Name: 临床应用睡美人 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解利用睡美人转座子系统对T细胞进行基因修饰以表达CD19特异性嵌合抗原受体的方法，用于B细胞恶性肿瘤的免疫治疗。该技术通过电穿孔实现高效基因转移，并在人工抗原呈递细胞上进行选择性扩增。

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作者感谢宾夕法尼亚大学的 Carl June 博士在生成和提供 aAPC 克隆 #4 方面提供的帮助，以及明尼苏达大学的 Perry Hackett 博士在 SB 系统方面提供的帮助。
基金支持：癌症中心核心资助（CA16672）；RO1（CA120956，CA124782，CA141303）；R33（CA116127）；P01（CA148600）；SPORE（CA136411）；Albert J Ward基金会；Burroughs Wellcome基金；Gillson Longenbaugh基金会；德克萨斯州癌症预防与研究所；CLL全球研究基金会；美国国防部；Noelan L. Bibler遗产；Harry T. Mangurian, Jr. 白血病免疫治疗基金；个性化癌症治疗研究所；白血病与淋巴瘤学会；淋巴瘤研究基金会；MDACC姊妹机构网络基金；Miller基金会；Herb Simons先生；Joe H. Scales先生及夫人；Thomas Scott先生；国家癌症研究基金会；儿科癌症研究基金会；细胞治疗生产援助项目（PACT）；William Lawrence与Blanche Hughes儿童基金会。

第0天或之前
1. 从外周血和脐带血中分离单个核细胞（MNC）
<ol>
 <li>用等体积的PBS-EDTA稀释PB，用四倍体积的PBS-EDTA稀释UCB。</li>
 <li>将稀释后的血液（25 ml）缓慢铺加到50 ml离心管中的Ficoll（12 ml）上，以400 × g离心30–40分钟（不使用刹车）。</li>
 <li>使用移液管收集并转移单个核细胞层（界面层）至新的50 ml离心管中。</li>
 <li>用PBS-EDTA补总体积至50 ml，以450 × g离心10分钟。</li>
 <li>吸除上清液，轻轻将细胞沉淀重悬于50 ml完全培养基（CCM）中，再以400 × g离心10分钟。</li>
 <li>轻轻重悬细胞沉淀，并合并至CCM中，使用台盼蓝排斥法进行细胞计数（Cellometer，PBMC程序）。</li>
 <li>此时单个核细胞可用于电穿孔（Nucleofection）或冻存以备后续使用。</li>
</ol>
第0天用于电穿孔的T细胞制备
<ol>
 <li>若使用冻存的单个核细胞（MNC），请在37 °C水浴中快速解冻足够用于全规模电穿孔的细胞量（2 × 108，额外增加约20%以补偿离心和2小时孵育过程中的细胞损失）。若使用新鲜分离的MNC，则直接进行步骤2.3。</li>
 <li>轻柔重悬细胞，并转移至适当大小的离心管中，加入预热的无酚完全RPMI培养基（PF-RPMI），在200 × g条件下离心10分钟（不启用刹车），吸除上清液。</li>
 <li>用PF-RPMI重悬MNC，进行细胞计数（Cellometer），并将细胞以106 个细胞/mL的浓度转移至适当大小的细胞培养容器中。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育2小时±30分钟。</li>
 <li>将MNC转移至无菌离心管中，在200 × g条件下离心5分钟（不启用刹车），吸除上清液，轻柔重悬并合并细胞沉淀于PF-RPMI中。</li>
 <li>进行细胞计数（Cellometer），计算所需细胞悬液的体积（2 × 108 MNC）。</li>
 <li>将计算好的体积转移至无菌50 mL离心管中，在200 × g条件下离心10分钟（不启用刹车）。</li>
 <li>吸除上清液，确保无残留培养基，通过轻敲管壁的方式轻柔重悬细胞。</li>
</ol>
3. 第0天对单个核细胞（MNC）进行电穿孔（核转染）（使用10个比色皿的完整流程）
<ol>
 <li>在湿润的 37 °C/5% CO2 培养箱中，预先将无菌的 12 孔板（含 10 个孔，每孔加入 4 ml 温热的 PF-RPMI）进行预孵育。</li>
 <li>在生物安全柜（BSC）中，将 Lonza Nucleofector 人 T 细胞试剂盒溶液（按制造商说明重悬，<a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a>）恢复至室温。</li>
 <li>制备 Nucleofector 溶液/DNA 主混合液：每个反应/电转杯中加入 100 μl 添加物的 Nucleofector 溶液、15 μg 转座子（指定为 CD19RCD28/pSBSO 的超螺旋 DNA 质粒）和 5 μg 转座酶（指定为 pCMV-SB11 的超螺旋 DNA 质粒）。</li>
 <li>轻轻敲击离心管侧壁使细胞沉淀（来自步骤 2.8）充分分散，并重悬于 Nucleofection 溶液/DNA 主混合液中（最终细胞浓度：2 × 107 个细胞/100 μl）。</li>
 <li>小心将 100 μl 细胞悬液（来自步骤 3.4）转移至十个（10）Lonza Nucleofection 电转杯中，注意避免产生气泡。</li>
 <li>轻敲电转杯一次，使用程序 U-014（适用于未刺激的 T 细胞）进行电穿孔。</li>
 <li>将电转杯和 12 孔板（步骤 3.1）转移至生物安全柜（BSC）中。</li>
 <li>使用 Amaxa 细尖转移移液器，从每个电转杯中收集电穿孔后的细胞：加入约 500 μl 来自对应孔（步骤 3.1 准备的 12 孔板）的预温培养基，然后将 12 孔板放回湿润的 37 °C/5% CO2 培养箱中孵育 2 小时 ± 30 分钟。</li>
 <li>孵育 2 小时后，收集并转移所有孔中的细胞至无菌离心管中。</li>
 <li>在室温下以 140 × g 离心 8 分钟（不启用刹车），洗涤细胞，吸除并弃去上清液，确保细胞沉淀上无残留培养基。</li>
 <li>轻轻敲击离心管侧壁使细胞沉淀分散，并轻柔重悬于 CCM 中，以获得单细胞悬液。</li>
 <li>进行细胞计数，并用 CCM 调整细胞浓度至 106 个细胞/ml。</li>
 <li>将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，并置于培养箱中过夜培养。</li>
 <li>对对照组（EGFP 转染细胞）重复执行步骤 2.1 至 3.8：每电转杯使用 5 × 106 个细胞和 5 μg Amaxa 对照 EGFP 超螺旋质粒（pmaxGFP）。</li>
</ol>
第1天（共1天）st 及后续刺激周期
第1天通过流式细胞术分析CAR表达
<ol>
 <li>收集电穿孔后的细胞，使用台盼蓝排斥法（血细胞计数板）进行细胞计数。</li>
 <li>用针对 CD3、CD4、CD8 和人 IgG Fcγ 的特异性抗体对细胞（1 至 2 × 106）进行染色（用于检测 CAR 表达水平）。</li>
 <li>在 FACS Calibur 仪器上获取细胞，并使用 FCS Express 软件分析数据以计算 CAR 表达量。
 <ol>
 <li>通过以下公式计算培养物中 CAR+ 细胞数量： 
 （总活细胞数）×（CAR+ 细胞百分比）= CAR+ 细胞数</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
第1天aAPC（克隆#4）的制备。aAPC（克隆#4）由K562细胞（亲本细胞系购自美国模式培养物集存库）衍生而来，用于共表达所需T细胞共刺激分子
<ol>
 <li>在37 °C水浴中解冻一份冷冻的100 Gy辐照aAPC等分试样。</li>
 <li>将细胞在CCM中以400 × g离心10分钟，洗涤两次，并使用Cellometer（台盼蓝排斥法）进行计数。</li>
 <li>计算刺激所需的活aAPC数量： 
 （CAR+细胞数）× 2 = 所需辐照aAPC数</li>
</ol>
6. aAPC介导的CAR刺激+ 第1天开始时的T细胞st 及后续刺激周期
<ol>
 <li>在无菌容器中，将电穿孔后的细胞（表达CAR）与γ射线照射的aAPC（克隆#4）按1:2的比例（CAR+细胞：活aAPC）在CCM中混合。
 <ol>
 <li>注意 aAPC的比例需根据电穿孔后第二天流式细胞术检测的CAR表达水平进行调整。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>向细胞悬液中加入IL-21（30 ng/ml）。</li>
 <li>以106个细胞/ml的浓度分装至T-75 cm2培养瓶和/或Vue Life Culture袋中，并放回培养箱。</li>
</ol>
第3天、第5天
7. CAR+ T 细胞的持续培养
<ol>
 <li>进行半量换液，补充IL-21，并将T细胞维持在106 个细胞/ml的浓度。</li>
</ol>
第7天
8. 第一轮人工抗原呈递细胞介导的刺激周期结束
<ol>
 <li>收集细胞，计数并进行 CD3、CD4、CD8 和 Fcγ（CAR）染色，然后进行步骤 10.1。</li>
</ol>
9. 耗竭 CD56+ 细胞（通常在电穿孔后 7 至 14 天之间）
<ol>
 <li>如果 CD56+CD3neg 淋巴细胞 ≥ 10%，则使用磁性微珠进行 CD56 耗竭。</li>
</ol>
刺激周期 #2、#3 和 #4 分别对应第 8 天 → 14 天、第 15 天 → 21 天以及第 22 天 → 28 天
10. 通过递归添加aAPC扩增T细胞至临床所需数量
<ol>
 <li>按照步骤 4.3-8.1 中所述，重复刺激过程（4 次）。</li>
 <li>从第 7、14 和 21 天开始，在每次更换培养基时（每周三次，按周一-周三-周五的时间表）向培养物中添加 IL-2（50 U/ml）。</li>
 <li>根据需要冷冻保存（存档）多余的 T 细胞。
 <ol>
 <li>使用程序降温仪冷冻 T 细胞。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
第28天
11. 最后一轮aAPC介导的刺激周期结束：收获T细胞
<ol>
 <li>对T细胞进行冷冻保存，用于放行检测和输注。</li>
</ol>

<ol><li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

转座子与转座酶系统，例如 piggyBac12,19 和 SB18,20-22，是基因治疗的非病毒方法，可作为临床级CAR的病毒介导转导的替代方案+ T细胞。选择睡美人（SB）作为基因转移系统，是基于其在人类基因治疗中的潜在应用价值。1,6,23我们开发了SB转座（用于导入CAR）与递归添加γ射线照射的aAPC（用于回收稳定表达CAR的基因修饰T细胞）两项双重技术，作为符合cGMP标准的I/II期临床试验中制备肿瘤相关抗原特异性T细胞的平台技术。图4。经过28天（四个7天刺激周期）在γ射线照射的aAPC上共培养后，我们通常能够获得至少约1010 适用于人类应用的基因修饰T细胞。根据需要，可进行额外的刺激循环，以产生更大量的基因修饰T细胞。此外，如果CAR较少+ T细胞是必需的，可通过减少电穿孔所用比色皿数量，并在每轮刺激周期开始时仅将扩增后T细胞中的一部分继续在活化人工抗原呈递细胞（aAPC）上进行后续增殖，从而缩小电穿孔与扩增的操作规模。收获用于输注的大多数经电穿孔和扩增的T细胞可稳定表达CAR。CD4的扩增+ 和 CD8+ 表达我们2的T细胞nd 生成的CAR包括具有记忆/初始表型的细胞，并表现出重定向特异性的三个特征。首先，经基因修饰的T细胞可特异性裂解CD19+ 靶点，其次，在响应CD19时产生IFN-γ+ 刺激细胞，第三，响应 CD19 发生增殖+ 饲养细胞，均以CAR依赖性方式13,18通过SB系统以非病毒质粒DNA电转的方式将CAR转基因整合，可在来自外周血和脐带血的静息态原代T细胞中实现。我们及其他研究者已对K562细胞进行遗传改造，使其作为人工抗原呈递细胞（aAPC），以高效扩增出满足临床输注需求数量的T细胞。24,25. 人工抗原呈递细胞及组织培养环境（例如 IL-21的添加）已进行修改，以生成患者和供体来源的CD19特异性T细胞，用于造血干细胞移植后的输注表1)13,18我们可以通过静脉穿刺获取的外周血（PB）直接制备CAR+ T细胞，从而避免了通过单采分离术获取外周血单个核细胞（MNC）所带来的成本、不适和不便。该方法能够大量制备CAR+ 来自少量单个核细胞的T细胞特别适用于异基因脐带血移植后输注T细胞。由于新生儿供者体积小且信息匿名，无法在后续时间点再次获取该个体的样本，且可用于T细胞制备的收获单个核细胞数量有限，以避免干扰造血功能。目前正在进行生产工艺的进一步优化，包括引入高通量电穿孔装置，并结合完全封闭式的WAVE生物反应器，以最大限度减少人工操作。总体而言，SB系统与人工抗原呈递细胞（aAPC）是生成靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的有吸引力的技术平台+ 能够适应并大规模生成经基因修饰的T细胞，以识别其他细胞表面肿瘤相关抗原，且符合cGMP规范。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>表达GFP的DNA质粒（pmaxGFP）</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002（试剂盒）</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS-EDTA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>70026</td><td></td></tr><tr><td>HyQ RPMI-1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>无酚红 RPMI-1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30605.01</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>3505-061</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-21</td><td>PeproTech</td><td>AF-200-21</td><td></td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-2（Proleukin）</td><td>诺华</td><td>NDC 65483-116-07</td><td></td></tr><tr><td>人T细胞试剂盒（核转染溶液）</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD56 试剂</td><td>Miltenyi</td><td>70206</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的鼠源mAb，特异性识别人CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>349201</td><td></td></tr><tr><td>与特异性识别人 CD4 的小鼠单克隆抗体偶联的 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340443</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 标记的鼠源抗人 CD8 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>341051</td><td></td></tr><tr><td>PE 偶联的 F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 山羊抗人 Fc 抗体片段&amp;#947;</td><td>Invitrogen</td><td>H10104</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;一次性用品&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>康宁</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 烧瓶</td><td>康宁</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>培养袋</td><td>Vue Life</td><td>290°C；750°C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Vision</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 离心机</td><td>Sorvall</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Calibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td></td></tr><tr><td>程序降温仪</td><td>平面仪</td><td>Kryo 750</td><td></td></tr><tr><td>辐照仪</td><td>CIS bio International</td><td>IBL-437 C#09433</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;4&quot;&gt;&lt;strong&gt;分子（内源性和外源性）的表达&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;通用名称&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;细胞类型&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;表达的分子&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19&lt;/td&gt; &lt;td&gt;克隆4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;K562&lt;/td&gt; &lt;td&gt;CD86、CD64、CD137L、CD19、GFP 与膜结合型 IL-15 共表达&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;完全培养基（CCM）&lt;/strong&gt; （4℃保存） &amp;deg;C，最长可达30天）&lt;br/&gt; HyQ RPMI-1640/无酚红RPMI-1640&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% GlutaMAX&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;流式细胞术缓冲液 &lt;/strong&gt;（4℃保存） &amp;deg;C，最长可达30天）&lt;br/&gt; PBS&lt;br/&gt; 2% FBS&lt;br/&gt; 0.1% 叠氮化钠&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

用于外周血和脐带血t细胞基因修饰的sleeping beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

通过将基因治疗与免疫治疗相结合，可改进临床级T细胞的效能，从而构建出一种具有更优生物学特性的生物制品，其潜力体现在：(i) 对肿瘤相关抗原（TAAs）的识别能力增强，(ii) 输注后在体内持久存续，(iii) 向肿瘤部位迁移的潜力提升，以及 (iv) 在肿瘤微环境中重复发挥效应功能的能力。目前大多数用于人类临床应用的T细胞基因改造方法，均采用逆转录病毒和慢病毒载体以实现嵌合抗原受体（CAR）的稳定表达。1-3此方法虽然符合现行药品生产质量管理规范（GMP），但由于依赖少数生产设施来制备和放行临床级重组病毒，成本较高。非病毒质粒的电转导作为一种替代转导的方案具有吸引力，因为DNA可在临床级生产中的成本约为前者的十分之一th 重组GMP级病毒的成本。为了提高整合效率，我们进行了改进 睡美人 用于人类应用的 (SB) 转座子与转座酶4-8我们的SB系统使用两种DNA质粒，其中一种转座子编码目的基因（例如 2nd 第二代CD19特异性CAR转基因（指定为CD19RCD28）和一种转座酶例如 SB11）可将外源基因插入TA双核苷酸重复序列中9-11为了获得满足临床需求数量的基因修饰T细胞，我们使用经改造以表达肿瘤相关抗原（TAA）的K562细胞系衍生的人工抗原呈递细胞（aAPC）（克隆#4）。例如 CD19，以及T细胞共刺激分子CD86、CD137L、膜结合型白细胞介素（IL）-15（与修饰的IgG4 Fc区融合的肽段）和CD64（Fc-γ受体1），用于负载单克隆抗体（mAb）12在本报告中，我们展示了在符合cGMP条件下生成靶向CD19的CAR的可执行操作步骤+ 适用于人体应用的T细胞。通过同步电转染两个DNA质粒——SB转座子（CD19RCD28）和SB转座酶（SB11），随后在可溶性重组人IL-2和IL-21存在条件下，每隔7天添加γ射线照射的aAPC（克隆#4）以刺激细胞，从而筛选获得稳定整合子13通常需要进行4个周期（连续培养28天），以获得具有临床应用前景数量的稳定表达CAR的T细胞。该制备临床级CD19特异性T细胞的方法可应用于外周血（PB）或脐带血（UCB）来源的T细胞。此外，通过将导入的CAR特异性与aAPC上由CAR识别的TAA表达相匹配，该策略还可用于生成针对多种肿瘤类型的T细胞。

我们报道，通过电转染DNA质粒并将T细胞在γ射线照射的aAPC上扩增，可生成适用于临床的人源外周血（PB）和脐带血（UCB）来源T细胞的数量。这些经基因修饰的T细胞表达导入的CAR，可识别与主要组织相容性复合体无关的肿瘤相关抗原CD19。用于表达（i）转座子的SB来源DNA质粒，一种2nd 第二代CAR（CD19RCD28），通过CD28和CD3-ε传递信号14，以及（ii）转座酶SB1115，此前已有描述13,16,17本研究中使用的质粒由Waisman临床生物制造中心（Madison, WI）商业生产。aAPC（克隆#4）源自K562细胞（亲本细胞系购自美国模式培养物集存库），共同表达所需T细胞共刺激分子（每种引入的分子均在 390%（如前所述，在aAPC细胞表面）12在此，我们展示了可通过SB转座技术将CAR导入来自外周血（PB）或脐带血（UCB）的单个核细胞（MNC），再添加人工抗原呈递细胞（aAPC），以CAR依赖的方式扩增CD19特异性T细胞图1、图4)13,18. 十个比色皿（2x107 每位受体使用 MNC/比色皿进行电穿孔处理 15 μg 编码转座子（CAR）的DNA质粒（CD19RCD28/pSBSO） 5 μg 编码转座酶（SB11）的DNA质粒（pCMV-SB11）。若单个核细胞（MNC）数量有限，或为适应实验室工作规模，可减少电穿孔所用比色皿的数量。电穿孔当天定义为刺激周期#1的“第0天”。作为流式细胞术和培养条件的对照，自体T细胞进行模拟电穿孔处理（不加DNA质粒），并在预先负载OKT3抗体以交联CD3、从而维持T细胞增殖的γ射线照射过的aAPC（克隆#4）上进行数量扩增。我们通常在电穿孔后的第二天评估电转效率及T细胞的存活率。图2B）。对照DNA质粒（命名为pmaxGFP）和CAR在该初始时间点的EGFP表达反映了整合型和游离型质粒的蛋白表达。通常，电穿孔后第二天，EGFP表达率约为60%，CAR表达率约为40%（图2A) T细胞存活率为40-50%。在存在可溶性重组人IL-2和IL-21的条件下，反复添加γ射线照射的aAPC，可获得稳定表达CAR（CD19RCD28）的T细胞。CD3阴性CD56+ 若培养物中NK细胞比例≥10%，尤其是T细胞上CAR表达比例较低时，应使用特异性针对CD56的顺磁性微珠去除NK细胞。该步骤可防止NK细胞快速过度生长，从而避免其干扰aAPC维持CAR T细胞增殖的能力。+ T细胞。偶尔，从CAR中耗竭NK细胞+ 在最后两个刺激周期中进行T细胞操作，但由于部分CAR细胞共表达CD56，会导致目标细胞的损失+ T细胞。在共培养的第14天之后，T细胞在功能封闭系统中使用Vue Life培养袋进行培养。通常在共培养的第14天或第21天（即第二轮或第三轮刺激周期结束时），将一部分经基因修饰并扩增的T细胞冷冻保存，作为未来分析的存档材料，并在后续生产工艺中出现意外问题时用于复苏。T细胞通常在培养第28天左右收获。图3）中常规表达 &gt;90% CAR 且为 &gt;80% 存活率（图2C，D). 我们先前已证明，在aAPC上共培养四周后，CD3+ T细胞的平均扩增倍数为19,800±11,313（携带CAR）+ 表达率为 90%±7.5 13这些T细胞经过冷冻保存，并接受生产过程中的检测和放行检测，以评估所制备产品的安全性和治疗潜力。放行检测依照临床实验室改进修正案（CLIA）的要求进行，以在临床试验受试者回输前出具分析证书。
<img alt="CAR T细胞制备流程图；CD3/CD28转座子激活，细胞因子添加。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 从外周血（PB）和脐带血（UCB）中电穿孔并扩增CAR+ T细胞的步骤示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="流式细胞术分析图；GFP、FSC-H 图谱；CAR 表达数据图，CD3、CD4、CD8 结果。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 外周血来源基因修饰 T 细胞的表征。(A) 首次刺激周期第 0 天 EGFP 的表达，用于评估基因转导效率。(B) 电穿孔后约 24 小时及 (C) 在 aAPC 上共培养 28 天后，通过流式细胞术检测 CD3+、CD8+ 和 CD4+ T 细胞中 CD19 特异性 CAR（CD19RCD28）的表达。在脐带血来源的 T 细胞中也观察到类似的 CAR 表达。(D) CAR 表达的动力学变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="细胞生长曲线；推断的细胞数量与共培养天数的关系；CD3、CAR刺激分析。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 外周血来源的CAR+ T细胞的扩增。 外周血来源的CD3+ 和CAR+ T细胞在γ射线照射的aAPC存在下，联合重组人源可溶性IL-2和IL-21反复共培养后的数量扩增速率。向上的箭头表示添加γ射线照射的aAPC，标志着每一轮刺激周期的开始。脐带血来源的CAR+ T细胞表现出类似的扩增速率。
<img alt="CAR T细胞制备示意图：电穿孔、K562共培养、冷冻保存、输注过程。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 图4. 使用SB系统和aAPC系统对来自外周血（PB）和脐带血（UCB）的CAR+ T细胞进行基因修饰与扩增的制备流程示意图。 通过电转将SB来源的超螺旋DNA质粒导入T细胞，并在重组人可溶性IL-2和IL-21存在条件下，与K562来源的aAPC（克隆#4）进行后续共培养，从而生成靶向CD19的CAR+ T细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>T细胞来源</td>
 <td>转座子*</td>
 <td>转座酶</td>
 <td>T细胞输注</td>
 <td>IRB #</td>
 <td>NIH-OBA #</td>
 <td>IND #</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>自体（患者来源）**</td>
 <td>CD19RCD28</td>
 <td>SB11</td>
 <td>自体造血干细胞移植后</td>
 <td>2007-0635</td>
 <td>0804-922</td>
 <td>14193</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>同种异体（供者来源）</td>
 <td>CD19RCD28</td>
 <td>SB11</td>
 <td>同种异体造血干细胞移植后</td>
 <td>2009-0525</td>
 <td>0910-1003</td>
 <td>14577</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>同种异体（供者来源）</td>
 <td>CD19RCD28</td>
 <td>SB11</td>
 <td>同种异体脐带血移植后</td>
 <td>2010-0835</td>
 <td>1001-1022</td>
 <td>14739</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 在美国食品药品监督管理局（FDA）的监管下，于MDACC开展的临床试验中输注在aAPC上扩增的CD19特异性CAR+ T细胞。 *T细胞通过强制表达编码靶向CD19的SB转座子而获得特异性nd 第二代CAR，命名为CD19RCD28，通过CD28和CD3-ζ传导信号。**试验详见参考文献#7

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping Beauty（SB）系统对T细胞进行遗传修饰，以导入靶向CD19的CAR，并在设计的CD19阳性人工抗原呈递细胞上实现选择性扩增。

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

通过将基因治疗与免疫治疗相结合，可改造出一种具有增强潜力的生物制品，从而提升临床级T细胞的效能。

本方案通过基因修饰T细胞，引入针对肿瘤抗原的嵌合抗原受体，随后在设计的合成人工抗原呈递细胞上扩增出具有临床意义数量的T细胞。首先进行“睡美人”转座系统的电转染，将转座酶和转座子A的DNA质粒导入从外周血或脐带血中分离得到的静息单个核细胞中。然后使用流式细胞术检测转染效率。接下来，在为期四周的刺激过程中，将转染的T细胞与K562来源的人工抗原呈递细胞共培养七天，并添加外源性细胞因子。经过多轮增殖后，分析、冻存并释放电穿孔后扩增的CAR阳性T细胞，用于人体应用。睡美人转座子系统为将目的基因稳定导入目标细胞提供了一种替代病毒介导基因转移的方法。睡美人系统的主要优势之一在于，与通过非同源末端连接重组整合的DNA质粒相比，该系统能够以显著降低的成本实现基因整合。因此，睡美人系统的优点在于能够以低成本、高效率实现基因表达。通常，初次接触该方法的研究人员最初需要克服在人工抗原呈递细胞上电转 T 细胞以选择性扩增 car 阳性 T 细胞的效率问题。这两个步骤均具有较高的技术难度，原因在于需要在人工抗原呈递细胞上对基因修饰的 T 细胞进行共培养。该方法在过继性免疫治疗领域具有重要应用价值，尤其适用于高效基因递送以及临床所需数量的T细胞的制备。其更广泛的应用延伸至癌症治疗，因为可对免疫系统中的T细胞进行改造，使其具有肿瘤特异性。本实验操作将由Margaret Dawson和Matthew Fiola进行演示。本实验室的技术人员首先将外周血用等体积的PBS-EDTA稀释，将脐带血用四倍体积的PBS-EDTA稀释，然后缓慢地将25毫升稀释后的血液叠加到50毫升离心管中12毫升Ficoll液面上。将Ficoll密度梯度液在400 × g条件下离心30至40分钟，不启用刹车。随后，将单个核细胞层转移至另一只含有PBS-EDTA的新鲜50毫升离心管中。加体积至50毫升，通过离心收集细胞。用50毫升完全培养基轻柔洗涤细胞一次，然后在400 ×g 下离心10分钟。随后将细胞沉淀合并至CCM中，进行细胞计数。采用台盼蓝排斥法。单个核细胞现在可用于电穿孔，或冻存以备将来使用。若使用冻存的单个核细胞，需快速解冻用于全规模电穿孔的两份各10⁸个细胞，并轻柔地将细胞转移至含有预热液的适当大小离心管中。使用完全不含酚的RPMI培养基重悬细胞，通过离心收集细胞，将单个核细胞重悬于P-F-R-P-M-I中，进行细胞计数，并以每毫升10的6次方个细胞的浓度将细胞转移至适当大小的细胞培养容器中。在加湿的培养箱中平衡细胞2小时。通过离心收集单个核细胞（MNC），然后轻轻重悬并合并细胞沉淀于P-F-R-P-M-I中，对细胞进行计数。现在将2×10的8次方个MNC转移至无菌的50毫升离心管中，在200 ×g条件下离心10分钟，离心过程中不设刹车。吸除上清液，确保细胞沉淀周围无残留培养基。准备一个无菌的12孔板，其中10个孔各加入4毫升预热的P-F-R-P-M-I培养基，并将该板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中平衡。然后，根据人T细胞试剂盒制造商的说明，为每个反应重新配制Lonzo Nucleo效应溶液。Q Vet 准备 100 微升 DNA 预混液，其中包含添加了补充剂的 NU 核效应溶液、15 微克转座子质粒和 5 微克转座酶质粒。接下来，分散 T 细胞沉淀，并将 NU 核效应溶液 DNA 预混液重悬，最终细胞浓度为每 100 微升含 2 × 10⁷ 个细胞。小心地将100 µL细胞悬液转移至10个Lonza核转染小杯中，注意避免产生气泡。轻弹小杯一次，然后使用程序U 0 1 4对未刺激的T细胞进行电穿孔。使用细尖移液器将小杯和平衡好的12孔板转移至培养罩内，并用500 µL预热的培养基从对应孔中分别加入每个小杯。将电穿孔后的细胞转移至培养板中，在细胞培养孵育箱中恢复培养两小时。随后将所有孔中的细胞转移至无菌离心管中，经一次洗涤后离心收集细胞，轻轻重悬细胞沉淀，并用CCM重悬以获得单细胞悬液。进行细胞计数后，用CCM调整细胞浓度至每毫升含10⁶个细胞。然后将细胞悬液转移至培养瓶中，放入培养箱过夜，以获得EGFP转染的细胞。使用每管六分之五个细胞，加入五微克氨苄对照EGFP质粒，重复电穿孔实验。收集电穿孔后的细胞，随后采用台盼蓝排斥法进行细胞计数。然后使用针对CD3、CD4、CD8以及人IgG Fcγ的特异性抗体，对六分之一个到两个细胞进行一至两次染色，以检测CAR的表达水平。在流式细胞仪上获取细胞数据。使用FCS Express软件分析数据，以确定CAR的表达情况。然后计算培养物中CAR阳性细胞的数量。A APC克隆4号来源于K562细胞，可共表达所需的T细胞共刺激分子。将一份冻存的经照射的A APC在37°C水浴中解冻，随后用CCM洗涤细胞，通过台盼蓝排斥法计数活细胞，并计算刺激所需的活A APC数量。将表达CAR的电穿孔细胞与经γ射线照射的A APC在无菌容器中按1:2的比例混合。根据电穿孔后第二天的流式细胞术结果，调整A APC的比例以匹配CAR的表达水平。向细胞悬液中加入30 纳克/毫升的IL-21。然后将六百万个细胞/毫升接种至T75培养瓶或Vuelife培养袋中，并放回培养箱。在经γ射线照射的细胞上进行DNA质粒的电转及T细胞的扩增培养。一种A A PC可用于从外周血和脐带血中生成数量充足且具有临床应用前景的T细胞，以用于人类治疗。在此项研究中，对外周血来源的基因修饰T细胞进行表征：在首次刺激周期的第0天，通过检测EGFP的表达来评估基因转导效率；在电穿孔后约24小时，利用流式细胞术检测CD3阳性、CD8阳性及CD4阳性T细胞中CD19特异性嵌合抗原受体（CAR）的表达情况；随后，在A A PC上共培养28天后，分析在功能封闭系统中培养的T细胞上CAR表达的动力学变化。随时间推移，扩增外周血来源的CAR阳性T细胞可获得具有临床应用价值数量的T细胞，且CAR表达稳定。在AA PC上共培养四周后，CD3阳性T细胞的平均扩增倍数约为19,800倍，CAR表达率可达90%。观看本视频后，您应能够充分掌握如何电转并扩增表达特定CAR的T细胞。请注意监测自然杀伤细胞的过度生长。T细胞的电穿孔和扩增通常经过四个为期七天的刺激周期完成。在过继性免疫治疗领域，可进一步开展细胞因子释放和细胞毒性检测等研究，以评估基因修饰T细胞的重定向特异性。该技术有助于我们理解输注到人体内的T细胞的治疗潜力。

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

临床应用<em&gt;睡美人</em和人工抗原呈递细胞基因修饰T细胞从外设和脐带血中

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

本文描述了首个符合药品生产质量管理规范（GMP）的从脐带血中制备病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，脐带血是主要含有初始T细胞的来源。...

扩增靶向巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的脐带血细胞毒性T淋巴细胞

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。...

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

由于抗原特异性T细胞频率极低，因此难以对其进行表征或用于治疗。本文中，我们提供了一种磁性微粒的制备方案，该微粒可结合抗原特异性T细胞，用于富集这些细胞，并将其扩增数百倍，从而用于后续的表征与治疗应用。...

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。...

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

了解利用睡美人转座子系统对T细胞进行基因修饰以表达CD19特异性嵌合抗原受体的方法，用于B细胞恶性肿瘤的免疫治疗。该技术通过电穿孔实现高效基因转移，并在人工抗原呈递细胞上进行选择性扩增。

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

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