Name: 线粒体相关的ER膜（MAMS）和鞘糖脂丰富的微区（GEMS）:分离小鼠脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习从小鼠脑中分离线粒体相关内质网膜（MAMs）和鞘糖脂富集微区（GEMs）的方法。该实验流程包括解剖、匀浆、离心和密度梯度分离技术，为神经生物学研究提供可靠的细胞组分分离方案。

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我们感谢 Renata Sano 在最初方案设计中的贡献。A.d’A. 担任珠宝商为儿童基金会（Jewelers For Children, JFC）资助的遗传学与基因治疗讲席教授。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，基金号为 GM60905、DK52025 和 CA021764，以及美国黎巴嫩叙利亚联谊会（ALSAC）提供支持。

以下方案旨在从小鼠脑组织中分离和纯化MAMs与GEMs。
分离线粒体、线粒体相关内质网膜（MAM）和脂筏微结构域（GEM）所需的溶液。
差速离心法获得粗线粒体组分：
溶液 A： 0.32 M 蔗糖，1 mM NaHCO3，1 mM MgCl2，0.5 mM CaCl2 + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。
溶液B： 0.32 M 蔗糖，1 mM NaHCO3 + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。
线粒体相关内质网膜（MAMs）的分离：
分离培养基： 250 mM 甘露醇，5 mM HEPES（pH 7.4），0.5 mM EGTA，0.1% BSA。
梯度缓冲液： 225 mM 甘露醇，25 mM HEPES pH 7.5，1 mM EGTA，0.1% BSA（终浓度）。
GEMs 分离：
GEM 提取缓冲液： 25 mM HEPES pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。
GEM 溶解缓冲液： 50 mM Tris-HCl，pH 8.8，5 mM EDTA，1% SDS + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。
1. 第一步 亚细胞分级分离：去除细胞核、未裂解细胞及细胞碎片
<ol>
 <li>在 CO2 麻醉舱中处死小鼠。</li>
 <li>立即取出脑组织，沿中线切开为两半，放入预冷的 2 ml 离心管中，置于冰上并称重。</li>
</ol>
注意：在整个操作过程中，保持脑半球的分离。以下步骤适用于单侧脑半球的处理。
<ol start="3">
 <li>将半侧脑组织放入预冷的 2 ml 玻璃Dounce组织研磨器中，内含 1 ml 冷的溶液A。用大间隙研棒共进行 15 次研磨匀浆。</li>
 <li>转移至一个 15 ml Falcon管中，置于冰上，并将匀浆液用溶液A稀释至原始重量/体积的10倍，例如 0.225 g 样品加至 2.25 ml。</li>
 <li>在 4 °C 下以 1,400 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>小心吸除上清液，并转移至一个 30 ml 圆底玻璃离心管中，置于冰上。注意不要扰动沉淀。</li>
 <li>将沉淀用相同体积（10倍 w/v）的 溶液A 重悬。使用同一研磨器，每次加入 1 ml 溶液，用小间隙研棒研磨 3–6 次。</li>
 <li>转移至一个新的 15 ml Falcon管中，在 4 °C 下以 710 × g 离心 10 分钟。此步骤将获得含有 细胞核和细胞碎片 的沉淀。</li>
 <li>小心吸除上清液，并与步骤 1.6 中保留的上清液合并。</li>
</ol>
2. 第二步：粗线粒体分离
<ol>
 <li>在 4 °C 条件下，以 13,800 × g 离心上清液 10 分钟。</li>
 <li>将上清液转移至冰上的 Ultra-Clear Beckman 离心管中。</li>
 <li>用 10 倍体积的 溶液 A 重悬沉淀。使用相同的研磨器，以小间隙研杵分次（每次 1 ml）进行 3–6 次研磨，充分匀浆。</li>
 <li>参照步骤 2.1 进行离心。</li>
 <li>重复步骤 2.2–2.4。</li>
 <li>所得沉淀为富集的线粒体组分。收集上清液（胞质溶胶和内质网组分），用封口膜封住管口，置于冰上保存。</li>
 <li>在新的匀浆器中，用 4.8 ml/g（g 指原始脑组织重量）的 溶液 B，以小间隙研杵研磨 6 次，重悬沉淀。</li>
 <li>使用玻璃巴斯德吸管，在 Ultra-Clear Beckman 离心管中制备不连续蔗糖梯度，按以下顺序小心地依次从管底加入各溶液，注意避免产生气泡： 
 重悬的沉淀（0.32 M 蔗糖） 
 3 ml 850 mM 蔗糖（溶于 1 mM NaHCO3） 
 3 ml 1 M 蔗糖（溶于 1 mM NaHCO3） 
 3 ml 1.2 M 蔗糖（溶于 1 mM NaHCO3）</li>
 <li>在 4 °C 条件下，以 82,500 × g 离心 2 小时。梯度离心结束后将形成三条条带和一个沉淀：1）髓鞘及其他膜污染物（0.32 M – 0.85 M 界面）；2）内质网、高尔基体和质膜（0.85 M – 1 M 界面）；3）突触体（1 M – 1.2 M 界面）；4）粗制线粒体（沉淀），用于后续纯化步骤</li>
</ol>
3. 线粒体相关内质网膜（MAMs）的分离
<ol>
 <li>用含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的 2 ml 分离介质，重悬从一个脑半球新鲜分离的粗线粒体。
 </li>
 <li>使用 Gradient Buffer 为每半个脑组织制备 30% Percoll 梯度，共 8 ml，并置于 Ultra-Clear Beckman 离心管中。</li>
</ol>
* 注意：为在将Percoll稀释至30%后达到正确的终浓度，需将梯度缓冲液配制成更高浓度（1.43倍）。
<ol start="3">
 <li>将线粒体悬液缓慢地铺加到已制备好的梯度液顶部，避免产生气泡。</li>
 <li>在 4 °C 条件下，以 95,000 × g 离心 30 分钟。</li>
 <li>
 <ol class="lroman">
 <li>首先用玻璃巴斯德吸管小心吸出重组分（下层条带），转移至预冷的新离心管中，置于冰上。</li>
 <li>再用另一支玻璃巴斯德吸管吸出轻组分（上层条带），转移至另一预冷的新离心管中，置于冰上。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将步骤 3.5 中收集的两组分分别用 10 ml 分离培养基稀释，并在 4 °C 条件下以 6,300 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>弃去步骤 3.6 中获得的重组分上清液，将沉淀用另 10 ml 分离培养基重悬，再按步骤 3.6 重新离心。所得沉淀即为纯化的线粒体组分。</li>
 <li>将步骤 3.6 中获得的轻组分上清液转移至冰上的 Ultra-Clear Beckman 离心管中，弃去沉淀。</li>
 <li>向步骤 3.8 中获得的上清液中加入足量分离培养基以充满离心管，在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 1 小时。所得沉淀即为MAMs 组分。小心移除并弃去上清液。</li>
</ol>
注意：在此步骤中，您也可以将步骤 2.6 中保存的上清液在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 1 小时。沉淀物为内质网组分，上清液为胞质组分。
4. 糖鞘脂富集微区（GEMs）的提取
<ol>
 <li>在冰上用 500 μl–1 ml 裂解缓冲液裂解纯化的线粒体和/或 MAM 组分，持续 20 分钟。</li>
 <li>在 4 °C 条件下，以 15,300 × g 离心裂解物 2 分钟。</li>
 <li>收集上清液（Triton X-100 可溶性组分），并将沉淀再次离心 2 分钟，以去除残留的可溶性物质（即 Triton X-100 提取的线粒体和/或 Triton X-100 提取的 MAMs）。</li>
 <li>用溶解缓冲液溶解沉淀。此溶解后的组分代表 GEM 组分，可用于后续分析。</li>
</ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
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<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
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</ol>

所有作者均无任何利益冲突需要声明。

细胞内膜之间或细胞器与细胞质膜之间的接触位点，构成了基本细胞过程的动态信号平台。准确表征这些位点在生理和病理条件下的功能与组成，需要可靠且可重复的纯化方案。本文详细描述的方法由本实验室专门优化，用于从小鼠成年脑组织中分离和纯化线粒体相关内质网膜（MAMs）及其相应的脂筏微区（GEMs）。该方案已成功应用于鉴定决定这些微区特性的分子效应因子，并揭示在儿童神经退行性代谢疾病中，由 Ca2+ 失衡引发的神经元细胞死亡的凋亡通路下游机制4。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;分级分离&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;MAM&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-250G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分，热激，冻干粉</td><td>Roche</td><td>03-116-964-001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;GEM&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Roche</td><td>03-118-142-001</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;通用&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂，Complete，无EDTA</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>2 ml 全玻璃杜氏组织研磨器</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0002</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯圆底离心管，BD Falcon</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 圆底玻璃离心管</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 圆底玻璃离心管</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-15</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管，Ultra-Clear，薄壁，14x89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cole-Parmer</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管，9&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr></tbody></table>

线粒体相关内质网膜（mams）和糖鞘脂富集微区（gems）：从小鼠脑组织中分离

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

细胞内细胞器是高度动态的结构，其形态和组成各异，并受到细胞特异性的内在和外在信号调控。这些细胞器的膜常在特定的接触位点相互毗邻，形成信号分子和膜组分交换的枢纽。1,2,3,4内质网（ER）与线粒体在IP3敏感性Ca通道开口处形成的细胞器间膜微区2+ 通道被称为线粒体相关内质网膜（MAMs）4,5,6这些膜接触位点的蛋白质/脂质组成及其生物化学特性已被广泛研究，尤其是在其调控细胞内 Ca 的作用方面2+ 4,5,6内质网是细胞内钙离子的主要储存场所2+，并以此调控钙信号下游的多种细胞过程2+ 信号转导，包括翻译后蛋白质折叠和蛋白质成熟7。另一方面，线粒体维持 Ca2+ 通过缓冲细胞质中的 Ca 维持稳态2+ 浓度，从而阻止钙离子下游凋亡通路的启动2+ 不平衡4,8. MAMs 的动态特性使其成为解析包括 Ca 在内的基本细胞机制的理想位点2+ 线粒体钙信号传导与调控2+ 浓度、脂质生物合成与转运、能量代谢及细胞存活 4,9,10,11,12已有多种方案用于从肝组织和培养细胞中纯化这些微结构域13,14. 
在参考已有发表方法的基础上，我们改进了一种从成年小鼠脑组织中分离线粒体及线粒体相关内质网膜（MAM）的实验方案。在此基础上，我们增加了一个额外的纯化步骤，即Triton X100提取法，从而能够分离出MAM中富含糖鞘脂的微结构域（GEM）组分。这些GEM组分与来源于质膜或其他细胞内膜的小窝（caveolae）和脂筏（lipid rafts）具有多种相同的蛋白质成分，被认为在受体蛋白的聚集以及蛋白质-蛋白质相互作用过程中发挥聚集平台的功能4,15。

根据我们使用该方案的经验，我们可安全地推荐其用于从小鼠脑组织中分离和纯化线粒体相关内质网膜（MAMs）、糖脂微区（GEMs）以及线粒体组分。本方案所述操作步骤具有高度的可重复性和一致性。在图1中，我们展示了纯化线粒体和MAMs在Percoll梯度中分层的代表性图像（步骤3.4）。在超速离心管底部可见一条界限清晰、呈乳白色条带，其中含有纯化的线粒体（Mito-P）；而MAM组分则位于线粒体条带上方，表现为一条弥散且较宽的条带。在仔细回收各梯度条带后，将纯化的组分重悬于裂解缓冲液中，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转印至PVDF膜上。随后使用一系列针对特定蛋白标志物的抗体进行杂交，以确认各组分的纯度及其蛋白组成。图2A展示了细胞质、内质网（ER）和线粒体标志物在分离得到的MAMs和线粒体组分中的分布情况。纯化的线粒体制备物应不含内质网和细胞质标志物。由于MAM接触位点处内质网膜与线粒体膜紧密相邻，因此在这些纯化样品中可同时检测到钙连蛋白（calreticulin，ER标志物）和Tom-20（线粒体标志物）。此外，也可使用MAMs特异性标志物FACL4和PACS2，以及...

本实验步骤介绍了如何从成年小鼠脑组织中分离线粒体相关内质网膜（MAMs），以及从MAMs和线粒体组分中提取糖鞘脂富集的微结构域组分。

线粒体相关内质网膜（MAMs）和糖鞘脂富集微区（GEMs）：从小鼠脑组织中分离

细胞内细胞器是具有多变形态和组成的高度动态结构，会受到细胞特异性的内在和外在因素影响……

本实验的总体目标是从小鼠脑组织中分离线粒体、内质网膜、微结构域或线粒体相关内质网膜（MAMs），并对纯化的MAMs进一步提取，以获得富含糖脂筏微结构域组分（gems）。首先解剖获取小鼠脑组织，随后使用Dounce匀浆器在特定缓冲液中进行匀浆。将所得匀浆液进行低速离心，以去除细胞核、完整细胞及碎片。第二步是制备粗线粒体组分。通过将上清液进一步离心，所得沉淀重悬后利用不连续蔗糖梯度进行进一步分离。接着，将粗线粒体组分加样至 Percoll 梯度中。经过离心和多次洗涤步骤后，获得纯化的线粒体组分和线粒体相关内质网膜（MAMs）。最后一步是用含有TRITON X-100的溶液处理MAMs，以提取富含糖脂的微结构域组分gem。最终，通过使用针对各细胞器组分特异性蛋白标志物的抗体进行蛋白质印迹分析，验证各组分的纯度。该方法相较于现有方法的主要优势在于，它已针对成年小鼠脑组织中线粒体、mam 和 gem 组分的分离进行了优化，且仅需使用相对少量的实验材料。此优化后的流程具有高度可重复性，能够分离出足量的不同细胞器组分，供研究人员使用，尤其适用于神经生物学领域的研究者。为分析其目标蛋白，本实验操作将由我实验室的一名技术员 a a 进行演示。从经二氧化碳安乐死的小鼠体内取出脑组织后，首先将脑组织沿中线切为两半。将每半脑组织分别放入预冷的2毫升离心管中，并置于冰上。使用一个空的预冷2毫升离心管对天平进行归零，称量各管重量，并继续将样品置于冰上保存。将一半脑组织转移至预冷的2毫升玻璃玻璃匀浆器中，内含1毫升冰冷的分级分离溶液。使用大间隙研杵匀浆，共15次。将匀浆液置于冰上的无菌15毫升Falcon管中，并根据样品重量，用冰冷的分级分离溶液A稀释至总体积的10倍。然后在4℃条件下，以1,400 × g离心10分钟。小心移除上清液，注意不要扰动沉淀，将其转移至预冷的30毫升圆底玻璃离心管中，并置于冰上。接着，用相同体积的10倍裂解液重悬沉淀。将重悬的沉淀物在同一个研磨器中逐毫升进行匀浆，每次使用小间隙研杵研磨3到6次。将匀浆液收集至15毫升Falcon管中，在4°C条件下以710 × g离心10分钟。这将产生凋亡小体和细胞碎片。小心移除上清液，并与之前离心步骤中保留的上清液合并，用于开始线粒体分离：将S上清液在4°C条件下以13,800 × g离心10分钟。然后将沉淀物转移至预冷的UltraClear Beckman离心管中，并置于冰上。将含有线粒体组分的沉淀重悬于10倍体积的分级溶液A中，每次处理1毫升。此次使用小间隙Pele匀浆器进行3至6次匀浆，并将匀浆液收集至冰上新的30毫升圆底玻璃离心管中。再重复上述步骤一次，以进一步纯化样品。将匀浆离心。吸取S上清液，并将细胞沉淀物重悬于A溶液中，每10体积溶液中一次处理1毫升，重新匀浆。下一步是将含有富集线粒体组分的沉淀物按每克原始脑组织重量加入4.8毫升的B分离溶液，使用间隙较小的研杵在新的匀浆器中研磨6次，将此匀浆液置于冰上保存。然后在UltraClear Beckman离心管中制备不连续蔗糖梯度。首先，加入重悬的染料，然后依次加入 3 毫升 850 毫摩尔蔗糖溶液、3 毫升 1 摩尔蔗糖溶液，最后加入 3 毫升 1.2 摩尔蔗糖溶液。务必从底部缓慢加入溶液，以确保不产生气泡。最后，在 4 摄氏度条件下，以 82,500 ×g 离心 2 小时。最终分离将产生三条条带和上清液。上清液中含有粗线粒体，将用于后续纯化步骤。将一侧脑组织新分离的粗线粒体用两毫升分离介质重悬。接下来，向一个新的UltraClear Beckman离心管中加入8 mL 30%每核心梯度溶液。将线粒体悬液缓慢地铺加到已制备的梯度液上方，避免产生气泡。然后在4°C条件下，以95,000 × g离心30分钟，进行梯度分离。首先，用玻璃吸管去除浓集组分（即下层条带），并将其转移至新的圆底玻璃管中，将试管置于冰上保存。接着，用新的玻璃吸管去除稀释组分（即上层条带），并转移至另一个新的圆底玻璃管中。将此离心管也置于冰上。用10毫升分离培养基稀释两个组分，并在4°C下以6,300 ×g离心10分钟。弃去高密度组分的上清液，用另10毫升分离培养基重悬沉淀。再次以相同条件离心样品。所得沉淀即为纯化的线粒体组分。接下来，将轻组分中的上清液转移至预冷的Beckman超清离心管中，并置于冰上。该组分的沉淀物因含有污染性线粒体而被弃去。向轻度组分的上清液中加入足量的分离介质以充满离心管，然后在4°C条件下以100,000 × g离心1小时。所得沉淀物将含有与线粒体相关的内质网膜（MAMs）。小心移除并弃去上清液。将MAM组分置于冰上，加入500微升至1毫升提取缓冲液，孵育20分钟，开始提取富含糖脂微囊结构域或膜微区。随后，在4摄氏度条件下，以15,300 ×g离心裂解液2分钟。收集上清液，并将沉淀物离心两分钟，以去除所有残留的Triton 100可溶性物质，最后用溶解缓冲液重新悬浮沉淀物。此溶解后的物质代表脂筏组分，可用于进一步分析。通过Western印迹检测内质网标志物、胞质蛋白以及线粒体标志物在胞质组分中的纯度和分布情况。内质网组分、纯线粒体组分和MAMs组分。Western印迹还显示，这些gems对cavi in one（一种cli标志物）呈阳性，而对内质网和线粒体蛋白呈阴性。另一方面，经Triton X-100提取的MAMs对内质网和线粒体标志物呈阳性，但在尝试该实验步骤时，cavi in one含量极少。务必记住使用 freshly dissected 脑组织，并将所有溶液、样品和试管随后置于冰上。此外，建议在分级分离的每一步骤中保留少量样品的 QUT，以便通过免疫印迹法检测纯化过程的整体效果。

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