Name: 基因改造和重组唾液的腺体器官培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学习利用腺病毒载体对小鼠胚胎下颌下唾液腺上皮细胞进行基因改造，通过分离上皮与间充质并重组培养，研究基因功能对分支形态发生的影响。该方法无需构建转基因动物即可实现特定组织区室的精准遗传操作。

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作者谨此感谢 Deirdre Nelson 博士对本文提出的宝贵意见以及对稿件的审阅。本研究由 NIH 基金项目 DE019244、DE019197 和 DE021841（资助给 M.L.）、F32DE02098001（资助给 S.J.S）以及 C06 RR015464（资助给纽约州立大学奥尔巴尼分校）提供经费支持。

该方案包含四个主要步骤，如图1所示。所有步骤均进行了详细描述。腺病毒构建及病毒纯化应在器官 harvesting 之前完成，以便用于分离的上皮原基的基因转导。操作腺病毒时应遵循所有标准的BSL-2安全防护措施。
1. 小鼠胚胎下颌下腺（SMG）的获取与显微解剖
<ol>
 <li>使用 CO₂ 处死已定时妊娠的雌性小鼠（远交系 CD-1 或 ICR）2 麻醉后通过颈椎脱位处死小鼠，并在胚胎第13天（E13，3-5个上皮芽期）按照机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的程序采集胚胎下颌下腺。发现阴道栓的当天记为E0。也可在E12阶段采集并培养唾液腺，此时腺体仅有一个初级芽状结构及芽柄，裂隙刚刚开始形成。早于该阶段的下颌下腺（SMGs）需要采用与本文所述不同的培养条件。</li>
 <li>将胚胎串转移至无菌的10 cm组织培养皿中，培养皿内含25 ml不含酚红的DMEM/Ham's F12培养基（F12，Life Technologies），并添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（青霉素-链霉素，pen-strep，Life Technologies）。</li>
 <li>使用无菌手术刀（#11 刀片）和镊子（#5，Fine Science Tools，11252-20），将胚胎从胚囊中取出，放入另一含有 25 ml DMEM/F12 + 青霉素-链霉素的 10 cm 培养皿中。</li>
 <li>用斜切方式在下颌下方切断胚胎头部。</li>
 <li>在体视解剖显微镜（Nikon SMZ645 或同等型号）下，使用透射光源底座，于上颌下方进行切割，从头部分离下颌骨。将组织置于额外的一块玻璃片上，而非直接放置在显微镜底座的玻璃部件上。</li>
 <li>将下颌骨收集到无菌的35 mm组织培养皿中的3 ml DMEM/F12 + 青霉素-链霉素溶液中。</li>
 <li>将下颌切片置于解剖显微镜载物台上，使舌位于切片底部，但朝向12:00位置。</li>
 <li>使用两把交叉镊子中的一侧，以剪切动作移除并丢弃下部1/3rd 下颌骨切片</li>
 <li>将切片向右旋转90°（若为右手操作），用镊子进行剪切式切割，从切片上半部分的下颌区域开始切割至切片中间位置，注意不要切到舌头。</li>
 <li>剥离多余的组织并将其移除，以暴露下方的下颌下腺。在舌根底部两侧各有一个下颌下腺。</li>
 <li>用一对镊子压住舌侧组织，另一对镊子将下颌下腺从舌侧轻轻剥离。另一侧腺体同样操作。</li>
 <li>将显微解剖分离的唾液腺收集到新的无菌35 mm组织培养皿中的3 ml DMEM/F12 + 青霉素-链霉素溶液中。注意：下颌下腺（3–5个上皮芽）较大，与其相连的舌下腺较小（1个芽），可跳过至第4步，并按前述方法执行步骤4.1、4.3和4.4，进行整体培养。 2,8.</li>
</ol>
2. 下颌下腺上皮始基分离
<ol>
 <li>将5个（或更多）唾液腺放入含有200 μl Hank平衡盐溶液（HBSS，不含Ca++或Mg++，Life Technologies）的玻璃底50 mm直径微孔培养皿（MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F）中，该溶液中含有0.4%（v/v）dispase（Life Technologies，货号17105-041），在37 °C下孵育15分钟。</li>
 <li>孵育结束后，使用无菌的200 μl移液枪头，小心吸除dispase溶液，避免扰动腺体。立即加入200 μl含5%（w/v）BSA的DMEM/F12培养基（DMEM/F12-BSA，经0.22 μm滤器预灭菌），以中和dispase。</li>
 <li>在解剖显微镜下，使用尖端精细的镊子（#5 Dumostar，Fine Science Tools，11295-20），轻柔地将疏松的间充质从下颌下腺（SMG）上皮芽和导管周围分离，注意保持上皮组织完整。</li>
 <li>用DMEM/F12-BSA培养基预先润湿无菌的200 μl移液枪头，轻柔地将上皮原基吹打出来，转移至另一个含有200 μl DMEM/F12 + 青霉素-链霉素（pen-strep）的50 mm直径微孔培养皿中。使用高质量、边缘光滑的200 μl移液枪头。</li>
 <li>在含有间充质组织的培养皿中，弃去所有非间充质组织，包括舌下腺以及任何脱落的下颌下腺上皮芽。</li>
</ol>
3. 上皮原基的腺病毒感染
<ol>
 <li>在微量离心管中，将目标腺病毒用 DMEM/F12 + 青霉素-链霉素稀释，配制 200 μl 病毒感染液，使终浓度为 1×108–109 PFUs。不同病毒所需的最适滴度可能有所不同。为获得最佳摄取效率，必须使用经氯化铯（CsCl）纯化的病毒制剂。</li>
 <li>吸除含有五个上皮原基的培养皿中的培养液。迅速加入 200 μl 感染液，始终保持原基湿润。操作病毒及处理被污染的枪头时需采取必要的防护措施。用 10% 漂白液对任何被病毒污染的表面进行消毒。</li>
 <li>用镊子将上皮原基彼此分开，防止其粘连，并使其沉降至培养皿底部。在室温下将原基在病毒感染液中孵育 1 小时。孵育期间，若原基靠近，需将其分开。过度摇动或移动会导致腺体聚集成团。</li>
 <li>孵育结束后，轻柔吸除含病毒的培养液并妥善弃置，注意不要破坏原基。加入 200 μl DMEM/F12 + 青霉素-链霉素。至少重复此洗涤步骤两次，并最终更换为 200 μl DMEM/F12 + 青霉素-链霉素培养液。这些洗涤步骤至关重要，可去除未牢固结合到上皮的病毒，从而防止间充质被感染。</li>
 <li>将上皮原基在含有 2%（v/v）Matrigel（BD Biosciences，356231）的 200 μl DMEM/F12 中孵育 20 分钟。我们发现，短时间的 Matrigel 孵育可最大限度减少初始培养阶段已有裂隙的退化；但如果不需要接触 Matrigel，此步骤可省略。</li>
</ol>
4. 离体 重组唾液腺的培养
<ol>
 <li>使用预先润湿的200 μl移液器吸头，依次将每个原基放置在漂浮于200 μl培养基中的带缺口（小切口）13 mm、0.1 μm核孔蚀刻膜滤膜（Whatman）上（每张滤膜放置5个原基），培养板为玻璃底多孔板。培养基成分为：DMEM/F12 + 青霉素-链霉素，含50 μg/ml转铁蛋白和150 μg/ml抗坏血酸，如前所述2,8。已知转铁蛋白可促进唾液腺及其他器官外植体的存活和分支形态发生9。添加抗坏血酸已被证明可刺激下颌下腺（SMG）的分支形成10。它作为多种代谢途径中羟化反应的辅因子（例如胶原纤维形成过程中的脯氨酸羟化11），并可促进其他器官外植体中纤连蛋白和层粘连蛋白的产生12。</li>
 <li>每次加入上皮原基后，尽可能吸除滤膜表面多余的培养基。滤膜表面过多的培养基可能导致滤膜下沉，而较少的液体则更便于原基和间充质的定位。多余液体可用移液器吸头吸除，或用镊子夹住液滴将其移除。</li>
 <li>将来自三至四个腺体的间充质组织块放置在每个上皮原基的上方和/或周围。清除腺体周围多余的培养基，以防止间充质偏离原基位置。使用过多的间充质并无益处，而过少则可能不利于上皮原基的生长。</li>
 <li>将重组的下颌下腺（SMG）置于湿润培养箱中（95%空气/5% CO2），在37 °C条件下培养48–72小时，根据实验需要确定时间。</li>
 <li>在0小时（如需要）、重组后2小时及此后每24小时，使用配备数码相机的倒置、正置或体视显微镜，采用4X或5X物镜获取活体腺体的明场和/或荧光图像，以在单个视野中完整捕获整个重组腺体。唾液腺图像在明场模式下或通过将合适的相差环部分插入光路时对比度最佳（全自动显微镜无法实现此操作）。由于腺体较厚并能自然产生对比度，标准相差显微镜并非必需。</li>
 <li>在所需时间点，可用固定液（含5% w/v蔗糖的1X PBS中的2%多聚甲醛（PFA））对重组的下颌下腺（SMG）进行20分钟固定（蔗糖有助于维持细胞等渗状态，从而更好地保存细胞内部结构）。与4% PFA不同，若在固定后彻底去除固定液，2% PFA可保留大量GFP信号。固定后的腺体可在4 °C避光条件下保存于1X PBS中，最长可达1周，直至进行整体免疫细胞化学染色和共聚焦成像，如先前报道3,6,13-15。理想情况下，应在固定后尽快进行免疫染色和成像，以获得最佳图像质量。腺体也可用RIPA缓冲液裂解，进行SDS-PAGE电泳，随后进行Western blot分析。</li>
</ol>

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<li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li>
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<li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li>
<li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li>
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<li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该 离体 上皮-间充质重组技术于1981年首次发表于下颌下唾液腺研究16在此方案中，我们对原始方法进行了拓展，利用腺病毒感染在重组腺体的背景下调控上皮细胞的基因表达。我们发现，部分上皮细胞可被腺病毒感染，而感染细胞的比例取决于病毒启动子的特性、病毒滴度以及病毒纯度。我们发现，为实现高效的上皮细胞转导，必须使用经氯化铯（CsCl）梯度离心纯化的病毒，但该纯化步骤未在本文中描述。由于我们此前还成功在组织重组前感染了间充质细胞（数据未展示），因此对间充质细胞群体进行独立的遗传操作也是可行的。我们近期利用该腺病毒转染/组织重组方法，鉴定出极性蛋白PAR-1b在发育中唾液腺上皮调控基底膜定位过程中的作用。本研究中同时使用了激酶失活型PAR-1b腺病毒和野生型PAR-1b腺病毒。13 用于感染上皮始基并与E13间充质重组。利用突变病毒来探究特定分子功能的能力显著提高了该方法的实用性。
目前尚缺乏有效的工具，能够在不影响间充质成分的情况下，靶向完整胚胎唾液腺上皮细胞群体中的特定分子。尽管已有多个研究使用药理学抑制剂来调控完整器官培养...

<table><tbody><tr><td>不含酚红的DMEM/Ham's F12培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070-163</td><td>10X 储存液</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td>分装为单次使用量，-20°C 冻存</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2934-100G</td><td>第五组分，低内毒素</td></tr><tr><td>Adeno-X-GFP</td><td>BD Biosciences</td><td>8138-1</td><td>应为高滴度（1×10&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; pfu/ml）。CsCl纯化的病毒在此实验中比柱纯化的病毒更有效。</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用含5%蔗糖（w/v）的PBS稀释至2%</td></tr><tr><td>1X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td>由10X 储存液配制</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>不含钙、不含镁、不含酚红</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>在DMEM/F12培养基中配制成25 mg/ml的储存液。分装为单次使用量，-20°C 冻存</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸（维生素C）</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>在DMEM/F12培养基中配制成75 mg/ml的储存液。分装为单次使用量，-20°C 冻存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1. &lt;/strong&gt;SMG重组实验所需试剂清单。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm无菌塑料培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>也可使用未经组织培养处理的培养皿。</td></tr><tr><td>带透射光源底座的体视解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>任何带有透射光源底座的体视解剖显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>35 mm组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>也可使用未经组织培养处理的培养皿。</td></tr><tr><td>直径50 mm的微孔培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P50-G-1.5-14F</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 轨迹蚀刻膜滤器</td><td>Whatman</td><td>110405</td><td>直径13 mm，孔径0.1 mm</td></tr><tr><td>宽场荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss, USA</td><td>Axio Observer Z1</td><td>任何荧光显微镜（直立式、倒置式或体视解剖显微镜）均可用于在低倍镜下通过连接的数码相机监测GFP表达。</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>共聚焦显微镜对于观察细胞精细结构是必需的。任何共聚焦显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>妊娠定时的雌性小鼠，CD-1或ICR品系</td><td>Charles River Labs</td><td></td><td>在第13天取材（以发现阴道栓当天为第0天）。</td></tr><tr><td>手术刀片 #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，不锈钢合金，0.05 mm × 0.02 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>适用于从胚胎中采集腺体</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，dumostar合金，0.05 mm × 0.01 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>去除上皮中的间充质需要使用尖端更细的镊子。也可使用钨针。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2. &lt;/strong&gt;SMG重组实验所用设备清单。</td></tr></tbody></table>

唾液腺类器官培养的遗传修饰与重组

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

分支形态发生发生在多种器官的发育过程中，胚胎小鼠下颌下腺（SMG）是研究分支形态发生的经典模型。在SMG的发育过程中，这一过程涉及上皮芽和导管形成的反复迭代步骤，最终形成由腺泡和导管组成的复杂分支网络，分别负责唾液的产生以及修饰与运输至口腔1-3。上皮相关的基底膜以及间充质区的某些组分（包括间充质细胞、生长因子以及这些细胞分泌的细胞外基质）对分支机制至关重要，但细胞和分子事件如何协调仍知之甚少4。研究驱动上皮形态发生的分子机制有助于加深我们对发育机制的理解，并为再生医学策略提供线索。由于缺乏有效的唾液腺上皮遗传操作方法，此类研究受到限制。目前，腺病毒感染是在体内靶向成年腺体上皮细胞最有效的方法in vivo5。然而，在胚胎外植体中，致密的间充质以及包围上皮细胞的基底膜阻碍了病毒进入上皮细胞。若去除间充质，则可利用腺病毒转染上皮，且上皮原基可在Matrigel或层粘连蛋白-111存在下恢复分支形态发生6,7。无间充质的上皮原基生长还需额外补充可溶性生长因子，且不能完全重现完整腺体中的分支形态发生过程8。本文介绍一种技术，可促进腺病毒对上皮细胞的转导，并实现转染后上皮与相关间充质共同培养。通过对胚胎SMG进行显微解剖，去除间充质后，用携带GFP的腺病毒感染上皮，我们发现上皮可自发地与未感染的间充质重新组合，重现完整SMG腺体结构及分支形态发生过程。若使用荧光标记的腺病毒载体，可通过标准荧光显微镜方法轻松监测基因修饰的上皮细胞群体。本文所述的组织重组方法目前是转染复杂三维组织结构中上皮细胞最为有效且易于实现的技术，无需构建转基因动物即可使用野生型或突变型载体进行操作。

主要实验步骤的流程概述如下 图1. 完整的下颌下腺、分离的上皮始基及其相应的间充质示例示于 图2重组后的小唾液腺在培养过程中持续进行分支形态发生时的明场图像 离体 在指定时间点的结果如图所示 图3. 表达上皮细胞GFP的重组腺体培养48小时后的图像如图所示 图4. 共聚焦显微镜图像显示了重组下颌下腺在培养72小时后经固定、免疫细胞化学染色并成像的结果 图5上皮标志物 E-cadherin 可将表达 GFP 的上皮细胞群体与周围的间充质区分开来。基底膜蛋白 perlecan 在上皮外围的定位表明，在重组腺体中基底膜至少实现了部分重建。 图6副交感神经下颌下神经节在重组培养中表现出神经突生长并支配腺体，此现象先前已有报道。19
<img alt="小鼠胚胎下颌下腺解剖、腺...

本文介绍了一种利用病毒基因转移技术，在整体ex vivo培养的胚胎小鼠下颌下腺（SMG）中对上皮细胞进行遗传操作的方法。该方法利用了SMG上皮和间充质在分离后能够自发重组的内在特性，以及腺病毒载体感染上皮原基的能力。

分支形态发生在多种器官的发育过程中发生，胚胎小鼠下颌下腺（SMG）是研究这一过程的经典模型……

本实验的总体目标是利用腺病毒载体改变小鼠胚胎下颌下唾液腺上皮中特定蛋白的表达水平。该目标通过在胚胎第13天获取胚胎并分离下颌下唾液腺来实现。随后，将上皮原基从周围的间充质组织中分离，并浸入含有病毒的培养液中。洗涤原基后的培养基被置于含有Matrigel的培养基中孵育，我们结合三种间充质进行体外培养，可通过免疫化学染色、标准显微镜观察或Western印迹分析来检测目标蛋白水平的变化及其对分支形态发生的影响。该技术使我们能够在复杂器官中仅对一个组织区室进行遗传修饰，并在不构建转基因生物的情况下，监测重组完整器官外植体中的变化。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够实现在上皮区室中表达野生型或显性负性蛋白。按照标准操作流程，首先将13个胚胎收集到含有25毫升培养基的10厘米培养皿中。接下来，在体视显微镜下使用镊子将胚胎从卵膜中取出，并转移至另一个含有25毫升含青链霉素的D-M-E-M-F 12培养基的10厘米培养皿中，在透射光底座上操作，将胚胎置于一块洁净的玻璃表面。然后，在下颌或下颌骨下方稍作斜向切割，分离胚胎头部，并在上颌下方进行切割以分离下颌骨。然后将下颌骨转移至含有青霉素-链霉素的3毫升D-M-E-M-F 12培养基中，置于35毫米的组织培养皿内。现在取一个下颌骨放回载物台上的玻璃板，调整其位置，使舌部接触玻璃表面，并朝向12点钟方向。使用两把交叉镊子的一侧，以剪切动作去除并弃去下颌骨的下三分之一部分。接着，将下颌向惯用手方向旋转90度，以剪切动作切断下颌的上部。然后剥离多余的组织，暴露出组织下方的下颌下腺。在舌根两侧各有一个下颌下腺。使用一对镊子压住舌旁的组织，另一对镊子将下颌下腺（SMG）从舌部轻轻分离。此时，较大的下颌下腺及其相邻的舌下腺可连同周围间充质完整地进行培养。否则，请继续下一节操作。首先，将至少五个唾液腺样本放入含有 200 微升 HBSS 加 Diss Paste 的玻璃底 50 毫米微孔培养皿中。在 37 摄氏度下孵育腺体 15 分钟。然后使用 200 微升移液器吸头，小心地吸出 Diss Paste 溶液，注意不要扰动腺体。加入 200 µL 含 BSA 的 D-M-E-M-F 12 培养基以中和 dispase。使用一对尖端精细的 5 号镊子，轻轻将已松动的间充质组织与舌下腺从下颌下腺较大的上皮芽和导管中分离。注意尽量保持上皮组织完整。接下来，选择一支高质量的 200 µL 吸头，其尖端边缘光滑，并预先在含 BSA 的 D-M-E-M-F 12 培养基中润洗。然后，用移液器轻柔地将去除间充质的上皮始基转移至一个新的直径为50毫米的微孔培养皿中，该培养皿内含有200微升D-M-E-M-F 12培养基（含青霉素-链霉素）。最后，在含有间充质组织块的培养皿中，弃去所有非间充质组织，包括舌下腺以及任何脱离的下颌下腺芽状结构。将剩余的间充质

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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