Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

该方案对 T 细胞进行基因修饰，以引入对肿瘤抗原具有特异性的嵌合抗原受体，然后在设计者人工抗原呈递细胞上传播具有临床意义的数字。从睡美人的电转移开始。将 A DNA 质粒转座并转座到从外周或脐带血中分离的静止单核细胞中。

然后使用流式细胞术测量转染效率。接下来共培养，转染的 T 细胞在 K 5 62 上 7 天内衍生的人工抗原呈递细胞，在 4 周刺激中加入外源细胞因子。增殖循环继续分析冻存并释放电穿孔和繁殖的 CAR 阳性 T 细胞以供人类应用。

睡美人转座对转座系统提供了一种基于病毒的基因转移方法的替代方案，可将基因稳定地引入所选细胞。睡美人系统的主要优点之一是，与通过非法非同源重组整合的 DNA 质粒相比，人们可以以更低的成本整合基因。因此，优点是睡美人系统可用于低成本、高效率地表达基因。

通常，刚接触这种方法的个体最初必须克服电 T 细胞在人工抗原呈递细胞上选择性增殖 car 阳性 T 细胞的效率。由于需要共同培养，这两个步骤都很难掌握。人工抗原呈递细胞上的转基因 T 细胞。

该方法在过继免疫治疗领域很有用，特别是在有效的基因递送和临床显着数量的 T 细胞的制造方面。更广泛的应用延伸到癌症治疗，因为来自免疫系统的 T 细胞可以被修饰为具有肿瘤特异性。演示该程序的是 Margaret Dawson 和 Matthew Fiola。

我实验室的技术人员首先用等体积的 P-B-S-E-D-T-A 稀释外周血，用四体积的 P-B-S-E-D-T-A 稀释脐带血，在 50 毫升离心管中将 25 毫升稀释的血液缓慢地铺在 12 毫升的 fial 上。将梯度样品以 400 Gs 离心 30 至 40 分钟，不得间断。现在将单核细胞组分转移到含有 P-B-S-E-D-T-A 的新鲜 50 毫升离心管中。

将体积增加到 50 毫升，并通过离心收获细胞。在 50 mL 完全培养物、培养基中轻轻洗涤细胞一次，并以 400 Gs 离心 10 分钟。然后将细胞沉淀在 CCM 中进行细胞计数。

使用 triam 蓝色排除方法。单核细胞现在可用于电穿孔或冷冻保存以备将来使用。如果使用冻存的 MNC，将第 8 个细胞快速解冻 2 次 10 倍以进行全尺寸电穿孔，将细胞轻轻转移到含有预热的适当大小的离心管中。

完成不含酚的 RPMI 培养基并通过离心沉淀细胞，重悬单核细胞在 P-F-R-P-M-I 中进行细胞计数，并将细胞转移到适当大小的细胞培养容器中，浓度为每毫升 6 个细胞中的 10 个。在加湿培养箱中平衡细胞 2 小时。通过离心收获 MNC，然后轻轻重悬并混合细胞沉淀在 P-F-R-P-M-I 中并计数细胞现在将第 8 个 MNC 转移两次 10 次到无菌 50 毫升离心管中，并以 200 Gs 离心 10 分钟，不间断。

吸出上清液，使细胞沉淀周围没有残留培养基。准备一个无菌的 12 孔板，其中有 10 个孔，含有 4 毫升温热的 P-F-R-P-M-I，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中平衡板。然后根据制造商对每个反应的说明，从人 T 细胞试剂盒中重构 Lonzo Nucleo 效应子溶液。

Q Vet 制备 100 μL DNA 预混液，其中含有补充的 NU 核效应子溶液。质粒上 15 μg 转座和 5 μg 转座质粒。接下来，分散 T 细胞沉淀，并以每 100 微升第七个细胞的 2 倍/100 微升的最终细胞浓度重悬 NU 核影响溶液 DNA 预混液。

小心地将 100 微升细胞悬液转移到 10 个 lonza nucleo 情感比色皿中的每一个比色皿中，小心避免气泡。现在轻敲 qve 一次，并使用程序 U 0 1 4 对未刺激的 T 细胞进行电击。使用 amox 细尖转移移液管将 500 微升预热培养基从相应的孔转移到每个 vete 的 500 微升预热培养基中，将比色皿和平衡 12 孔板转移到培养罩中。

将电穿孔的细胞转移到板中，让细胞在细胞培养箱中恢复 2 小时。然后将细胞从所有孔转移到无菌离心管中，洗涤一次后使细胞沉淀，轻轻分散细胞沉淀并在 CCM 中悬浮，以获得单细胞悬液。进行细胞计数后，调整细胞浓度以趋向于 CCM 中的每毫升 6 个细胞。

然后将细胞悬液转移到培养瓶中，并置于培养箱中过夜，以生成 EGFP 转染的细胞。使用 5 μg amox 对照 EGFP 质粒，使用每个 vete 的 6 个细胞的 5 乘以 10 重复电穿孔方案。收获电穿孔细胞，然后使用 trien 蓝色排除方法进行细胞计数。

然后用对 CD 3、CD 4、CD 8 和人 IgG FC γ 具有特异性的抗体对 6 个细胞中的 1 到 2 乘以 10 进行染色，作为 car 表达的测量。以传真口径采集细胞。使用 FCS express 软件分析数据以确定 CAR 的表达。

然后计算培养物中的 car 阳性细胞。A PC 克隆编号 4 将来源于 K 5 62 细胞，共表达所需的 T 细胞共刺激分子在 37 摄氏度的水浴中解冻等分试样的冷冻辐照 A PC。然后洗涤细胞和 CCM，通过跳闸蓝色排除计数活细胞，并计算刺激所需的活细胞 A A PC 的数量。

将表达 car 的电穿孔细胞和伽马射线辐照的 A A PC 在无菌容器中以 1 比 2 的比例混合。电穿孔后第二天，根据流式细胞术调整 CAR 表达的 A PC 比率 向细胞悬液中加入每毫升 30 纳克 IL 21。然后，Eloqua 将每毫升 6 个细胞放在 T 75 培养瓶中或观察活体培养袋中，然后返回培养箱，对 DNA 质粒进行电转移和 T 细胞在 γ 上的增殖。

可用于从外周血和脐带血中生成具有临床吸引力的 T 细胞数量，用于人类应用。在这种来自外周血的转基因 T 细胞的表征中，在第一次刺激周期的第 0 天，通过流式细胞术在 CD 3 阳性、CD 8 阳性和 CD 4 阳性 T 细胞上评估 CD 19 特异性 CAR 基因转移表达效率的控制电穿孔后约 24 小时。然后在 A PC 上共培养 28 天后，在功能封闭系统中生长的 T 细胞上 car 表达的动力学。

外周血来源的 car 阳性 T 细胞随着时间的推移而增殖，可以产生临床上吸引人的 T 细胞数量，这些 T 细胞稳定地表达 CAR。在 A A PC 上共培养 4 周后，CD 三个阳性 T 细胞的平均倍数扩增约为 19， 800 倍，CAR 表达为 90%。看完这个视频，你应该对如何选择表达所需汽车的游行和增殖 T 细胞有很好的了解。

请记住监测 NK 细胞的过度生长。T 细胞的电穿孔和增殖通常在四个 7 天的刺激周期内完成。可以进行进一步的研究，例如细胞因子释放和细胞毒性测定，以评估转基因 T 细胞的重定向特异性在过继免疫治疗领域。

这项技术有助于我们了解注入人体的 T 细胞的治疗潜力。