新生儿脑室下区电穿孔
2013年2月11日
我们展示出一种微创技术，新生儿脑室下区电。该技术包括新生幼崽的侧脑室注射质粒DNA和通电时提供神经干细胞和基因操纵
该程序的目的是对脑室下区神经干细胞的分子成分进行基因标记和作。这是通过首先将装有 DNA 的玻璃移液器插入 P zero P 的侧脑室来实现的，第二步是将 DNA 排出到侧脑室的脑脊液中。下一个电流施加到 P.这允许将 DNA 转移到侧脑室内衬的神经干细胞。
最终，包括免疫组织化学、分子生物学、显微镜和电生理学在内的分子技术的组合被用于可视化脑室下区神经干细胞的命运变化、增殖、迁移和成熟。新生儿脑室下区电穿孔可以帮助回答神经发生领域的关键问题，例如哪些分子通路负责调节神经元干细胞及其后代的增殖、分化、迁移和成熟。与现有方法（如转基因小鼠）相比，该技术的主要优点是它允许以高效且具有成本效益的方式快速、稳健地标记 SVZ 的神经元干细胞。
首先，确保用于电纯化的 DNA 具有高纯度和高浓度，并且不含内毒素。将 10 厘米火抛光 BO 硅胶玻璃毛细管拉入移液器中。这里使用了一个 PP 8 30 ghhi PC 10 移液器拉拔器，用于在 70.5 摄氏度下拉动一步加重拉力拉动移液器后，使用圆形镊子折断吸头。
然后在解剖显微镜下检查移液器，以确保没有锯齿状边缘。如果需要，可以使用磨石对尖端进行斜切。接下来，将倒入的移液器置于紫外灯下 15 分钟。
15 分钟过后，用细吸头记号笔在移液器上距离吸头边缘 2 毫米处做标记。最后，通过将无菌过滤的 0.1% 无菌盐水与干燥、快速的绿色麻醉剂混合，制备每体积 0.1 重量的固绿溶液。一只 0 到 1 天大的幼犬，一个预先冷却至 4 摄氏度并放在西冰上的玻璃培养皿大约 5 分钟后，利用足部捏合反应确定麻醉状态。
如果没有运动，则开始脑室内注射。将 Fast Green 溶液与 DNA 溶液混合，将 1 至 2 μL 分装到生物膜上。重要的是在注射前完成此作，因为快速绿色溶液与 DNA 的结合会导致快速蒸发和结晶，随后会阻塞玻璃移液器，用缩微胶片注射器吸出整个等分试样体积，并将玻璃移液器加载到充气注射器上。
现在，用最后一只惯用手的拇指和食指轻轻抓住并握住幼犬的头部。然后打开灯，将小狗的头放在光束外。如果心室不清晰可见，请用无菌盐水润湿头部，以帮助减少头皮反射的光量。
接下来，用惯用手将针头插入近侧侧脑室。注射部位应与 OID 缝合线和眼睛的距离大致相等，并且矢状缝线外侧 2 毫米。将拉出的移液器插入 2 毫米标记处以产生 P 零爆裂声，这应确保穿透侧脑室。
由于颅内压的释放，可能会发生 CSF 回注到移液器中的情况。如果发生这种情况，请松开对 POP 头部的握把以降低压力并协助注射质粒。一旦移液管最佳插入，将大约 0.5 微升质粒注射到侧脑室中。
将电动作发电机的电压设置为 5 个方脉冲、每个脉冲 50 毫秒和 100 伏特（间隔 50 毫秒）。等离子体电作的空间特异性由电荷转移的方向给出，因此考虑到 SVZ 电池的多样性，应考虑电极的位置。人们报告了 CAU 位置腹背侧细胞命运和增殖的变化。
注射质粒浸渍后，镊子电极进入 PBS 中，以最大限度地提高电荷转移并有助于防止电阻率引起的灼伤。接下来，将正电极放在靠近耳朵的颅骨背侧壁上，并将外侧浸入细胞质注射。然后将负极放在对侧半球腹侧，靠近弹出鼻子。
该图显示了负极和正极相对于注射幼崽上 x、y、Z 轴的正确方向。通过踩下脉冲脚踏开关踏板启动电流传输，并使用大约 25 度的角度间隔从背侧到侧面扫动电极。电穿孔完成后，将所有电穿孔的幼崽放在加热垫上 5 分钟。
在轻微刺激下每 30 秒轻轻旋转幼崽。该图像显示了 EGFP 编码载体电穿孔 24 小时后新生小鼠的侧脑室。电额定电池发出绿色荧光。
在这里，我们看到标记的侧脑室在将 Cree 重组酶和 GFP 编码质粒电穿孔 28 天后，将编码质粒的小鼠电穿孔到 TD 番茄上游，在 TD 番茄重组的上游诱导 TD 番茄的表达，以红色显示，质粒的连续稀释导致很少剩余的 EGFP 阳性 SVZ 细胞或基因组表达的 TD 番茄永久表达。质粒的稀释，DNA 以绿色显示是明显的，因为在标记为 OB 的嗅球颗粒细胞层中有更多的细胞表达了以红色显示的基因组标记 TD 番茄。观看此视频后，您应该对如何从 SVZ 标记和作干细胞有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种被称为新生儿亚室带电穿孔的微创技术，该技术允许对新生儿幼犬的神经干细胞进行基因操作。该方法涉及将质粒DNA注射到侧脑室并施加电流以促进细胞对DNA的摄取。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因工程
- 干细胞研究
背景
- 亚室带（SVZ）中的神经干细胞对神经发生至关重要。
- 传统的基因操作方法可能耗时且成本高昂。
- 这种技术为标记和研究这些细胞提供了一种快速有效的替代方法。
- 电穿孔增强了DNA进入细胞的效率，改善了实验结果。
研究目的
- 对SVZ神经干细胞的分子成分进行基因标记和操作。
- 调查调节干细胞行为的分子通路。
- 提供一种用于研究神经发生的成本效益高的方法。
使用的方法
- 使用玻璃微管注射质粒DNA到侧脑室。
- 施加电脉冲以促进神经干细胞对DNA的摄取。
- 使用免疫组化和显微镜观察细胞行为的变化。
- 监测电穿孔后细胞的命运、增殖、迁移和成熟。
主要结果
- 成功地用荧光标记物标记了SVZ神经干细胞。
- 证明了细胞命运和增殖在电穿孔反应中发生了变化。
- 提供了关于控制神经发生的分子机制的见解。
- 突出了该技术相对于传统基因操作方法的优势。
结论
- 新生儿亚室带电穿孔是神经科学研究的宝贵工具。
- 该方法允许对神经干细胞进行高效的基因操作。
- 它为研究神经发生动力学和干细胞生物学开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Neonatal subventricular zone electroporation enables rapid, cost-effective genetic manipulation of neural stem cells, supporting early-stage target validation in neurogenesis research. The technique provides a scalable alternative to transgenic models, reducing time and resource investment in preclinical target de-risking. It enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of molecular pathways in a disease-relevant postnatal mammalian system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of molecular pathways regulating neural stem cell proliferation, differentiation, migration, and maturation.
- Operational Value: Provides rapid, robust labeling of SVZ neural stem cells and progeny for downstream phenotypic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable cellular readouts via immunohistochemistry, microscopy, and electrophysiology to evaluate genetic manipulations.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible electroporation parameters and consistent DNA delivery to the lateral ventricle.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a postnatal rodent forebrain model.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of electroporated cells and their progeny, supporting biomarker-aligned outcome assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven manipulation of neural stem cells prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports target validation through direct genetic manipulation of SVZ neural stem cells and quantification of fate, proliferation, migration, and maturation changes.
- Screening: Delivers standardized, reproducible transfection efficiency for consistent compound or genetic perturbation screening in neural stem cell-derived systems.
- Analytics: Generates multiplexed readouts (fluorescent labeling, electrophysiological migration, immunohistochemical maturation) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity via permanent genomic reporters (e.g., TD tomato) and dilution-tracked plasmid expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genetic constructs and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of stem cell behavior changes in an intact neonatal niche.
- Operational Value: Standardization via defined electroporation parameters (5 pulses, 50 ms, 100 V) and reproducible DNA injection volumes (0.5 µL).
- Strategic Value: Reduced biological risk in go/no-go decisions by enabling rapid, cost-effective target de-risking versus transgenic model generation.
- Portfolio Impact: Accelerates prioritization of neurodevelopmental targets by providing early functional evidence in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Required expertise in neonatal pup handling, microsurgery, and electrophysiology-based injection techniques.
- Need for precision instrumentation including pipette pullers, microinjectors, and electroporation generators with pulse control.
- Standardization of DNA preparation (high purity, endotoxin-free, optimal concentration) and electrode placement for consistent charge transfer.
- Adaptation considerations across rodent strains and developmental timepoints (P0-P1) to maintain ventricular access and cell targeting efficiency.
- Practical limitations include variable transfection efficiency due to ventricular anatomy and CSF dynamics, requiring operator training for reproducibility.
