Name: 制备肿瘤抗原负载成熟树突状细胞免疫治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习制备临床级树突状细胞用于肿瘤免疫治疗的方法，通过GM-CSF和IL-4诱导单核细胞分化，经TLR3激动剂poly ICLC成熟并负载抗原，最终获得可回输患者的高质量自体免疫细胞。

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作者谨此感谢 Andres Salazar（Oncovir, Inc.）惠赠 Poly-ICLC。

1. 外周血单个核细胞的分离与冷冻保存4
<ol>
	<li>使用血浆转移装置无菌穿刺白细胞分离袋的一个接入口。用60 ml注射器将从患者获得的白细胞分离产物转移至无菌的500 ml瓶中。</li>
	<li>用室温RPMI将白细胞分离产物的体积调整至其原始体积的2倍。充分混匀。</li>
	<li>轻轻混匀Ficoll-Paque PLUS瓶中的液体。向无菌50 ml离心管中加入12 ml Ficoll-Paque PLUS。</li>
	<li>将30 ml稀释后的白细胞分离产物轻轻叠加至每个含有Ficoll的无菌50 ml离心管中。注意不要扰动Ficoll与细胞悬液之间的界面。</li>
	<li>重复步骤1.3和1.4，直至所有白细胞分离产物均完成叠加。</li>
	<li>将50 ml离心管在室温下以1,000 × g离心20分钟，不使用刹车。</li>
	<li>小心收集每管中的浑浊PBMC层，并转移至新的无菌50 ml离心管中。</li>
	<li>向每管中加入RPMI，使最终体积达到50 ml。通过轻柔倒置混匀。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心10分钟，使用全刹车。</li>
	<li>移除每管中的上清液。将每管中的细胞沉淀重悬，并加入RPMI使最终体积为50 ml。通过轻柔倒置混匀。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心6分钟。</li>
	<li>移除每管中的上清液。将细胞悬液重悬后合并至一个50 ml离心管中。</li>
	<li>用更多RPMI将合并后的PBMC体积补至50 ml。通过轻柔倒置混匀。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心6分钟。</li>
	<li>移除上清液。将细胞沉淀重悬于50 ml RPMI中。轻柔混匀以确保细胞悬液均匀。</li>
	<li>计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心6分钟。准备冻存液。冻存液由10%二甲基亚砜（DMSO；Miltenyi Biotec）和人AB血清（Valley Biomedical）组成。</li>
	<li>移除上清液。将细胞重悬于预冷的冻存液中，终浓度为2 × 108 个细胞/ml。</li>
	<li>将1 ml分装至1.8 ml冻存管中。</li>
	<li>将冻存管转移至程序降温仪中，启动冻存程序1。程序结束后，立即将冻存管转移至液氮罐的气相中保存。</li>
</ol>
2. 第0天：从单核细胞分化树突状细胞
<ol>
	<li>向无菌的 50 ml 锥形管中加入 30 ml RPMI/1% 自体血浆。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中轻轻振荡，解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）分装样品。完全解冻后，将冻存管中的内容物转移至无菌的 50 ml 锥形管中，充分混匀。</li>
	<li>在室温下以 500 × g 离心 6 分钟。弃去上清液，将沉淀细胞重悬于少量 RPMI/1% 自体血浆中，随后补加 RPMI/1% 自体血浆至终体积为 50 ml，充分混匀。</li>
	<li>再次在室温下以 500 × g 离心 6 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 50 ml RPMI/1% 自体血浆中，充分混匀。</li>
	<li>计数细胞数量并测定细胞活力，计算活细胞总数。</li>
	<li>将 1.40 × 108 个细胞接种于 40 ml RPMI/1% 自体血浆中，加入 225 cm2 EasyFlask 培养瓶。重复此步骤，直至所有细胞接种完毕。</li>
	<li>将 EasyFlask 平放于组织培养孵箱中，在 37 °C、含 5% CO2 的条件下孵育 1–2 小时，使单核细胞贴壁。</li>
	<li>孵育结束后，从孵箱中取出 EasyFlask，用 30 ml 预热的 RPMI 洗涤两次，以去除未贴壁细胞。</li>
	<li>第二次洗涤后，加入 40 ml 含 400–1,000 IU/ml IL-4 和 100–1,000 IU/ml GM-CSF 5-8 的 RPMI/1% 自体血浆。本实验方案中使用 400 IU/ml IL-4 和 100 IU/ml GM-CSF。</li>
	<li>将 EasyFlask 置于含 5% CO2 的组织培养孵箱中，在 37 °C 下继续孵育 2 天。</li>
</ol>
3. 第2天：用IL-4和GM-CSF培养树突状细胞
<ol>
	<li>向每个 EasyFlask 中加入 4 ml RPMI/1% 自体血浆，并加入 400–1,000 IU/ml IL-4 和 100–1,000 IU/ml GM-CSF。通过轻轻旋转并侧向摇动混匀。</li>
	<li>将 EasyFlask 置于含 5% CO2 的组织培养孵箱中，在 37 °C 下继续孵育 3 天（至第 5 天）。</li>
</ol>
4. 第5天：未成熟树突状细胞的收获
<ol>
	<li>通过剧烈涡旋培养瓶并反复吹打，收集悬浮的非贴壁和松散贴壁细胞。将收集的细胞转移至新的50 ml锥形管中。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50 ml RPMI/1%自体血浆中，充分混匀。</li>
	<li>计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心6分钟。在6孔组织培养板中，每孔加入1-2 × 106个细胞，溶于3 ml RPMI/1%自体血浆，并添加400 IU/ml IL-4和100 IU/ml GM-CSF。</li>
	<li>将培养板置于含5% CO2的组织培养孵箱中，37 °C过夜培养。</li>
</ol>
5. 第6天：树突状细胞的成熟与抗原加载
<ol>
	<li>在6孔培养板的1/3孔中加入10 μg/ml KLH，轻轻摇晃培养板以混匀。KLH仅添加至1/3的孔中，因为KLH仅用于第一次树突状细胞疫苗，后续的树突状细胞疫苗仅包含肿瘤抗原肽。</li>
	<li>树突状细胞可使用不同的刺激物诱导其成熟。临床研究中最常用的成熟刺激物是细胞因子混合物（IL-1β、TNFα 和 IL-6）以及前列腺素 E2（PGE₂）2) 9,10近年来，Toll样受体（TLR）激动剂的使用日益受到关注 11,12在此方案中，加入 2 mg/ml 聚肌苷酸-聚胞苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素 (将Poly-ICLC加入孔中并充分混匀。Poly-ICLC是Poly-IC的临床级制剂，由聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定（由Oncovir, Inc.生产）。</li>
	<li>向指定孔中加入100 μg/ml的长肽抗原（NY-ESO-1 和/或 Melan-A/MART-1），每孔仅加入单一肽段，以避免交叉竞争 13.</li>
	<li>在含有5% CO₂的组织培养孵箱中，于37 °C孵育培养板2 过夜</li>
</ol>
6. 第7天：树突状细胞的冷冻保存
<ol>
	<li>使用自体血浆和10% DMSO制备DC冻存液。将DC冻存液在4 °C条件下以2,000 × g离心20分钟，以去除任何颗粒物质。将上清液转移至新的标记好的15 ml锥形管中。4 °C保存备用。</li>
	<li>当过夜孵育结束后，收集并合并所有含有经肽段刺激的DC的孔至50 ml锥形管中。</li>
	<li>以500 × g在室温下离心6分钟。弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 ml RPMI/1%自体血浆中，并用RPMI/1%自体血浆补足总体积至50 ml。充分混匀。</li>
	<li>计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，并将每个沉淀重悬于5 ml无菌0.9% NaCl（USP）中，转移至新的15 ml锥形管中。再用无菌0.9% NaCl（USP）补足每管细胞悬液至14 ml。盖紧管盖，通过倒置混匀。</li>
	<li>重复上一步骤两次。最后一次离心后，尽可能接近细胞沉淀去除上清液，但不得扰动沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于DC冻存液中，细胞密度为4 - 20 × 106 个细胞/ml，并将1 ml分装至每个1.8 ml CryoTube冻存管中。</li>
	<li>使用程序控速冷冻仪（程序1）对DC疫苗分装样品进行冷冻，随后立即转移至液氮罐的气相中进行长期保存。</li>
</ol>
7. 批次放行检测
<ol>
	<li>每批树突状细胞（DC）疫苗在释放用于患者注射前必须进行评估，并符合特定的放行标准（表1），通常在疫苗制备后5至6周进行。</li>
	<li>活力：使用自动细胞计数仪评估DC疫苗的细胞活力。可接受的最低活力标准为&gt;70%。</li>
	<li>鉴定：通过流式细胞术评估成熟DC（CD11c+CD14-CD83+）的表型。CD11c+细胞的比例应&gt;50%；CD11c+和CD14+双阳性细胞的比例应&lt;30%；CD11c+、CD14-且CD83+三标阳性细胞的比例应&gt;50%。</li>
	<li>无菌性：通过直接培养和革兰染色法检测DC疫苗中是否存在厌氧菌、需氧菌及真菌。采用直接培养系统结合DNA荧光染色法（指示细胞系法）检测支原体。上述各项检测的最低标准为所有培养物中均无微生物生长。</li>
	<li>内毒素：采用动力学-QCL显色鲎试剂（LAL）法检测内毒素含量，其浓度必须&lt;50 EU/mL，方可满足最低放行标准。</li>
	<li>功能：通过与同种异体T细胞共培养进行混合淋巴细胞反应，评估DC的功能。与未刺激的DC相比，应观察到明显的T细胞增殖反应（图3）。</li>
</ol>

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</ol>

作者获得了以下机构的资助：美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：AI061684、AI071078、AI044628 和 K08 AI084578（Miller））、比尔及梅琳达·盖茨基金会、多丽丝·杜克慈善基金会、癌症研究所、狼疮研究联盟以及翡翠基金会。Nina Bhardwaj 是关于树突状细胞制备及其用于调控免疫相关专利的共同发明人。除上述披露外，作者无其他与本稿件所述主题或材料存在经济利益或经济冲突的组织或实体的相关从属关系或财务参与。

单核细胞来源的树突状细胞（DC）的I期和II期临床试验表明，这些细胞可在患者中诱导免疫反应，但临床疗效仍然有限1。这可能部分归因于目前尚无共识来确定如何制备用于肿瘤免疫治疗的最佳树突状细胞。尽管存在多种制备临床级树突状细胞的方法，但这些方法在用于单核细胞分化的细胞因子、诱导成熟的刺激物以及抗原负载方法等方面各不相同。制备最佳树突状细胞的方案仍有待明确2。
近期 体外 研究表明，使用促炎细胞因子混合物成熟的树突状细胞 10 其中多数临床试验所采用的方法，特别是PGE2的存在，可诱导调节性T细胞和Th2反应的分化 17表达 IDO 18，且在IL-12p70的产生方面存在缺陷 19这些效应会显著削弱疫苗诱导免疫应答的能力，因此有必要评估其他树突状细胞成熟方法，以优化其作用效果 体内.
使用 Toll 样受体（TLR）激动剂，特别是 TLR3 激动剂 Poly-IC，...

<table><tbody><tr><td>含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES缓冲盐溶液</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白，25%溶液（USP）</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>人AB血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水（USP）</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF，0.5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol（Poly-ICLC），2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlasks培养瓶</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6孔组织培养板</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml CryoTube冻存管</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>程序降温冷冻仪</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

尽管临床研究已证实，抗原负载的树突状细胞疫苗对肿瘤具有安全性和良好的治疗前景 1，其临床疗效仍有待确立。下述方法依据药品生产质量管理规范（GMP）指南制备，是对最常用方法的优化 离体 用于临床研究的大规模树突状细胞制备方法 2.
本方法利用合成的 TLR3 激动剂聚胞苷酸-聚尿苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素（Poly-ICLC）来刺激树突状细胞（DCs）。我们之前的研究证实，Poly-ICLC 是诱导人树突状细胞成熟的最强单一代谢刺激物，其评估指标包括 CD83 和 CD86 的上调、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNF）、γ-干扰素诱导蛋白 10（IP-10）、白细胞介素-1（IL-1）和 I 型干扰素（IFN）的产生，以及极低水平的白细胞介素-10（IL-10）分泌。
树突状细胞（DC）由经白细胞分离术获得的冻存外周血单个核细胞（PBMC）分化而来。PBMC通过Ficoll密度梯度离心法分离，并分装后冻存。第1天，将PBMC解冻并接种于组织培养瓶中，在37 °C组织培养孵箱中孵育1–2小时，使单核细胞贴附于塑料表面，从而进行筛选。孵育后，洗去未贴壁的淋巴细胞，将贴壁的单核细胞在白细胞介素-4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养5天，以诱导其分化为未成熟DC。第6天，用钥孔血蓝蛋白（KLH）对未成熟DC进行刺激，该蛋白作为疫苗质量的对照，可能增强疫苗的免疫原性3。随后，DC被诱导成熟，负载肽类抗原，并过夜孵育。第7天，细胞经洗涤后，以每管1 ml分装，每管含4–20×106个细胞，使用程序控速冷冻仪进行冻存。对每批DC进行放行检测，必须符合最低质量标准后方可用于患者注射。

在培养结束时，初始PBMC中有10-20%会分化为DC。成熟的DC表达CD11c+、CD14-、CD83+、CD40+和CCR7+（图1）。它们高表达MHC I类和II类分子以及共刺激分子CD80和CD86。与其他TLR激动剂相比，Poly-ICLC诱导的PDL-1表达水平较低14。此外，经Poly-IC成熟的DC可分泌大量IL-12（图2和15,16），并能够诱导同种异体T细胞增殖（图3）。
<img alt="流式细胞术图示，显示CD14/CD11c设门及CD83、CD40、CCR7的直方图分析。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50085/50085fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50085/50085fig1.jpg" data-altupd...

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。

尽管临床研究已证实，抗原负载的树突状细胞（DC）疫苗对肿瘤具有安全性和良好的治疗前景1，但其临床疗效仍有待……

本实验的总体目标是演示用于免疫治疗的临床级树突状细胞的制备过程。首先，将从白细胞单采术中分离得到的外周血单个核细胞进行冷冻保存。第二步，解冻冻存的外周血单个核细胞样本，在G-M-C-S-F和IL-4存在条件下培养5天，使单核细胞分化为树突状细胞。接下来，收集树突状细胞，用多肽进行脉冲处理，并在含有TLR3激动剂poly ICLC的条件下过夜成熟。在最后一步中，收获成熟的树突状细胞，并分装冷冻保存。这些冷冻的成熟树突状细胞分装样品可在后续解冻，转入注射器中，作为患者免疫治疗的一部分回输至患者体内。演示该操作的将是本实验室的研究技术人员 Merited Sedia 和 Farra Hassan。使用血浆转移套装，首先以无菌方式穿刺白细胞分离袋的一个接入端口。然后用 60 毫升注射器将白细胞分离产物转移至一个无菌的 500 毫升瓶中。接着用室温 RPMI 将白细胞分离产物的体积调整至原始体积的两倍，并充分混匀。轻轻混匀一袋 FialPack Plus 后，取 12 毫升该溶液加入无菌 50 毫升锥形管中，然后小心地将 30 毫升稀释后的白细胞分离产物分层加入每根 Fial 管中。注意不要扰动FI分离液与细胞悬液之间的界面。将试管在室温下以1000 × g离心20分钟，离心过程中不刹车。然后小心收集每根试管中浑浊的PBMC层，并转移至新的无菌50毫升离心管中。接下来，向每根试管中加入RPMI，使最终体积达到50毫升，然后通过轻柔倒置混匀细胞悬液。在500 ×g、4°C条件下离心10分钟后，吸去每根试管中的上清液，并将每管的细胞沉淀重悬于RPMI中，使最终体积为50毫升。轻轻倒置混匀各试管后，测定细胞数量和活率。随后，离心细胞并将沉淀重悬于新鲜配制的冻存液中，最终浓度为每毫升含 2 × 10⁸ 个细胞。取 1 毫升该细胞悬液转移至 1.8 毫升的冻存管中。然后将冻存管放入程序降温仪中，开始冷冻程序。程序结束后，立即将冻存管转移至液氮罐的气相中保存。第二天，在37摄氏度水浴中通过轻柔振荡融化冻存的pBMC等分试样。完全解冻后，将冻存管中的内容物转移至含有30毫升RPMI和自体血浆的无菌50毫升锥形管中，进行离心。小心地重悬细胞沉淀于少量RPMI加自体血浆中。然后加入更多 RPMI 及自体血浆，调整总体积至 50 毫升。充分混匀后，将 1.4 × 10⁸ 个细胞悬浮于 40 毫升 RPMI 加自体血浆中，接种至一个 225 平方厘米的 Easy 培养瓶中，在含 5% CO₂ 的组织培养孵箱中，37 °C 条件下将培养瓶平放孵育 1 至 2 小时，使单核细胞贴壁。孵育完成后，用 30 毫升预温的 RPMI 洗涤培养瓶两次，每次 30 毫升，以去除未贴壁的细胞。第二次洗涤后，向细胞中加入40毫升含自体血浆、IL-4和G-M-CS-F的RPMI培养基，然后将EASI培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天。五天后用力摇动培养瓶，并反复吹打以重悬细胞。收集非贴壁及松散贴壁的细胞，转移至新的50毫升离心管中。离心细胞后，将细胞沉淀重悬于50毫升RPMI培养基中，加入自体血浆。混匀并洗涤细胞后，将细胞悬液再次接种至6孔板，每孔加入一到两乘以10的6次方个细胞，每孔含3毫升RPMI培养基、自体血浆、IL-4和G-M-CS-F。将6孔板置于37°C、含5%二氧化碳的细胞培养箱中过夜培养。次日，向6孔板中三分之一的孔加入KLH至终浓度为10微克/毫升，并通过轻轻旋转混匀各孔。然后向各孔中加入每毫升2微克的聚ICLC，并充分混匀。接着，向指定孔中加入每毫升100微克的长肽抗原，每个孔仅加入一种肽，以避免交叉竞争。随后在第7天将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度组织培养孵箱中过夜孵育，之后收集并合并所有含有树突状细胞的孔。第6天将肽段脉冲处理后的细胞转入新的50毫升锥形管中。离心沉淀细胞后，用5毫升含自体血浆的RPMI培养基重悬细胞沉淀，再用含自体血浆的RPMI培养基补足总体积至50毫升，并充分混匀细胞悬液。计算活细胞总数后，离心各管，弃上清，每管沉淀用5毫升无菌氯化钠溶液重悬，随后再用14毫升无菌氯化钠溶液洗涤细胞悬液两次。每次洗涤后，在第二次洗涤完成后混匀各管。将细胞沉淀重悬于树突状细胞冻存液中，细胞浓度为每毫升4至20×10⁶个细胞，然后将每种细胞悬液各1毫升分装至1.8毫升冻存管中。最后，使用程序降温仪将树突状细胞疫苗分装物逐步降温冷冻，随后立即转移至液氮罐的气相中进行长期保存。培养结束时，初始的外周血单个核细胞（pBMCs）中有10%至20%分化为树突状细胞。根据CD83、CD40和CCR7的表达情况，评估了在聚ICLC刺激下（以粗线表示）树突状细胞的成熟情况，并与未受刺激的树突状细胞（以灰色区域表示）进行比较。如这些柱状图所示，在本实验中，来自三位健康供体的聚ICLC成熟的树突状细胞分泌大量IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α。这些经聚ICLC成熟的细胞还能诱导同种异体T细胞增殖（通过CFSE表达证明），并在其发育后诱导产生干扰素γ。该技术为免疫学领域的研究人员探索利用树突状细胞进行癌症和传染病免疫治疗开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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