头</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，美国马里兰州盖瑟斯堡</td><td>RS-6280C-1</td><td></td></tr><tr><td>STORZ Bonn 缝合钳</td><td>博士伦公司，纽约州罗切斯特市，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝合线，3.0 号</td><td>Oasis，Mettawa，IL，美国</td><td>MV-663</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国</td><td>22-029-488</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 眼用软膏</td><td>美国宾夕法尼亚州匹兹堡费舍尔科学公司</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>电动理发剪 </td><td>美国罗德岛州普罗维登斯，Oster</td><td>78005-301</td><td></td></tr><tr><td>ET-1 稀释至 80 &lt;em&gt;&amp;mu;&lt;/em&gt;PBS 中的 M 浓度 </td><td>美国加利福尼亚州森尼韦尔，American Peptide 公司</td><td>88-1-10A</td><td></td></tr><tr><td>氯己定，2% </td><td>Agrilabs，美国密苏里州圣约瑟夫</td><td>1040，修订版 6-06，NAC 编号：10580322</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜 </td><td>Seiler Instrument and Manufacturing，美国密苏里州圣路易斯</td><td>Evolution xR6</td><td></td></tr><tr><td>索尼 Handycam</td><td>Sony，东京都港区，日本</td><td>HDR-SR12</td><td></td></tr><tr><td>光纤照明光源 </td><td>TechniQuip Corp.，美国加利福尼亚州利弗莫尔</td><td>FO1&amp;#8211;150</td><td></td></tr><tr><td>VLC 媒体播放器</td><td>（法国巴黎）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马萨诸塞州，美国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用颅窗技术观察内皮素-1诱导的中动脉闭塞期间的中脑动脉

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

颅窗制备是一种允许直接观察脑皮层表面结构的方法1-3。该技术可在大鼠大脑表面多个位置实施，但最简便的方式是在易于接近的额骨或顶骨区域行颅骨切除术。我们最常将该技术与内皮素-1诱导的中动脉闭塞缺血性脑卒中模型联合使用，以定量分析将内皮素-1注射至邻近大脑中动脉（MCA）近端的脑实质后，大脑中动脉血管直径发生的变化4, 5。为了在内皮素-1诱导的MCA闭塞过程中观察MCA的近端部分，我们采用一种在大鼠颅骨侧部的颞骨上制备颅窗的技术（图1）。脑动脉可在硬脑膜完整的情况下或在切开并牵开硬脑膜后进行观察。通常情况下，我们在观察过程中保持硬脑膜完整，因为内皮素-1诱导的MCA闭塞需要将血管收缩肽直接递送至脑实质，从而避免了为给药而直接在被观察血管上方切开硬脑膜的需要。本实验方案将逐步描述如何制备颅窗以观察脑动脉，并介绍如何避免该方法中许多潜在的技术难点。

从采集的视频中截取的静态图像显示，使用这种颅窗技术可以清晰地观察到注射ET-1后脑动脉直径的变化（图2）。在注射ET-1后的几分钟内，血管即开始收缩。最终血管将难以观察，脑组织也会变得苍白。大约20分钟后，ET-1的作用逐渐减弱，血管开始扩张，并在约45分钟后逐渐恢复至基线水平的直径。除了明显的血管收缩外，皮质表面在给予ET-1后也会变得更为苍白。如有需要，可使用经校准的显微镜测微尺计算血管直径的绝对变化量。为了在多只大鼠之间进行比较，我们通常计算实验过程中血管直径的相对变化。这些测量可通过ImageJ软件（NIH）完成，随后可绘制出反映血管直径随时间相对变化的曲线图（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/50015/50015fig1.jpg" alt="颅骨解剖图，标注引导套管、眼眶、前囟、颞骨，用于实验设置。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_uplo...

本文介绍了一种通过颅窗和时序性颅骨切除术观察大鼠大脑动脉的方法，以可视化大脑中动脉的近端部分（图1）。该方法具有良好的适应性，可与多种药物递送技术结合，用于在活体（in vivo）条件下测量脑动脉的反应性。

创建颅窗是一种允许直接观察脑皮层表面结构的方法1-3。该技术可……

在本视频方案中，我们将演示如何利用颅窗技术在内皮素-1诱导的中动脉闭塞过程中观察大脑中动脉。为此颅窗制备，需进行颞部颅骨切除术，以便观察大脑中动脉的近端部分。颅窗的建立是一种允许直接观察脑皮层表面结构的方法。该技术可在大鼠大脑的多个部位进行，但最简便的方法是在易于接触的额骨或顶骨处创建C形颅窗。我们最常将该技术与内皮素诱导的中动脉闭塞（endothelial one induced middle cerebral artery occlusion）或ET-1诱导的MCAO缺血性卒中模型结合使用。通过颅窗手术，定量分析注射ET-1至大脑实质后，邻近大脑中动脉（MCA）近端处血管直径的变化。具体而言，我们采用一种技术，在大鼠颅骨侧部的颞骨上创建颅窗。随后可在硬脑膜保持完整或经剥离并牵开的情况下观察脑动脉。通常情况下，我们在观察时保留硬脑膜完整。由于ET-1诱导的MCAO需要将血管收缩肽递送至脑实质中，因此无需在可视化血管上方直接切开硬脑膜以进行药物递送。在本视频中，我们将逐步演示如何制作颅窗以观察脑动脉，同时介绍如何避免该方法中常见的多种潜在问题。在按照前述方法放置导管套管后，可制作颅窗以在卒中实验过程中直接观察大脑中动脉的近端部分。首先，使用剪刀按图示在头皮上做一个切口，并牵开皮肤以暴露颞肌。使用电凝刀切开颞肌，并进行牵拉以暴露颞骨鳞部。充分暴露颞骨对此手术步骤至关重要。电凝时需注意避免损伤眼眶区域。为了改善可视化效果，使用缝线牵开已切开的颞肌。在颞骨鳞部靠近眼眶且位于颧突基底部上方的区域画一个边长三到四毫米的正方形，该区域紧邻颞骨的反射面。使用钻头切除该部分骨质。注意避免施加过大的压力，以免钻入脑组织。务必频繁使用无菌生理盐水冲洗，以改善手术视野的可视性，并防止颅骨过热。从颞骨的游离角开始，使用精细的鼠齿镊小心地移除骨片，注意不要撕裂与硬脑膜相连的任何血管。在此可以观察到注射内皮素-1之前大脑中动脉分支的基础状态。内皮素-1注射后数分钟内，大脑中动脉开始收缩。最终，其分支难以观察，脑组织颜色变苍白。大约20分钟后，内皮素-1的作用将逐渐减弱，血管会开始缓慢扩张，并在约45分钟后恢复至基础直径。为测量血管直径，在内皮素-1注射前后不同时间点，每隔一分钟从视频中截取静态帧图像。使用VLC媒体播放器时，进入工具、偏好设置，然后将“显示设置”更改为“全部”。展开左侧栏中的视频菜单并展开输出模块。为文件名前缀选择场景筛选类型场景，然后添加一个目录路径。接下来，根据书面方案中所述的视频帧率，设置静止帧捕获的记录间隔。最后，点击保存并打开。所需视频和VLC播放器将自动每隔一分钟保存一次静止帧，以测量血管直径。首先使用这些图像，打开 Image J 软件，然后打开需要测量的静态帧。进入分析菜单，设置测量选项，并取消选择所有复选框。选择直线工具，根据需要进行放大。放置一条垂直

utilizing-cranial-window-to-visualize-middle-cerebral-artery-during

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科研

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医学

利用颅窗口，在可视化的大脑中动脉内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞

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