用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

本方案通过基因修饰T细胞，引入针对肿瘤抗原的嵌合抗原受体，随后在设计的合成人工抗原呈递细胞上扩增出具有临床意义数量的T细胞。首先进行“睡美人”转座系统的电转染，将转座酶和转座子A的DNA质粒导入从外周血或脐带血中分离得到的静息单个核细胞中。

然后使用流式细胞术检测转染效率。接下来，在为期四周的刺激过程中，将转染的T细胞与K562来源的人工抗原呈递细胞共培养七天，并添加外源性细胞因子。经过多轮增殖后，分析、冻存并释放电穿孔后扩增的CAR阳性T细胞，用于人体应用。

睡美人转座子系统为将目的基因稳定导入目标细胞提供了一种替代病毒介导基因转移的方法。睡美人系统的主要优势之一在于，与通过非同源末端连接重组整合的DNA质粒相比，该系统能够以显著降低的成本实现基因整合。因此，睡美人系统的优点在于能够以低成本、高效率实现基因表达。

通常，初次接触该方法的研究人员最初需要克服在人工抗原呈递细胞上电转 T 细胞以选择性扩增 car 阳性 T 细胞的效率问题。这两个步骤均具有较高的技术难度，原因在于需要在人工抗原呈递细胞上对基因修饰的 T 细胞进行共培养。

该方法在过继性免疫治疗领域具有重要应用价值，尤其适用于高效基因递送以及临床所需数量的T细胞的制备。其更广泛的应用延伸至癌症治疗，因为可对免疫系统中的T细胞进行改造，使其具有肿瘤特异性。本实验操作将由Margaret Dawson和Matthew Fiola进行演示。

本实验室的技术人员首先将外周血用等体积的PBS-EDTA稀释，将脐带血用四倍体积的PBS-EDTA稀释，然后缓慢地将25毫升稀释后的血液叠加到50毫升离心管中12毫升Ficoll液面上。将Ficoll密度梯度液在400 × g条件下离心30至40分钟，不启用刹车。随后，将单个核细胞层转移至另一只含有PBS-EDTA的新鲜50毫升离心管中。

加体积至50毫升，通过离心收集细胞。用50毫升完全培养基轻柔洗涤细胞一次，然后在400 ×g 下离心10分钟。随后将细胞沉淀合并至CCM中，进行细胞计数。

采用台盼蓝排斥法。单个核细胞现在可用于电穿孔，或冻存以备将来使用。若使用冻存的单个核细胞，需快速解冻用于全规模电穿孔的两份各10⁸个细胞，并轻柔地将细胞转移至含有预热液的适当大小离心管中。

使用完全不含酚的RPMI培养基重悬细胞，通过离心收集细胞，将单个核细胞重悬于P-F-R-P-M-I中，进行细胞计数，并以每毫升10的6次方个细胞的浓度将细胞转移至适当大小的细胞培养容器中。在加湿的培养箱中平衡细胞2小时。通过离心收集单个核细胞（MNC），然后轻轻重悬并合并细胞沉淀于P-F-R-P-M-I中，对细胞进行计数。现在将2×10的8次方个MNC转移至无菌的50毫升离心管中，在200 ×g条件下离心10分钟，离心过程中不设刹车。

吸除上清液，确保细胞沉淀周围无残留培养基。准备一个无菌的12孔板，其中10个孔各加入4毫升预热的P-F-R-P-M-I培养基，并将该板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中平衡。然后，根据人T细胞试剂盒制造商的说明，为每个反应重新配制Lonzo Nucleo效应溶液。

Q Vet 准备 100 微升 DNA 预混液，其中包含添加了补充剂的 NU 核效应溶液、15 微克转座子质粒和 5 微克转座酶质粒。接下来，分散 T 细胞沉淀，并将 NU 核效应溶液 DNA 预混液重悬，最终细胞浓度为每 100 微升含 2 × 10⁷ 个细胞。

小心地将100 µL细胞悬液转移至10个Lonza核转染小杯中，注意避免产生气泡。轻弹小杯一次，然后使用程序U 0 1 4对未刺激的T细胞进行电穿孔。使用细尖移液器将小杯和平衡好的12孔板转移至培养罩内，并用500 µL预热的培养基从对应孔中分别加入每个小杯。

将电穿孔后的细胞转移至培养板中，在细胞培养孵育箱中恢复培养两小时。随后将所有孔中的细胞转移至无菌离心管中，经一次洗涤后离心收集细胞，轻轻重悬细胞沉淀，并用CCM重悬以获得单细胞悬液。进行细胞计数后，用CCM调整细胞浓度至每毫升含10⁶个细胞。

然后将细胞悬液转移至培养瓶中，放入培养箱过夜，以获得EGFP转染的细胞。使用每管六分之五个细胞，加入五微克氨苄对照EGFP质粒，重复电穿孔实验。收集电穿孔后的细胞，随后采用台盼蓝排斥法进行细胞计数。

然后使用针对CD3、CD4、CD8以及人IgG Fcγ的特异性抗体，对六分之一个到两个细胞进行一至两次染色，以检测CAR的表达水平。在流式细胞仪上获取细胞数据。使用FCS Express软件分析数据，以确定CAR的表达情况。

然后计算培养物中CAR阳性细胞的数量。A APC克隆4号来源于K562细胞，可共表达所需的T细胞共刺激分子。将一份冻存的经照射的A APC在37°C水浴中解冻，随后用CCM洗涤细胞，通过台盼蓝排斥法计数活细胞，并计算刺激所需的活A APC数量。

将表达CAR的电穿孔细胞与经γ射线照射的A APC在无菌容器中按1:2的比例混合。根据电穿孔后第二天的流式细胞术结果，调整A APC的比例以匹配CAR的表达水平。向细胞悬液中加入30 纳克/毫升的IL-21。然后将六百万个细胞/毫升接种至T75培养瓶或Vuelife培养袋中，并放回培养箱。在经γ射线照射的细胞上进行DNA质粒的电转及T细胞的扩增培养。

一种A A PC可用于从外周血和脐带血中生成数量充足且具有临床应用前景的T细胞，以用于人类治疗。在此项研究中，对外周血来源的基因修饰T细胞进行表征：在首次刺激周期的第0天，通过检测EGFP的表达来评估基因转导效率；在电穿孔后约24小时，利用流式细胞术检测CD3阳性、CD8阳性及CD4阳性T细胞中CD19特异性嵌合抗原受体（CAR）的表达情况；随后，在A A PC上共培养28天后，分析在功能封闭系统中培养的T细胞上CAR表达的动力学变化。

随时间推移，扩增外周血来源的CAR阳性T细胞可获得具有临床应用价值数量的T细胞，且CAR表达稳定。在AA PC上共培养四周后，CD3阳性T细胞的平均扩增倍数约为19,800倍，CAR表达率可达90%。观看本视频后，您应能够充分掌握如何电转并扩增表达特定CAR的T细胞。

请注意监测自然杀伤细胞的过度生长。T细胞的电穿孔和扩增通常经过四个为期七天的刺激周期完成。在过继性免疫治疗领域，可进一步开展细胞因子释放和细胞毒性检测等研究，以评估基因修饰T细胞的重定向特异性。

该技术有助于我们理解输注到人体内的T细胞的治疗潜力。