Name: 原位膀胱癌模型的基因传递研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习在小鼠膀胱中植入MB49膀胱癌细胞并递送腺病毒基因的方法。该方案通过导管技术建立原位膀胱癌模型，用于评估基因治疗表达水平及膀胱癌疗法的临床前研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21 CA143505 项目资助，项目负责人为 Christina Voelkel-Johnson。

所有涉及动物的实验程序均经过南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会审查并批准。&#160;&#160;该实验方案根据美国农业部疼痛类别D获得批准。&#160;
1. 细胞植入
<ol>
	<li>操作前两天，接种 1 x 106 将MB49细胞接种至T-25培养瓶中。使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基（如需要可添加抗生素）。每组最多五只同时进行麻醉和接种的小鼠使用一个培养瓶即可。</li>
	<li>在实验当天，将无菌的0.25%组织培养级胰蛋白酶用无菌DMEM基础培养基按1:2比例稀释至0.125%，以制备用于灌注的胰蛋白酶溶液。每10只小鼠准备1.2 ml即可。置于37 &#176;C 水浴中平衡。</li>
	<li>预热加热垫，并将其放置在用于输送异氟烷的麻醉系统鼻罩下方。在加热垫上铺一张干净的吸水垫。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉系统的诱导室中，使用3%异氟烷诱导麻醉。当小鼠失去意识（通过脚趾夹捏反射消失确认）后，将其转移至鼻罩。确保每只动物呈仰卧位，并正确放置于加热垫上以维持体温。</li>
	<li>将异氟烷浓度降低至2%以维持麻醉状态。</li>
	<li>在双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。</li>
	<li>可选步骤：去除腹部毛发。如果下腹部有毛发，则必须去除 体内 将进行生物发光成像。
	<ol>
		<li>在下腹部约2.5厘米范围内均匀涂抹一层足量的脱毛膏（如Veet）&#160;腹部剃毛区域呈方形，注意避免接触外生殖器。等待3分钟。</li>
		<li>用干海绵擦拭局部区域以去除毛发，然后用湿海绵清洁皮肤。如有需要，可重复一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导尿管插入膀胱
	<ol>
		<li>用非刺激性润滑凝胶（如K-Y）润滑一根新的无菌24 G小儿静脉导管。取下并丢弃针头。如果导管周围常出现液体泄漏， 即在超过十分之一的小鼠中发生时，可使用较粗的导管（20 G）。对于8周龄以上的小鼠，这一点可能是重要的考虑因素。</li>
		<li>用一只手握住导管的接头，另一只手的拇指和食指分开小鼠的后肢，暴露尿道外口。将导管以45度角轻柔插入尿道&#176; 角度，调整角度至与实验台平行以完全插入。</li>
		<li>完全插入后，轻轻抬起导管，保持其与实验台平行，并目视确认导管已进入尿道而非其下方的阴道。若位置正确，导管可完全插入，因为阴道短于尿道。</li>
		<li>将异氟烷浓度降低至1%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将吸头安装至P200移液器，通过对外部导管末端施加负压，吸出膀胱内的尿液。清除导管接头处残留的尿液。弃去尿液，保留导管原位。</li>
	<li>小心地用移液器吸取80 &#956;l&#160;将0.125%胰蛋白酶溶液注入导管接头，避免产生气泡。将一支装有1 ml空气的注射器连接至导管接头，缓慢推动活塞0.1–0.2 ml&#160;将胰蛋白酶注入膀胱。</li>
	<li>将注射器和导管组件留置15分钟。对剩余的麻醉小鼠（最多4只）重复步骤1.8–1.11。在等待期间继续进行下一步操作。提示：最初可由另一人负责细胞准备（步骤1.12），有助于提高效率。</li>
	<li>准备用于植入的MB49细胞。将细胞以1 × 10⁵6 每T-25培养瓶在植入前48小时（步骤1.1）。
	<ol>
		<li>移除培养基，加入500 &#181;加入0.25%胰蛋白酶溶液至培养瓶中。当细胞脱落时，加入5 ml完全DMEM培养基重悬细胞。取出50 μl细胞悬液用于后续操作。 &#956;l&#160;分装用于计数，并将剩余部分在1,000 rpm下离心5分钟。离心过程中继续进行步骤1.12.2和1.12.3。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，计算每毫升细胞数量，然后计算将细胞沉淀重悬至 4 x 10⁶ 个细胞所需的体积。6 细胞/毫升（2 × 105 每 50 个细胞 &#956;l)。</li>
		<li>离心后弃去上清液，用所需体积的DMEM基础培养基重悬细胞沉淀，使细胞浓度为4 x 106 细胞/ml（按步骤1.12.2计算）。将细胞置于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当15分钟时&#160;当达到膀胱胰蛋白酶处理的时间点时，将装有空气的注射器从导管上取下，保留导管原位。用过的胰蛋白酶通常会通过导管回流出来。参照上述步骤1.9，使用P200移液器通过抽吸去除膀胱中残留的胰蛋白酶，并弃去。</li>
	<li>立即用移液器加入50 &#956;l&#160;将MB49细胞悬液注入导管接头。将装有1 ml空气的注射器连接至导管接头，缓慢推动活塞0.1–0.2 ml，将细胞注入膀胱。重复此步骤最多四次，以完成全部五只小鼠的细胞植入。弃去未使用的细胞。</li>
	<li>保持导管-注射器组件原位，使细胞在膀胱内滞留50分钟。</li>
	<li>轻轻将导管-注射器组件从尿道撤出。将异氟烷浓度调至零，并将每只小鼠从鼻罩处移开一至两英寸，在加热垫上恢复。</li>
	<li>当小鼠恢复翻正反射后，将其放回笼中。</li>
</ol>
2. 腺病毒的膀胱内递送（细胞植入后8天）
注意：本实验方案的此部分使用腺病毒，其为一种传染性病原体，应在严格的生物安全二级（BSL2）指南下操作（http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/）。
所有涉及感染性试剂的操作均经南卡罗来纳医科大学机构生物安全委员会批准。
<ol>
	<li>在将 MB49 细胞植入小鼠体内 8 天后，检查是否存在血尿。将单个动物提起置于一张白色吸水纸上，轻轻按压腹部，使尿液滴落在纸上。尿液呈粉红色至红色表明存在血尿，提示肿瘤已成功建立。肿瘤成瘤率至少为 80%，在操作技术优良的情况下可高达 100%。</li>
	<li>将腺病毒储备液置于冰上解冻，并用无菌室温 PBS 稀释至 109 PFU/50 μl&#160;(2 × 1010 PFU/ml)。</li>
	<li>按照上述步骤 1.3–1.6 所述方法麻醉小鼠。</li>
	<li>按照步骤 1.8 所述方法对小鼠进行导管插管，并按步骤 1.9 清除尿液。</li>
	<li>清除尿液后，立即用移液器将 50 μl&#160;病毒悬液加入导管接头中。将装有 1 ml 空气的注射器连接至导管接头，通过缓慢推动活塞 0.1–0.2 ml，将病毒输送至膀胱。</li>
	<li>保持导管-注射器组件连接状态，使病毒在膀胱内滞留 40 分钟。</li>
	<li>轻柔地将导管-注射器组件从尿道中撤出，并将其丢弃至 10% 漂白液中，以灭活任何残留的病毒。</li>
	<li>将异氟烷浓度调至零，并将每只小鼠从鼻罩处移开约 2.5–5 cm，在加热垫上恢复。</li>
	<li>当小鼠恢复翻正反射后，将其放回笼中。</li>
	<li>标记笼子，标明小鼠已接种腺病毒。病毒将在数天内排入笼内垫料中，所有笼具和垫料均需妥善处理并进行消毒。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案中描述的主要方法是小鼠膀胱插管，该方法可广泛应用于向膀胱上皮局部递送细胞或任何其他试剂。上述具体方案已针对短期研究（约10天）进行了优化。准确植入细胞数量至关重要，因为细胞数量过多将导致肿瘤生长加快，并可能因肿瘤负荷过大而导致动物死亡。使用200,000个MB49细胞进行灌注时，可能在第14天前需对多达25%的动物实施安乐死，以避免过度的肿瘤负荷。根据我们的经验，小鼠在12天内通常不会因肿瘤负荷而出现不良影响。除嗜睡、毛发凌乱和/或食欲减退等常规指标外，该模型中肿瘤负荷过重的表现还包括排尿困难或无法排尿。
本方案需考虑的重要事项包括实验安排。首先，MB49细胞增殖迅速，接种一百万个细胞并在植入前两天进行培养，可使细胞在灌注当天处于最佳的对数生长期。若实验所需的动物数量超过单日可完成植入的数量，则需相应地在多个不同日期分别准备MB49细胞培养物，以避免细胞过度生长。其次，在技术尚未完全熟练之前，建议使用者先以少量动物进行操作。经验丰富的操作者可在无需助手的情况下，于一天内完成6组、每组5只小鼠的植入操作（每组耗时约1.5小时，含停留时间）。然而在初期阶段，建议配备一名助手负责细...

膀胱癌是泌尿生殖道中第二常见的癌症，预计2012年将有近75,000例新发病例和15,000例死亡病例1。由于复发率高，患者需要终身随访，这使得膀胱癌成为治疗成本最高的癌症之一。已侵入肌层的膀胱癌可能通过淋巴系统转移至肝脏、肺或骨骼。晚期肿瘤的多模式治疗在5年后的生存率仅为20-40%。因此，迫切需要有效的治疗策略，以减少表浅性膀胱癌的复发和进展，并改善晚期疾病患者的治疗效果。
新型治疗手段的开发需要在初步研究后利用临床前模型来评估其有效性 体外 评估。肿瘤微环境可显著影响癌症的发展及治疗反应性，这凸显了建立肿瘤在原发器官中发生或可被植入的临床前模型的重要性。一种方法是构建转基因模型，使肿瘤能够自发产生或以器官特异性方式被诱导。近期已发表了一项优秀的转基因膀胱癌模型实验方案。2转基因模型的缺点在于肿瘤发展较慢，且均匀性不如预期。此外，还需考虑维持繁殖群体的成本。一种替代转基因模型的方法是肿瘤细胞的原位移植，其优势在于可在商品化小鼠中快速建立肿瘤。尽管某些人膀胱癌细胞系可进行原位培养（我们已成功使用UM-UC-3），但在免疫功能健全的小鼠体内建立肿瘤可能更具优势。两种可进行原位生长的鼠源性膀胱癌细胞系为MBT-2和MB49。3由于MBT-2细胞被复制型C型逆转录病毒污染4我们选择MB49细胞用于本研究。需要注意的是，MB49细胞源自雄性小鼠，而由于解剖学原因，原位移植通常在雌性小鼠中进行。这种性别差异有利于通过Y染色体标记物对植入细胞进行鉴定，但在免疫学研究中可能成为不利因素。
膀胱上皮由一层糖胺聚糖（GAG）覆盖，该层作为抵御微生物感染的屏障。这一屏障也可能干扰肿瘤细胞的植入，因此已开发出多种方法以克服这一困难（表1）。电灼术已被广泛用作物理性破坏GAG层的方法5-13，近期JoVE已发表了一项展示电灼术的实验方案14。然而，若缺乏电灼设备，也可采用化学方法破坏GAG层，例如使用硝酸银或多聚-L-赖氨酸15-24。通过膀胱短暂接触小体积硝酸银（5–10 μl，0.15–1.0 M，约10秒），或较长时间接触多聚-L-赖氨酸（100 μl，0.1 mg/ml，20分钟），均可有效建立肿瘤模型（表1）。本文描述了一种利用胰蛋白酶促进MB49细胞植入的方法。
为了改进膀胱癌的治疗策略，基因治疗已受到广泛关注。从临床角度来看，由于膀胱器官易于接触且能够实现治疗载荷的局部递送，因此是基因治疗的理想靶点。已被用于膀胱癌基因治疗研究的病毒载体包括溶瘤性单纯疱疹病毒25、逆转录病毒26、金丝雀痘病毒27、痘苗病毒、AAV以及腺病毒28。在本实验方案的第二部分中，我们描述了一种病毒递送方法，其操作过程与肿瘤细胞灌注几乎完全相同。本实验室关注的是开发新型基因递送策略，并通过使用表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体进行生物发光检测来评估其效果。然而，膀胱导管插管技术也可用于递送多种其他试剂，因此具有广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;试剂名称&lt;/p&gt; </td><td>公司</td><td>&lt;p&gt;目录编号&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;评论&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;6-8周龄雌性小鼠&lt;/p&gt; </td><td>杰克逊实验室</td><td>&lt;p&gt;品系名称：C57BL/6J&lt;/p&gt; &lt;p&gt;货号：000664&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;胰蛋白酶*&lt;/p&gt; </td><td>MediaTech</td><td>&lt;p&gt;MT25-053-CI&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DMEM*&lt;/p&gt; </td><td>MediaTech</td><td>&lt;p&gt;MT10-017-CV&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;FBS&lt;/p&gt; </td><td>Hyclone</td><td>&lt;p&gt;SH30071.03&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;热灭活&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;T25 培养瓶*&lt;/p&gt; </td><td>康宁科斯特</td><td>&lt;p&gt;Corning 编号：3056&lt;/p&gt; &lt;p&gt;Fisher: 07-200-63&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;MB49细胞&lt;/p&gt; </td><td>膀胱癌是泌尿生殖道第二常见的恶性肿瘤，亟需开发能够降低复发率和进展风险的新型治疗策略。肿瘤微环境可显著影响肿瘤的发生发展及对治疗的反应，因此在肿瘤来源的器官中培养肿瘤细胞往往具有重要意义。本实验方案描述了一种膀胱癌原位模型，通过导管将MB49小鼠膀胱癌细胞植入膀胱。该模型中成功植入肿瘤细胞需要破坏膀胱黏膜的保护性糖胺聚糖层，可通过物理或化学方法实现。在本方案中，于细胞灌注前使用胰蛋白酶处理膀胱。在肿瘤建立后，亦可通过膀胱导管递送治疗药物。本方案进一步阐述了表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体的递送方法。尽管本方案主要针对短期研究并聚焦于基因递送，但小鼠膀胱导管技术具有广泛的应用前景。</td><td>&lt;p&gt;N/A&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;由 Boehle 博士提供（参见参考文献）&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;)&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Puralube Vet 软膏*&lt;/p&gt; </td><td>Pharmaderm</td><td>&lt;p&gt;Henry Schein 公司&lt;/p&gt; &lt;p&gt;编号：036090-6050059&lt;/p&gt; &lt;p&gt;Fisher: NC9676869&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;脱毛膏：Veet&lt;/p&gt; </td><td>本地药店</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;润滑剂：&lt;/p&gt; &lt;p&gt;K-Y润滑剂&lt;/p&gt; </td><td>本地药店</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;导管*&lt;/p&gt; </td><td>Exel International</td><td>&lt;p&gt;Exel International&lt;/p&gt; &lt;p&gt;编号：26751&lt;/p&gt; &lt;p&gt;Fisher: 14-841-21&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;异氟烷&lt;/p&gt; </td><td>特雷尔</td><td>&lt;p&gt;NDC 66794-011-25&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过医院药房获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;1 ml 滑动接头结核菌素注射器&lt;/p&gt; </td><td>Becton Dickinson</td><td>&lt;p&gt;BD309659&lt;/p&gt; &lt;p&gt;Fisher:14-823-434&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;D-荧光素&lt;/p&gt; </td><td>Gold Biotechnologies</td><td>&lt;p&gt;L-123-1&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Ad-CMV-Luc&lt;/p&gt; </td><td>VectorBiolabs</td><td>&lt;p&gt;1000；请求大规模扩增并进行CsCl纯化 &lt;em&gt;在体内&lt;/em&gt; 使用&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;需要 BSL2 级防护的传染性病原体&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Steady-Glo&amp;nbsp;荧光素酶检测系统&lt;/p&gt; </td><td>普洛麦格</td><td>&lt;p&gt;E2510（10 ml）、E2520（100 ml）或 E2550（10 × 100 ml）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;*可通过多家供应商获得&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;设备&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;麻醉系统&lt;/p&gt; </td><td>E-Z Systems，Euthanex Corporation</td><td>&lt;p&gt;麻醉系统：EZ7000&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5端口小鼠再呼吸装置：EZ109&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;通过 Fisher 获得&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Xenogen IVIS 200&lt;/p&gt; </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>&lt;p&gt;http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;FLUOstar Optima&lt;/p&gt; </td><td>BMG Labtech</td><td>&lt;p&gt;http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

膀胱癌是泌尿生殖道第二常见的癌症，亟需能够降低复发和进展风险的新型治疗策略。肿瘤微环境可显著影响肿瘤的发展及对治疗的反应。因此，通常希望将肿瘤细胞培养于其起源器官中。本方案描述了一种膀胱癌原位模型，其中通过导管将MB49小鼠膀胱癌细胞灌注至膀胱内。该模型中成功植入肿瘤细胞需要破坏保护性的糖胺聚糖层，这可通过物理或化学方法实现。在本方案中，于细胞灌注前使用胰蛋白酶处理膀胱。在肿瘤建立后，也可通过膀胱导管递送治疗药物。本方案介绍了表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体的递送方法。尽管本方案已针对短期研究进行了优化，并侧重于基因递送，但小鼠膀胱导管技术具有广泛的应用前景。

植入200,000个MB49细胞后8天内，几乎所有小鼠均出现血尿。如图所示 图1，非荷瘤小鼠的膀胱重量为34.7±3.3 mg（范围31–37 mg，n=4），而植入MB49细胞的小鼠膀胱重量增至87.5±19.2 mg（范围77–120 mg，n=10），超过原重量的两倍。在基因递送方面，我们发现病毒灌注后24小时进行成像所获得的信号强于48小时后的信号图 2）。腺病毒递送在不同动物之间具有高度变异性，因此在为统计学目的规划组大小时应考虑这一因素（图2 和 3）。如果无法获得小型动物成像系统，可采用替代方法检测荧光素酶报告基因的表达，即取出膀胱组织并进行匀浆处理 体外 分析。比较 体内 使用IVIS200小动物成像系统进行分析及 体外 使用Steady-Glo试剂盒进行分析，表明数据集之间具有良好的相关性（图 3).
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将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49 膀胱癌细胞可通过膀胱内灌注在膀胱内生长。本方案展示了用于肿瘤植入和腺病毒递送的小鼠膀胱插管技术。

膀胱癌是泌尿生殖道第二常见的癌症，亟需能够降低复发率和进展风险的新型治疗策略。肿瘤微环境可显著影响肿瘤的发展及对治疗的反应，因此通常希望将肿瘤细胞种植于其来源器官中。本方案描述了一种膀胱癌原位模型，通过导管将MB49小鼠膀胱癌细胞植入膀胱。该模型中成功植入肿瘤细胞需要破坏膀胱黏膜的保护性糖胺聚糖层，此步骤可通过物理或化学方法实现。在本方案中，于细胞灌注前使用胰蛋白酶处理膀胱。当肿瘤建立后，亦可通过膀胱导管递送治疗药物。本方案进一步阐述了表达荧光素酶报告基因的腺病毒载体的递送方法。尽管本方案已针对短期研究进行优化，并侧重于基因递送，但小鼠膀胱导管技术具有广泛的应用前景。

本实验的总体目标是稳定且快速地在小鼠膀胱内诱导肿瘤形成，从而用于测试膀胱癌治疗方法。该目标首先通过导管法将癌细胞灌注至小鼠膀胱内来实现。8天后，再次进行导管操作，灌注表达荧光素酶报告基因的腺病毒。24小时后，通过荧光素酶检测法测定病毒基因表达。获得的结果可显示实现最佳基因表达的条件。该技术的可视化演示至关重要，因为导管插入和灌注步骤较难掌握，且存在损伤膀胱或导致灌注物质泄漏的风险。在进行细胞接种前两天，将1×10⁶个MB49细胞接种至T25培养瓶中，使用含10% FBS的高糖DMEM培养基。在操作当天，用DMEM基础培养基稀释无菌的0.25%组织培养级胰蛋白酶，以制备用于消化的胰蛋白酶溶液。将该溶液置于37°C水浴中预热平衡，并预热加热板，将其放置在用于输送异氟烷的麻醉系统鼻罩下方。用3%异氟烷麻醉小鼠后，将一块干净的吸水垫放在加热垫上。通过脚趾夹捏实验确认麻醉深度。将小鼠仰卧位放置在加热垫上，并连接带有2%异氟烷的鼻罩。使用无刺激性的润滑凝胶润滑一根新的无菌20G 4英寸小儿静脉导管。然后取下并丢弃固定导管接口的针头。用另一只手的拇指和食指分开小鼠的后肢，暴露尿道口。以45度角将导管轻柔插入尿道，完全插入后将角度调整为与实验台平行，以完成全部插入。轻柔提起导管，保持其与实验台平行，并目视确认导管位于尿道内而非其下方的阴道内。对剩余的麻醉小鼠重复此操作。然后将异氟烷的氟浓度降低至1%。将枪头安装到P200移液器上，通过对外部导管末端施加负压，从膀胱中吸取尿液。从导管接头处吸除残留的尿液，随后弃去尿液，导管保留在原位。小心地将80 µL预温的胰蛋白酶溶液加入导管接头中，避免产生气泡。将一个装有空气的1 CC注射器连接到导管接头，缓慢推动推杆，注入0.1至0.2 CC的胰蛋白酶至膀胱。将注射器和导管组件留置原位15分钟。为细胞移植做准备。移除先前接种的 MB 49 细胞的培养基，并向培养瓶中加入 500 微升 0.25% 胰蛋白酶。当细胞脱落时，加入 5 毫升完全 DMEM 培养基重悬细胞，取 50 微升 aliquot 进行细胞计数，同时将剩余细胞在 1000 转/分钟下离心 5 分钟，在细胞离心过程中进行后续操作。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算每毫升细胞数量以及将细胞沉淀重悬至每升含四乘以十的六次方个细胞所需的培养基体积。离心后弃去上清液，将沉淀重悬于DMEM基础培养基中。将细胞置于室温下。三胰蛋白酶处理15分钟后，将注射器从导管上取下，但保持导管原位。使用P200移液器通过抽吸去除膀胱中残留的三胰蛋白酶，并立即弃去。向导管接头中加入50微升MB49细胞悬液。然后将一支装有0.1至0.2 cc空气的注射器连接到导管接头上，通过缓慢推动活塞将细胞输送至膀胱。保持导管与注射器组件原位不动。让细胞在膀胱内停留50分钟。然后轻柔地将导管注射器组件从尿道撤出。将异氟烷浓度降至0%，并将小鼠置于加热垫上使其从麻醉状态恢复。当小鼠恢复书写反射后，将其放回笼中。注意：本方案使用腺病毒，腺病毒是一种传染性病原体，应在严格的生物安全二级（BSL-2）指南下操作。所有涉及传染性病原体的操作均经南卡罗来纳医科大学机构生物安全委员会批准。植入 MB 49 细胞后第 8 天，通过将每只小鼠置于一张白色吸水纸上并轻压腹部，使尿液滴到纸上，以检测血尿。若尿液呈粉红色至红色，表明存在血尿，提示肿瘤已形成。将腺病毒储备液置于冰上解冻，并用无菌室温 PBS 稀释至每 50 微升含 10⁹ pfu。在按照本视频前述步骤对小鼠进行麻醉、插管并排空尿液后，立即用移液器将 50 微升病毒悬液注入导管接头，然后连接一支充满空气的注射器，推动活塞将病毒输送至膀胱。保持导管-注射器装置原位，使病毒在膀胱内停留 40 分钟。然后轻柔地将导管-注射器组件从尿道中撤出，并丢弃至10%次氯酸钠溶液中，以灭活任何残留的病毒。在将小鼠放回笼子前，使其从麻醉中恢复，并标记笼子以表明小鼠已接种腺病毒；病毒将在数天内随排泄物排入笼内垫料中，因此所有接触过的笼子及垫料均需妥善处理并适当消毒。如图所示，在植入200,000个MB 49细胞后的八天内，几乎所有小鼠均会出现血尿。携带肿瘤的小鼠膀胱重量从无肿瘤小鼠的34.7±3.3毫克增加至87.5±19.2毫克，增加超过一倍。在基因递送方面，病毒接种后24小时进行成像所获得的信号强于48小时后的成像结果。腺病毒递送在不同动物之间的表达具有高度变异性，因此在为统计学目的设计分组规模时应考虑这一因素。如果无法获得小型动物成像系统，一种替代方法是取出膀胱并进行匀浆处理，以进行体外分析，如本视频所示。使用 IVUS 200 小型动物系统进行的活体分析与使用稳态发光试剂盒进行的体外分析之间的比较表明，两组数据之间具有极好的相关性。观看本视频后，您应能够充分了解如何对小鼠膀胱进行导管插管以及灌注肿瘤细胞或治疗药物。

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医学

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关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

建立原发性侵袭性原位膀胱癌异种移植模型的传统技术需要开腹手术并游离膀胱。该操作对小鼠造成显著的病痛，技术难度高且耗时。因此，我们开发了一种利用超声引导的高精度经皮穿刺方法。...

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用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

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