使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

本实验的总体目标是在完全水性的环境中直接对细胞进行图案化。首先将长链聚合物（如聚乙二醇和葡聚糖）分别溶解于含有细胞培养基的离心管中。第二步是用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞沉淀，并将细胞以所需的接种密度重悬于一种或两种聚合物溶液中。

接下来，将聚合物溶液滴加到细胞培养皿中。由于两种聚合物互不相容，可实现两种全水相液体的空间图案化。可在其中一种或两种聚合物溶液中加入细胞，以形成多种不同的图案。

最后一步是在细胞贴壁培养四小时或更长时间后，去除聚合物溶液，并更换为培养基。最终可通过明场或荧光显微镜观察以确认细胞的图案化效果。该技术相较于微接触印刷等现有方法的主要优势在于，细胞是在完全水相环境中进行图案化的，且仅需使用微移液管图案等简单工具即可实现。

该方法可用于组织工程，以评估细胞迁移，并研究细胞间的旁分泌和自分泌信号传导。演示该操作流程的人员为来自高山实验室的本科生 Abraham 和研究生 Joshua White。首先，将两种不同的聚合物溶解于实验中将使用的特定培养基中。本示例中，聚乙二醇（又称 PEG）和葡聚糖（又称 Dex）的分子量分别为 35 千道尔顿和 500 千道尔顿。

在15毫升锥形管中制备16个2毫升样品，每个样品含有不同浓度的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex），类似于此处所示图表中的配比。具体操作为：根据图表称取相应量的PEG和葡聚糖，加入培养基中，轻轻摇动混合，直至两种聚合物完全溶解。即使聚合物完全溶解后，仍可能需要数小时才能达到平衡。

溶液应呈浑浊状。通过将样品在1000 G下离心5分钟以确认相分离。密度较大的下层为富含右旋糖酐的相。

上层相将富含聚乙二醇（PEG）。接下来，缓慢向各管中加入0.1毫升的额外培养基，并将样品涡旋振荡20秒。然后再次离心样品，以检查相分离情况。

加入额外体积的培养基后，溶液变得澄清，重复此步骤，每次加入0.1毫升培养基，混匀后离心样品，直至溶液澄清且不再发生相分离。这表明该特定混合物已达到临界点阈值。在此时记录每支试管的最终重量。

最后，确定两种聚合物在相分离点的质量百分比。绘制双节线，将聚乙二醇（PEG）的质量百分比置于 y 轴，葡聚糖（dex）的质量百分比置于 x 轴。该曲线表示在此介质中 PEG 与 dex 发生相分离的临界浓度。

开始细胞排阻图案化实验时，需分别配制浓度为双倍临界点值的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex）溶液，临界点值由双节结点阈值确定。本实验中，将5%（质量分数）PEG和12.8%（质量分数）葡聚糖加入含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM培养基中。将试管置于摇床上，使其充分溶解。

接下来，收集本实验用于排斥图案化的细胞，将汇合度为80%的HeLa细胞用0.5%胰蛋白酶消化3分钟。收集细胞后，使用血细胞计数板计数细胞数量，随后离心形成细胞沉淀，并将细胞重悬于添加5%PEG的培养基中，浓度为每毫升375,000个细胞。该浓度培养的样品将在次日达到汇合状态。

接下来，使用微量移液器将12.8%的Dex溶液以每滴0.5 µL的体积点样于干燥的96孔板上，用于排阻图案化。Dex液滴可在无菌条件下干燥，以备后续使用。然后，缓慢向孔中加入200 µL的PEG Hela细胞悬液。

为了覆盖 D 液滴，应首先用 PEG 溶液覆盖 D 液滴，然后再填充周围区域，这样可以防止溶液在扩散至孔内时破坏液滴。所有孔完成图案化并小心接种后，将细胞培养板放入湿化培养箱中。操作过程中需确保培养皿不倾斜，并将其放置在水平的培养箱搁板上，以避免细胞贴壁 12 小时后图案被破坏。

移除 PEG 溶液，并用 200 微升培养基洗涤三次，以去除任何残留的聚合物。然后加入 200 微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱。定期观察培养物，监测细胞增殖及向排除区域迁移的情况，以开始进行岛状图案化。

用细胞培养基配制5%（质量/质量）PEG和12.8%（质量/质量）decks的溶液。同时收集用于岛状图案化的HeLa细胞，并再次使用血细胞计数板确定可用细胞的总数。随后离心收集细胞沉淀并重悬。

将细胞在培养基中以每毫升500万个细胞的密度进行旋转培养。若细胞贴壁效果不如HeLa细胞，则在含有12.8% dex的条件下，可能需要更高的细胞浓度才能在24小时内达到汇合。接下来，用移液器将200微升PEG溶液加入96孔板的每个孔中。

然后缓慢地在每个含有PEG溶液的孔中加入0.5 µL的盖玻片细胞悬液液滴。液滴会沉降至底部并与培养表面接触。随后小心将培养板转移至培养箱中，注意在任何步骤都不要倾斜培养皿，以免在12小时后破坏形成的图案。

移除 PEG 溶液，用 200 微升培养基洗涤三次。然后加入 200 微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱。定期观察培养物，监测细胞增殖及从细胞岛向外迁移的情况。

通过配制5%（重量/重量）PEG和12.8%（重量/重量）decks的DMEM溶液开始共培养图案化，DMEM中含10%FPS和1%抗生素。同时，将用于排阻和岛状图案化的两种细胞类型培养至接近汇合状态。本实验中，我们将使用Hep G two C3 a肝细胞形成岛状结构，周围环绕NIH three T three成纤维细胞。随后分别收集这两种细胞，并使用血细胞计数板进行独立计数。

这两种细胞类型可通过明场显微镜轻松区分。将 Hep G2 C3A 肝细胞用于岛状图案化，并重悬于 12.8% 的 Dextran 中。随后将成纤维细胞沉淀，用于排除、图案化，并重悬于 5% 的 PEG 中。接下来，将 0.5 微升的 D 细胞悬液滴加至干燥的 96 孔板上，然后轻轻用 200 微升 PEG 细胞悬液覆盖 Dextran 滴。

12小时后，将培养板转移至培养箱中。移除培养基，并用200微升培养液清洗三次。然后加入200微升新鲜培养液，将培养板放回培养箱。

最后，通过监测共培养体系中白蛋白染色强度，可用于评估成纤维细胞共培养的有益作用。形成多种水性两相系统所需的聚合物浓度，可通过双节曲线（binodal curve）来描述：在双节曲线浓度以上，体系形成两相；在双节曲线以下，体系则为单相。

该溶液是一种透明的单相，至少为双相体系的两倍。本视频所述的水相双相体系中所用浓度均位于双节曲线之上。其应用的第一个实例是排阻图案化，即可以留下小面积区域不附着细胞。

岛状图案化产生与排斥图案化完全相反的效果，可在微小区域中固定细胞。这两种方法结合使用，可构建一种独特的共培养体系，即一种细胞形成的细胞岛被另一种细胞包围，如此处所示。采用排斥图案化接种的HeLa细胞将增殖并迁移以填充空白区域。

随着时间的推移，可通过监测空隙大小的变化，获得在不同条件下细胞迁移和生长的有价值信息。另一方面，岛状图案化可用于测量细胞的外向生长。

岛状图案与排斥图案的结合可形成定义明确的共培养区域。图中显示的是由成纤维细胞包围的肝细胞岛。这些细胞集落已被发现在培养中至少四天内保持其组织结构稳定。

利用该系统，可在同一块培养板上培养多个细胞岛。当仅单独培养肝细胞时，其产生的白蛋白略少于与成纤维细胞共培养时。在进行该操作时，需注意使用两倍临界浓度的聚合物浓度，以形成两相溶液。

观看本视频后，您应能充分理解如何构建水相双相体系，并利用该体系对细胞进行图案化以及定义几何结构。