Name: 新生儿脑室下区电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习新生儿脑室下区电穿孔技术，通过向侧脑室注射质粒DNA并施加电流，实现神经干细胞的基因标记与操控。该方法快速高效，适用于神经发生与干细胞生物学研究。

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本研究工作得到了美国国防部（创意发展奖，W81XWH-10-1-0041，A.B.）、康涅狄格州干细胞研究基金（A.B.）以及美国国立卫生研究院NRSA 10668225（D.M.F）的资助。当前内容部分基于康涅狄格州干细胞研究资助计划下康涅狄格州政府支持的研究工作。其内容完全由作者负责，不代表康涅狄格州、康涅狄格州公共卫生部或CT Innovations公司官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

该操作程序符合耶鲁大学动物护理与使用委员会（IACUC）的要求。科研人员应确保根据所在机构的规定，获得并遵循IACUC指南的批准。
1. 第1节 DNA、溶液和玻璃移液管的制备
<ol>
 <li>制备高纯度（OD 260/280 &gt; 1.80）、高浓度（μg/μl &gt; 2.5）且无内毒素的DNA。</li>
 <li>配制0.9%生理盐水溶液，并通过22 μm滤膜进行无菌过滤。</li>
 <li>将10 cm长的火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）放入Narishige PP-830型PC-10玻璃微电极拉制仪中，使用kanthal金属丝。设置拉制仪在70.5 °C条件下进行单步加权拉制。用圆头镊子折断尖端，并在解剖显微镜下检查是否有毛刺边缘。对尖端进行斜面打磨，并置于紫外灯下照射15分钟。拉制后的移液管应在距尖端边缘2 mm处做标记。</li>
 <li>通过将无菌过滤的0.9%生理盐水溶液与干燥的快绿粉末混合，配制0.1%（质量/体积）的快绿溶液。</li>
</ol>
2. 第2节 动物准备、玻璃微电极填充与质粒注射
<ol>
 <li>将出生后第0-1天的幼鼠从鼠笼中单独取出，置于预先冷却至4 °C的玻璃培养皿上，然后放置于湿冰上。</li>
 <li>约5分钟后，通过足部夹捏反应判断麻醉状态。若无肢体活动，则对幼鼠进行脑室内注射。</li>
 <li>需注意，快绿染料、DNA与生理盐水混合液可能导致玻璃移液管迅速蒸发、结晶并堵塞。因此，应在注射前立即配制储备液，并将1-2 μl分装至石蜡膜上。</li>
 <li>用拉制的玻璃移液管吸取全部分装体积。</li>
 <li>用非优势手的拇指和食指固定幼鼠头部。</li>
 <li>打开光源，将幼鼠头部置于光束外侧。必要时在头部滴加生理盐水，以减少光线反射。此时脑室区域应被照亮。</li>
 <li>用优势手将针头插入靠近操作者一侧的侧脑室（图1A和1B）。注射位点应大致等距于人字缝与眼睛之间，并位于矢状缝外侧约2 mm处。对于P0幼鼠，将拉制的移液管插入至2 mm刻度处，以确保进入侧脑室。有时可观察到因颅内压释放导致脑脊液回流至移液管内。为降低颅内压（有助于质粒注射），可适当放松对幼鼠头部的握持。第2.8步：使用气压注射仪（Picospritzer, Parker）向侧脑室内注射约0.5 μl质粒。</li>
</ol>
3. 第3节 电穿孔与恢复
<ol>
 <li>将电穿孔仪的电压设置为5次方波脉冲，每次脉冲50毫秒，电压100伏，脉冲间隔950毫秒。质粒电穿孔的空间特异性由电荷转移的方向性决定。由于侧脑室下区（SVZ）干细胞群体具有异质性，需特别注意电极放置位置8。已发现腹侧-背侧及头侧-尾侧区域在细胞增殖速率和细胞命运方面存在差异9,10。</li>
 <li>质粒注射完成后，将镊形电极浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。此步骤旨在最大化电荷传递效率，并防止因电阻导致组织灼伤。</li>
 <li>将正极电极置于与质粒注射部位同侧的幼鼠耳部附近的背外侧壁（图1C 和 1D）。将负极电极置于对侧半球幼鼠吻部腹外侧位置。</li>
 <li>通过踩下脉冲脚踏开关启动电流传递，并以约25°的角度间隔，将电极从背侧向外侧方向扫过。</li>
 <li>将完成电穿孔的幼鼠置于加热垫上5分钟。每隔30秒轻柔地翻转幼鼠，并给予轻微刺激。</li>
</ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

作者无任何披露事项。

本文详细介绍了新生小鼠侧脑室下区（SVZ）电穿孔技术，该技术可用于快速、高效地标记并操控SVZ干细胞及其子代细胞。与其他方法相比，电穿孔具有多项优势。第一，由于细胞标记具有局灶性，因此能够区分细胞自主性与非细胞自主性效应。第二，利用可诱导系统进行遗传操作，可比较突触整合前或整合后的影响。此外，可通过向表达CRE的转基因小鼠电穿孔含有loxP位点的质粒，从而避免使用多种质粒。第四，可使用基因报告质粒研究转录激活作用；此时，仅在被操作的细胞中测量转录活性，若结合显微解剖特定亚区，还可进一步提高特异性。第五，由于持续增殖和质粒稀释，迁移放大细胞（transit amplifying cells）呈现短暂标记，该特性可作为类似胸苷类似物标记的“出生日期”（birthdating）方法11。第六，尽管细胞的短暂标记可能被视为缺点，但该技术可通过转座酶-转座子系统实现基因组整合，从而克服此局限13。此外，也可利用CRE重组酶改变持续的神经发生过程，对loxP位点侧翼包围等位基因的小鼠实现基因组修饰7,11。采用本方案，在Rosa26R-Stop-tdTomato小鼠中，可在电穿孔后长...

<table><tbody><tr><td>重抛光硼硅酸盐玻璃管</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>双级玻璃微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Fischer Scientific</td><td>0521192205</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 方波脉冲发生器</td><td>哈佛仪器公司</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>镊状电极（Tweezertrodes）</td><td>哈佛仪器公司</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>钨卤素灯</td><td>USHIO America, Inc</td><td>1002247</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II 微量压力注射仪</td><td>Parker Instruments</td><td>052-0312-900</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠侧脑室下区电穿孔技术

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

神经干细胞（NSCs）排列于出生后侧脑室壁，可分化为多种细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和室管膜细胞1理解负责神经干细胞自我更新、定型与分化的分子通路，对于发挥其修复大脑的独特潜力以及更深入地认识中枢神经系统疾病至关重要。以往对哺乳动物系统的操控方法需要在整体动物水平上进行耗时且昂贵的基因工程操作2因此，绝大多数研究都探讨了NSC分子的功能 体外 或在无脊椎动物中。
本文展示了操作新生神经前体细胞（NPCs）的一种简单快速的技术，称为新生期侧脑室下区（SVZ）电穿孔。类似的技術在十年前已開發，用於研究胚胎期神经干细胞（NSCs），並促進了皮層發育相關研究3,4。近年來，該技術被應用於研究出生後嚙齒類前腦5-7。此技術可實現對SVZ神經幹細胞及其子代細胞的高效標記。因此，出生後SVZ電穿孔為哺乳動物神經幹細胞的基因工程提供了成本低、耗時短的有效替代方案。

新生小鼠侧脑室下区电穿孔可导致毗邻背侧、背外侧和外侧侧脑室下区的几乎所有放射状胶质细胞被标记，此过程需使用镊形电极进行“扫掠”移动（图1E）。然而，电穿孔操作可根据具体实验需求进行调整，例如不进行电极扫掠动作，并按照视频中详述的特定位置和方向进行电极放置。例如，由于位于背侧的放射状胶质细胞与衬于脑室侧壁的放射状胶质细胞存在差异，研究者可选择仅对单一区域进行电穿孔9,10。此外，使用更小的电极还可进一步提高靶向特异性。
质粒DNA在最初的三周内会迅速被稀释11。因此，不建议使用质粒DNA来鉴定基因组修饰的细胞。为了克服这一局限性，可将表达CRE重组酶的质粒与GFP一同导入小鼠体内，这些小鼠在基因组表达的荧光蛋白（tdTomato）上游含有一段被lox P位点包围的终止序列12。发生重组后，终止序列被移除，荧光蛋白得以表达（图1F）。电穿孔四星期后，脑室下区中表达GFP质粒的细胞已很少见，而表达tdTomato的细胞则明显更多。对嗅球进行切片观察也显示，...

我们展示了一种被称为新生鼠侧脑室下区电穿孔的微创技术。该技术包括将质粒DNA注射到新生幼鼠的侧脑室内，并施加电流以递送并遗传操控神经干细胞

神经干细胞（NSCs）排列于出生后侧脑室壁，可分化为多种细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和室管膜细胞……

本实验的目的是对脑室下区神经干细胞的分子组分进行遗传标记和操控。首先将装有DNA的玻璃移液管插入出生后第零天（P zero）小鼠的侧脑室，实现DNA递送。第二步是将DNA注入侧脑室的脑脊液中。随后对小鼠施加电流，从而使DNA转移至侧脑室壁上的神经干细胞内。最终，通过结合多种分子技术，包括免疫组织化学、分子生物学、显微镜技术以及电生理学，来观察脑室下区神经干细胞在命运决定、增殖、迁移和成熟过程中的变化。新生儿脑室下区电穿孔技术有助于回答神经发生领域中的关键科学问题，例如哪些分子通路负责调控神经干细胞及其子代细胞的增殖、分化、迁移和成熟。与现有的转基因小鼠等方法相比，该技术的主要优势在于能够以高效、经济的方式快速且高效地标记脑室下区（SVZ）的神经干细胞。首先，确保用于电穿孔的 DNA 具有高纯度和高浓度，并且不含内毒素。将 10 厘米长的火焰抛光 BO 二氧化硅玻璃毛细管拉制成移液管。此处使用 PP eight 30 ghhi PC 10 型移液管拉制仪，设置为在 70.5 °C 下进行一步加权拉制。拉制完成后，使用环形镊子折断尖端。然后在解剖显微镜下检查移液管，确保无锯齿状边缘。如有需要，可使用磨石对尖端进行斜面处理。接着将制备好的移液管置于紫外灯下照射15分钟。15分钟结束后，用细头记号笔在移液器尖端边缘向上2毫米处做标记。最后，通过将无菌过滤的0.9%无菌生理盐水与干燥的快绿染料混合，配制0.1%（重量/体积）的快绿溶液。取出生0至1天的幼鼠，将其置于预先冷却至4摄氏度并放置在冰上的玻璃培养皿中。约5分钟后，通过脚趾夹捏反应判断麻醉状态。若未观察到任何运动，则开始心室内注射。将快绿溶液与DNA溶液混合，并取一到两微升分装至生物膜上。此步骤需在注射前立即进行，因为快绿溶液与DNA混合后可能导致迅速蒸发和结晶，进而堵塞玻璃移液管。用微量移液器吸取全部分装体积，并将玻璃移液管装入气压注射仪中。现在，用非优势手的拇指和食指轻轻夹住幼鼠的头部并固定。然后打开光源，将幼鼠头部置于光束外侧。若脑室不清晰可见，可用无菌生理盐水润湿头部，以减少头皮反射的光线。接下来，使用惯用手将针头插入同侧侧脑室。注射部位应大致位于枕额缝与眼睛之间等距处，并在矢状缝外侧约2毫米处。将拉制的移液管插入至2毫米刻度处，直至出现P0爆破感，以确保进入侧脑室。由于颅内压释放，可能会发生脑脊液回流至移液管内。若出现此情况，可松开对POP头部的握持以降低压力，从而辅助质粒的注射。当移液管达到最佳插入位置后，向侧脑室注射约0.5 µL质粒。将电穿孔仪的电压设置为 100 伏，施加五个方波脉冲，每个脉冲持续 50 毫秒，脉冲间隔为 50 毫秒。等离子体电穿孔的空间特异性由电荷转移的方向决定，因此在电极放置时需考虑空间布局，因为侧脑室下区（SVZ）的细胞类型具有高度多样性。已有研究报道，在腹侧至尾状核（CAU）区域，细胞命运和增殖能力均发生了变化。注射质粒后，将镊子电极浸入PBS中，以最大化电荷转移并有助于防止因电阻引起的灼伤。接着，将正极电极置于靠近耳部的颅骨背外侧壁，并将电极侧向浸入细胞质进行注射。然后，将负极电极置于对侧半球吻部腹外侧。该图显示了注射后幼鼠上负极和正极相对于 x、y、z 轴的正确方位。通过踩下脉冲脚踏开关启动电流传递，并以约 25 度的角度间隔将电极从背侧扫向侧方。电穿孔完成后，将所有经过电穿孔处理的幼鼠置于加热垫上五分钟。每30秒轻轻旋转幼鼠并给予轻度刺激。该图像显示新生小鼠在转染编码EGFP的载体并进行电穿孔后24小时的侧脑室。经电穿孔的细胞呈现绿色荧光。在此图中，我们看到在将 Cre 重组酶和编码 GFP 的质粒电穿孔转入携带上游 TD Tomato 终止序列的小鼠体内 28 天后，侧脑室（LV）被标记。重组诱导了红色所示的 TD Tomato 表达；由于质粒的连续稀释，少数残留的 SVZ 细胞呈 EGFP 阳性，而基因组表达的 TD Tomato 则持续稳定表达。质粒 DNA（绿色所示）的稀释效应明显，因为在嗅球颗粒层（OB）中标记的细胞更多表达了基因组标记物 TD Tomato（红色所示）。观看本视频后，您应能充分理解如何对 SVZ 来源的干细胞进行标记与操作。

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