Name: 人体实验肺炎球菌运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解人体实验性肺炎球菌定植模型的建立方法，通过鼻内接种Streptococcus pneumoniae并进行鼻腔冲洗监测。该技术为疫苗研发提供安全可重复的天然宿主研究平台，有助于评估新型肺炎球菌疫苗的免疫保护效果。

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本工作由比尔及梅琳达·盖茨基金会（SBG 获得的大挑战探索奖）、英国国家卫生研究院研究（NIHR）、微生物疾病生物医学研究中心以及NIHR综合地方研究网络资助。我们感谢西北地区数据库（NWDA）提供的基础设施支持。我们感谢宾夕法尼亚大学的 J. N Weiser 教授和奈梅亨大学的 P Hermans 教授提供肺炎链球菌分离株。感谢EHPC安全委员会提供的支持与建议，感谢所有志愿者的参与，同时感谢Mathieu Bangert拍摄照片。

1. 志愿者选择与筛选
<ol>
	<li>根据英国国家医疗服务体系（NHS）研究与伦理委员会的指导，通过海报广告和大学网站招募健康志愿者。</li>
	<li>参与者的纳入标准为：
	<ol>
		<li>年龄在18至60岁之间的成年人。</li>
		<li>能流利使用英语，并可通过手机通话和短信轻松交流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参与者的排除标准为：
	<ol>
		<li>与高风险人群有密切接触（儿童、免疫功能低下成人、老年人、患有慢性疾病者）。</li>
		<li>当前吸烟或有显著吸烟史（&gt;10包年）。</li>
		<li>患有哮喘或其他呼吸系统疾病。</li>
		<li>妊娠状态。</li>
		<li>对青霉素或阿莫西林过敏。</li>
		<li>目前正在参加其他临床试验，除非为观察性研究或非干预阶段。</li>
		<li>无法提供完全知情同意。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初次筛查访视约在接种前一周进行，包括重点临床病史采集和针对性体格检查。</li>
	<li>若发现先前未识别的异常情况，志愿者将被排除出研究，且将通过初级医疗机构安排适当的进一步检查。</li>
	<li>在初次筛查访视期间，需进行全血细胞计数检测，以确保接种前白细胞计数处于正常范围内；同时进行鼻腔冲洗以排除天然肺炎链球菌携带者（见6.1）。</li>
	<li>接种前，志愿者将接受有关研究参与风险的宣教，并获得紧急情况患者手册、电子体温计、紧急联系电话以及为期3天的阿莫西林疗程药物。</li>
</ol>
2. 接种物的制备
<ol>
	<li>接种物的制备必须在洁净环境中进行。所用移液器应专用于接种物的制备。所有玻璃器皿和塑料器皿均应无菌。建议在专用房间内使用专用通风橱和培养箱制备接种物。</li>
	<li>将肺炎链球菌菌株接种于血琼脂平板上。平板在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。次日，将血琼脂平板上的所有细菌刮下，并接种至珠状保存系统中。这些珠状保存液用于接种物的制备。在制备接种物前，需检测珠状保存液是否存在污染及菌落是否均一。</li>
	<li>制备接种物时，取所需血清型的肺炎链球菌珠状保存液中的两颗珠子接种于血琼脂平板上，并划线以覆盖整个平板。平板在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。后续所有培养均采用相同条件。同时将Vegitone培养基过夜培养以确保无菌。</li>
	<li>次日早晨，用拭子取平板的一半，注意不要刮下血琼脂，然后加入12 ml预热的Vegitone肉汤中。用平板的另一半重复此操作。将两个12 ml的试管置于37 °C下孵育2小时，或直至浊度明显变化，以先到者为准。</li>
	<li>将12 ml菌液加入40 ml预热的Vegitone肉汤中并充分混匀。对另一个12 ml试管重复此操作。此时间点记为0。取100 μl测定600 nm处的光密度（OD）。另取20 μl采用Miles和Misra（M&amp;M）方法的改良法进行菌落形成单位（CFU）计数以定量细菌7。将两个试管继续孵育。
	<ol>
		<li>进行M&amp;M实验时，将血琼脂平板分为六个区域。在96孔板（U型底）的六个孔中各加入180 μl无菌PBS。向最上方的孔中加入20 μl肉汤并混匀。将样品连续10倍梯度稀释六次，并从第六孔中弃去20 μl。从最上方孔中取三个10 μl液滴加入血琼脂平板的第一个区域。对其他五个孔重复此操作。确保平板干燥后倒置并进行培养。</li>
		<li>次日计数每个稀释区域中可见菌落数并记录。选择菌落数在30至300之间的稀释区域，将菌落数除以3，得到平均值。</li>
		<li>将平均菌落数乘以稀释倍数，再除以10（即10 μl液滴的体积）。由此得到CFU/μl。</li>
		<li>将该数值乘以1,000，得到CFU/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔一小时测定一次OD600并采用M&amp;M法定量细菌，直至达到对数早期（OD值为0.25）。</li>
	<li>当达到该OD值时，向其中一管加入灭菌的10%甘油，并分装成1 ml等份。于-80 °C保存。</li>
	<li>如需更高浓度的保存液，将另一管在3,345 × g离心15分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于22.5 ml Vegitone培养基中，并加入10%甘油。分装成1 ml等份，于-80 °C保存。</li>
	<li>保存液在-80 °C中至少存放48小时后方可解冻并定量。</li>
	<li>采用M&amp;M法对冷冻细菌保存液进行定量。分别检测三管保存液以确保可重复性。根据所得数值，用生理盐水将保存液稀释至所需接种浓度，具体方法如下所述。</li>
	<li>进行接种时，需在接种前后分别计算接种物中肺炎链球菌的数量。采用M&amp;M法对细菌进行定量，以确定接种物中肺炎链球菌的平均数量，从而校正完成整个操作所需的时间。
	<ol>
		<li>制备接种物，稀释至所需浓度，并采用M&amp;M法进行“接种前”计数。</li>
		<li>在我们的临床研究机构中，团队完成整个接种过程需要30分钟。生理盐水中的肺炎链球菌悬液在此期间通常会出现数量下降。为校正此影响，我们将稀释后的接种物在室温下静置30分钟，然后采用M&amp;M法进行“接种后”细菌定量。</li>
		<li>取接种前后两次计数的平均值，以确定最终接种浓度。根据您的临床方案调整“静置”时间，但应尽可能缩短该时间间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有新制备的保存液均应送至参考实验室，以确认其纯度和身份。</li>
</ol>
3. 接种物制备
<ol>
	<li>应在预定志愿者接种前 30 分钟开始制备接种物。</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出一支先前制备的冻存管，解冻后在微量离心机中以 17,000 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将血琼脂平板放入 37 °C 培养箱中预热。根据所需剂量，用 M&amp;M 法准备用于细菌定量的 96 孔板，并准备相应的稀释管。</li>
	<li>从离心后的管中移除肉汤上清液，并将沉淀重悬于 1 ml 生理盐水中。此步骤可去除接种物中的培养基。</li>
	<li>重复离心步骤。</li>
	<li>移除生理盐水上清液，并将沉淀重悬于 1 ml 生理盐水中。</li>
	<li>根据所需接种浓度进行系列稀释，并采用 M&amp;M 法进行定量。</li>
	<li>将接种物带至志愿者接种现场，在完成志愿者接种后，返回实验室再次进行定量。在管上标注日期和接种剂量，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>为确保每次接种的一致性，每次均应使用相同的移液器和专用实验设备。</li>
</ol>
4. 接种
<ol>
	<li>受试者应舒适地采取半卧位坐姿。</li>
	<li>使用 P200 移液器和无菌滤芯吸头吸取 100 μl 接种物，并将吸头轻轻插入鼻腔内侧。</li>
	<li>以缓慢的环形动作将接种物均匀释放到鼻黏膜表面。</li>
	<li>必须确保移液器吸头不与鼻黏膜直接接触，以免破坏上皮完整性，导致细菌进入血液循环。</li>
	<li>同时必须避免将接种物放置过深，否则接种物会流入咽喉；接种物应保留在鼻腔内部。</li>
	<li>对另一侧鼻孔重复相同操作。</li>
	<li>要求受试者在接种后保持半卧位 10 分钟，期间不得吸鼻或擤鼻，以确保细菌有足够时间在黏膜表面均匀分布。</li>
</ol>
5. 监测
<ol>
	<li>接种后，志愿者将接受每日监测。这包括志愿者每天下午2点前向研究人员发送一条短信。</li>
	<li>如果在下午2点前未收到短信，研究人员将联系该志愿者以确保其健康状况。若志愿者未予回应，则将联系其指定的紧急联系人，以确认其安全与健康。</li>
	<li>每次就诊时，志愿者均需报告任何上呼吸道症状。临床工作人员将询问志愿者症状的具体情况，并对任何主诉进行随访处理。</li>
	<li>提供给志愿者的抗生素仅可在以下三种情况下服用：一是志愿者身体不适并经研究团队指示服用；二是研究结束时仍携带肺炎链球菌；三是志愿者身体不适但无法联系研究团队。志愿者被要求在整个研究期间随身携带此应急药包，并在接下来的7天内每日联系研究团队。</li>
	<li>我们的团队提供全天候（24/7）支持，工作时间内可联系护士，非工作时间也有两名医生待命。所有咨询均通过电话和/或立即会诊处理。如有需要，可立即直接转入传染病病房接受治疗。</li>
</ol>
6. 鼻腔冲洗（NW）操作步骤
<ol>
	<li>在初次筛查访视时以及接种后 48 小时、7 天和 14 天进行鼻洗（NW）。所采用的 NW 方法源自 Naclerio et al.8。天然携带 S. pneumoniae 的志愿者将被排除在接种及随访之外。</li>
	<li>让志愿者舒适地坐好，头部从垂直位置向后倾斜 30°。</li>
	<li>要求志愿者深吸一口气并屏住呼吸，同时将舌头向上并向后紧贴口腔顶部。在此状态下，让志愿者示意已准备就绪。</li>
	<li>将装有 20 ml 生理盐水的注射器插入前鼻腔，并推出 5 ml 生理盐水。随后志愿者立即向前倾身，通过鼻腔快速呼气，将液体排出至铝箔碗中。</li>
	<li>重复此操作 3 次，使每侧鼻孔均冲洗两次，并用完全部 20 ml 生理盐水。</li>
	<li>将所有样本合并至一个离心管中，并在室温下送至实验室进行处理。</li>
</ol>
7. 鼻腔冲洗液处理
<ol>
	<li>将样品在 3,345 x g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>移除上清液，并分装为1 ml等份，置于已标记的Eppendorf管中，于-80 °C保存。</li>
	<li>加入100 μl STGG培养基9 加入沉淀中并充分混匀。确保此时确定管中的总体积。该稀释液将用于计算携带阳性鼻咽拭子的CFU。</li>
	<li>将含有重悬沉淀物的20 μl STGG液滴接种到含庆大霉素的血琼脂平板上，并划线涂布至整个平板。
	<ol>
		<li>若为接种后鼻咽拭子样本，从含有重悬菌体的STGG中取出10 μl，用于通过M进行细菌定量&amp;M 方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向NW管中再加入800 μl STGG，并充分混匀。</li>
	<li>将25 μl划线接种至血琼脂平板，另取25 μl划线接种至巧克力琼脂平板，均划线至整个平板。</li>
	<li>将剩余的STGG培养基中的菌液分装至2个冻存管中，于-80 °C保存。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养平板2.</li>
	<li>第二天检查平板上的肺炎链球菌及其他潜在呼吸道病原体。</li>
	<li>肺炎链球菌通过菌落形态在平板上进行鉴定。具有草绿色溶血及铅笔样形态的菌落需接种于血琼脂平板并贴附奥普托辛纸片，过夜培养。</li>
	<li>对疑似肺炎链球菌菌落进行奥普托欣敏感性试验后，采用革兰染色法确认其为革兰阳性双球菌，并使用 Statens Serum Institut Pneumotest-Latex 试剂盒进行血清分型。</li>
</ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622(2012).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li>
<li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li>
<li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+WHO+working+group%3A+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Infect.+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li>
<li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash%2C+using+culture+and+PCR%2C+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122(2011).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

EHPC 平台具有多种潜在用途，包括用作黏膜疫苗模型以及用于测试新型蛋白质疫苗的保护效果替代指标。该方法依赖于一致的接种技术和高质量的鼻拭子样本。
接种物的可重复性可能存在问题。由于冻存细菌分装物本身存在变异性，难以精确复制所需的接种剂量。接种剂量减半或加倍均被视为在可接受范围内。为准确通过菌落形成单位（CFU）计数确定细菌数量，必须在接种前后立即进行细菌定量。因此，建议志愿者的预约时间尽量同步，以便仅需制备一份接种物，并确保接种前后的定量平板操作间隔不超过30分钟。
鼻腔清洗法需要志愿者的配合，因此在儿童中并非理想的采样方法。如果采集量少于5 ml，可重复操作，最多额外使用20 ml生理盐水。佩戴义齿可能会降低鼻腔清洗液的采集量。如果志愿者存在鼻塞，且生理盐水在注入后从前鼻部流出，应先擤鼻，再将注射器稍微向后深入插入，必要时进一步后仰头部。
鼻咽冲洗（NW）是一种通过练习可提高熟练度的技术。通常会损失部分液体，因此目标是回收至少10 ml。如果志愿者在进行鼻咽冲洗过程中尝到盐水，则说明其舌部未能充分封闭后鼻咽与口咽之间的通路。如果志愿者吞咽了大部分盐水，应再次解释操作步骤，重点强调将舌头紧贴上颚推动的动作，然后重复操作以提高回收液体的体积。
如果鼻咽拭子中含有大量黏液，最好在离心前将其去除。涡旋震荡样本，以松动可能与黏液结合的物质，然后在尽可能少移除生理盐水的情况下，移除尽可能多的大块黏液。
美国此前一项EHPC研究已安全完成，且未发生任何不良事件11。为确保EHPC平台的持续安全性，我们已制定一项应急方案，核心是研究团队提供24小时全天候支持。志愿者将获得联系方式，以便全天24小时联系研究团队。任何所需的医疗护理均在皇家利物浦大学医院提供。作为进一步的保护措施，一个由研究团队以外的临床医生和科学家组成的安全委员会将每周收到一份安全报告。该报告包含每位志愿者接受的细菌剂量，以及是否报告了任何症状或疾病。此报告可使研究的安全性得到独立、无偏倚的外部评估。在极小可能发生的紧急情况下，安全委员会也可提供24小时全天候支持。

<table><tbody><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>G/0650/08</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>B. Braun</td><td>3627667</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Fluka</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>BDH</td><td>284504S</td><td></td></tr><tr><td>含巧克力化马血的哥伦比亚琼脂</td><td>Oxoid</td><td>PB0124</td><td></td></tr><tr><td>肺炎链球菌乳胶检测试剂盒</td><td>Statens Serum Institut</td><td>51823</td><td></td></tr></tbody></table>

实验性人类肺炎链球菌定植

Experimental Human Pneumococcal Carriage

实验性人类肺炎球菌携带（EHPC）在科学上具有重要意义，因为鼻咽部携带Streptococcus pneumoniae不仅是传播的主要来源，也是发生侵袭性疾病的先决条件。建立携带模型将有助于准确确定保护性免疫的相关因素、携带的免疫诱导效应以及宿主压力对鼻咽部生态位中病原体的影响。此外，还可比较在流行病学研究（包括疫苗研究）中可用于携带检测的方法。
目的
我们的目标是开发一种EHPC平台，该平台是一种安全、有效且可重复的方法，可用于筛选以预防定植作为疫苗诱导免疫替代指标的新型肺炎链球菌候选疫苗。该平台将有助于候选疫苗的测试，并阐明EHPC及疫苗预防定植保护作用的潜在机制1。目前针对肺炎链球菌的结合疫苗可保护儿童免受侵袭性疾病的影响，但仍迫切需要研发新型疫苗，因为现有疫苗对非菌血症性肺炎的保护效果未达理想水平，且已有证据表明出现了非疫苗血清型对疫苗血清型的替代现象2-4。
方法
我们将肺炎链球菌（S. pneumoniae）悬浮于100 μl生理盐水中进行接种。安全性是EHPC模型开发中的关键因素，通过严格的志愿者筛选和监测来实现。一个由独立于本研究的临床医生和科学家组成的安全委员会每周提供客观的反馈意见。
细菌接种物需进行标准化处理，并要求不得将任何动物源性物质接种给志愿者（应使用植物来源的培养基和生理盐水）。引起定植所需的剂量（104-105）远低于动物模型中使用的剂量（107）5。通过采集较大体积（理想情况下&gt;10 ml）、相对无黏液的鼻洗液，可提高肺炎链球菌携带状态的检出率。本方案将依次介绍该实验流程中最关键的几个部分，包括：（a）志愿者筛选，（b）肺炎链球菌接种物制备，（c）接种操作，（d）随访观察，以及（e）携带状态检测。
结果
目前的方案在使用两种不同细菌血清型的多个剂量范围内已对超过100名志愿者证明是安全的6。一项采用S. pneumoniae 6B和23F的剂量探索研究正在进行中，旨在确定达到50%定植率的最佳接种剂量。预计50%的定植率将使人体鼻腔定植模型在较小样本量的情况下对疫苗有效性具有高敏感性。

我们已有对159人进行接种的经验，其中35人携带肺炎球菌。使用血清型6B时，成功建立定植的最低剂量为每侧鼻孔11,100 CFU/100 μl，最高剂量为每侧鼻孔313,000 CFU/100 μl。使用血清型23F时，成功建立定植的最低剂量为每侧鼻孔9,000 CFU/100 μl，最高剂量为每侧鼻孔84,500 CFU/100 μl。
我们的携带状态评估方法采用鼻洗液，选择该方法的原因是最近一项研究10表明，91%的志愿者认为鼻洗比鼻咽拭子更舒适；并且使用微生物培养法时，鼻洗液更有可能检测到病原体。接种鼻洗液后在血琼脂平板上回收的微生物菌群可能具有变异性，难以判读。第一块血琼脂平板上使用庆大霉素，用于选择性培养肺炎链球菌。巧克力琼脂平板和第二块血琼脂平板用于检测其他潜在的呼吸道病原体，这些病原体可能促进或抑制肺炎链球菌的定植。图1a展示了一例易于判读的接种鼻洗液后的血琼脂平板；图1b展示了一例含有多种菌群、难以判读的平板。
每次就诊时，志愿者均被要求描述是否存在任何上呼吸道症状（若存在），并重点比较携带者与非携带者之间的差异。在最近接种肺炎链球菌的145人中，有28人报告出现症状（表1）。其中8人为携带者，20人非携带者。最常见的症状为非特异性鼻部症状（表1）。在报告有全身症状（包括发热和/或不适）的病例中，所有进行的检查均未发现肺炎链球菌感染的证据，症状表现均符合合并病毒感染，仅有一例扁桃体炎例外。两名肺炎链球菌检测阳性的志愿者接受了抗生素治疗。其中一人主诉咽喉痛和耳痛，经与研究医生会诊后，出于预防考虑建议其使用抗生素；另一名志愿者经临床诊断为扁桃体炎。所有志愿者的症状均迅速缓解。
<img alt="细菌在琼脂平板上的生长、菌落比较、微生物学实验、培养皿。" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 接种了 NW 的血琼脂平板。 接种了 NW 的血琼脂平板可能难以判读。1a 是一个易于判读的平板示例，其中肺炎链球菌清晰可见。1b 是一个存在大量共定植菌群的平板，使得判断是否存在肺炎链球菌更加困难。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>症状</td>
			<td> </td>
			<td>携带者 (n=32)</td>
			<td>非携带者 (n=112)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>所有症状</td>
			<td> </td>
			<td>24%</td>
			<td>18%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>全身性症状</td>
			<td>发热</td>
			<td>3%</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>不适*</td>
			<td>9%</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>局部症状</td>
			<td>耳部</td>
			<td>9%</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>鼻部</td>
			<td>0</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>咽喉</td>
			<td>12%</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 接种S. pneumoniae 6B后志愿者报告症状的特征描述。所有不良反应均经外部安全委员会审核，经全面调查后，未发现任何症状与肺炎链球菌疾病相关。最常见的症状为咽喉痛、鼻塞和流感样疾病。

实验性人类肺炎链球菌定植提供了一种定植的自然模型，并可作为疫苗开发的潜在模型。该技术具有重要价值但操作复杂，且因将病原体引入人体而存在临床风险。我们已制定出一份详细的实验方案。

实验性人类肺炎球菌定植（EHPC）在科学上具有重要意义，因为肺炎链球菌在鼻咽部的定植既是该病原体主要的……

本实验的目的是建立实验性人肺炎球菌定植模型。首先，对接种物中的细菌进行稀释和定量。第二步，通过鼻腔将肺炎链球菌接种至志愿者体内。接下来，在接种后的第2天、第7天和第14天，志愿者需进行鼻腔冲洗。最后，采用经典微生物学方法检测志愿者是否携带接种的肺炎球菌。最终，可通过这种安全且可重复的方法建立实验性人肺炎球菌定植模型。与现有的小鼠定植模型相比，该技术的主要优势在于其提供了肺炎链球菌在自然宿主——人类中的定植模型。此外，该方法有助于解答肺炎链球菌研究领域中的关键问题，例如：保护性免疫的免疫学相关因素是什么？定植的免疫诱导效应是什么？宿主压力对鼻咽生态位中病原体的影响又是什么？该技术的应用包括将其作为一种筛选新型肺炎球菌疫苗的方法。我们计划将定植的预防作为疫苗诱导免疫的替代指标。临床技术的演示将由护士安吉·赖特（Angie Wright）和护士长戴维·肖（David Shaw）进行。在预定的志愿者接种时间前30分钟，从-80摄氏度冰箱中取出一管接种物原液。然后将接种物在微型离心机中以17,000 × g离心3分钟。在离心过程中，将一些血琼脂平板放入37摄氏度培养箱中预热。然后从离心后的接种液中去除肉汤上清，将菌体沉淀用一毫升生理盐水洗涤。重复离心和洗涤步骤。根据所需接种浓度进行系列稀释，随后采用类似 Miles 和 Misra 的方法对接种液中的细菌数量进行定量。培养的菌落将于次日可见。将接种物带给志愿者，志愿者应舒适地采取半卧位。然后使用 P 200 移液器和无菌滤芯吸头。用移液枪吸取100 µL接种物至移液枪头中，将枪头轻轻插入鼻腔内侧。使用环形动作缓慢将接种物释放到鼻黏膜上。切勿将移液枪头插入过深，否则接种物会流入喉咙。对另一侧鼻孔重复接种操作，以避免细菌进入血液。注意不要用移液器损伤黏膜。然后让志愿者保持半卧位 10 分钟，以使细菌在黏膜表面充分扩散。向志愿者接种接种物后，在实验室重复进行细菌定量。然后用接种日期和剂量标记试管，并将接种物在负80摄氏度下保存。开始鼻腔冲洗前，让志愿者舒适地坐着，头部从垂直位置向后倾斜30度。然后让受试者深吸一口气并屏住呼吸，同时将舌头向上并向后紧贴上颚。当受试者达到该位置时，应给出信号示意。随后用20毫升生理盐水冲洗鼻腔四次，每次向鼻前庭注入5毫升生理盐水并排出。每次用5毫升生理盐水冲洗后，让志愿者立即向前倾身，通过鼻子快速呼气至铝箔碗中，以排出液体。在用四次20毫升生理盐水清洗鼻腔后，将所有收集的样本合并至一个离心管中。现在以3,345 × g离心志愿者鼻洗液样本10分钟。去除上清液，并将其分装为每管1毫升，置于已标记的微量离心管中，于-80摄氏度保存。向沉淀中加入100 µL STGG培养基并充分混匀，然后测定试管中的总体积。接下来，取20 µL重悬后的沉淀液滴加到含庆大霉素的血琼脂平板上，并划线接种至整个平板。如果鼻洗液为接种后样本，则使用含重悬沉淀的STGG溶液10 µL。采用 Miles 和 Misra 法进行细菌定量时，向鼻洗液管中再加入 800 微升 STGG 并充分混匀。然后取 25 微升 STGG 细菌悬液接种至另一块血琼脂平板，另取 25 微升接种至巧克力琼脂平板，将两块平板表面完全划线接种。随后将剩余细菌分装于两个冻存管中，于 -80 摄氏度冷冻保存。将平板置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度孵育过夜。次日，检查平板上是否存在肺炎链球菌及其他潜在呼吸道病原体。接种了鼻洗液的血琼脂平板可能较难判读。此图像显示了一个易于观察的平板示例，其中肺炎链球菌清晰可见。然而，该平板含有大量共定植的菌群，使得在每次随访时判断是否存在肺炎链球菌更加困难。研究人员要求志愿者报告是否存在任何上呼吸道症状，并对携带者与非携带者之间的差异进行了重点比较。在最近接种了肺炎球菌的145人中，有28人报告出现症状，这些症状总结于本表中。这些志愿者中有8人为携带者，20人为非携带者。所有不良反应均经外部安全委员会审查，并在全面调查后进行了评估。未出现与肺炎链球菌疾病相关的症状。最常见的症状为咽喉痛、鼻塞和流感样疾病。在实施该操作时，必须制定非常周密的安全计划，涵盖方法的每一步骤，尤其要保障志愿者的安全。观看本视频后，您应充分了解如何建立实验性人肺炎链球菌定植，并通过鼻腔冲洗液检测定植情况。

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实验性人类肺炎链球菌定植

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