Name: 利用双水相系统的细胞共培养图案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习利用双水相系统进行细胞共培养图案技术，通过聚乙二醇和葡聚糖实现细胞空间排布。该方法为组织工程和细胞生物学研究提供快速高效的细胞图案化方案。

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本研究工作得到了考特基金会、贝斯特基金会、ATA的本科生研究机会（UROP）暑期项目以及JBW的美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：DGE 0718128；ID：2010101926）的支持。

1. 相体系表征：确定相分离的阈值
<ol>
	<li>按照 图1 所示（紫色圆点），在15 ml 或 50 ml 锥形管中，用所需的缓冲液或细胞培养基配制含有 PEG 和 DEX 的溶液。下文中，PEG 和 DEX 分别指 35 kDa PEG 和 500 kDa DEX；然而，临界浓度会因所用的两种聚合物不同而变化。记录每种溶液中 PEG 和 DEX 的质量。高浓度聚合物溶液可能需要数小时才能完全溶解。无血清溶液可使用涡旋振荡助溶。对于含有蛋白质或血清的培养基，应将锥形管置于摇床上，直至两种聚合物完全溶解。记录用于溶解聚合物的培养基重量，并记录初始浓度。</li>
	<li>当聚合物完全溶解后，溶液应呈现浑浊状态。这是相分离发生的初步迹象。为确认相分离，将聚合物溶液在室温下垂直静置 20 分钟。也可在 1,000 × g 条件下离心以加速相分离过程。密度较大的下层为富含 DEX 的相，上层为富含 PEG 的相。</li>
	<li>缓慢向管中加入额外的缓冲液或培养基。应使用小量增量，以避免超过相分离的临界点。</li>
	<li>当溶液变得澄清，且离心后不再发生相分离时，即已达到相分离的阈值。记录此时管的最终重量。</li>
	<li>根据先前记录的聚合物重量，以及加入培养基后的最终重量，计算出相分离不再发生时两种聚合物各自的 % wt/wt（质量百分比）。</li>
	<li>以 % wt/wt PEG 为纵坐标，% wt/wt DEX 为横坐标绘制这些数值。该曲线称为双节线（binodal curve），可用于确定在特定细胞培养基中不同 PEG/DEX 浓度下发生相分离的阈值浓度。</li>
</ol>
2. 配置 1：排阻图案化（96 孔板格式）
<ol>
	<li>分别在细胞培养基中配制 5.0% wt/wt 的 PEG 溶液和 12.8% wt/wt 的 DEX 溶液。使用浓度至少为临界点两倍的 ATPS 溶液，以确保聚合物相互达到平衡后仍能维持双水相系统。DEX 会少量进入富含 PEG 的相中，反之亦然，因此若工作浓度过于接近临界浓度，可能导致系统浓度降至临界点以下而破坏相分离。同样，将细胞培养皿转移至温湿度控制的培养箱中也可能改变两相性质，导致两溶液互溶。注意：某些细胞可能在其他 ATPS 配方中表现更佳，可根据第 1 部分测定的双节曲线选择合适的配方。</li>
	<li>收集用于排斥图案化的细胞，测定可用细胞的总数/浓度。可选：使用 CellTracker 或其他非细胞毒性荧光标记对细胞进行标记，以便进行荧光显微观察。</li>
	<li>离心收集细胞，并将沉淀重悬于适当体积的 5.0% PEG 溶液中，以获得所需数量的细胞用于排斥。例如，在 96 孔板的一个孔中，需将 37,500 个成纤维细胞重悬于 200 μl 的 PEG 溶液中，以便次日形成汇合单层。根据其他细胞类型和培养基底尺寸，按比例调整上述数值。</li>
	<li>使用微量移液器，在干燥的细胞培养基底上滴加 0.5 μl 的 DEX 液滴。较大的液滴体积会产生更大的排斥区域。建议用于排斥微图案化的液滴体积范围为 0.1 至 1 μl。可选：DEX 液滴可提前 24 小时点样，并在室温下使其脱水，这有助于获得更清晰的图案。</li>
	<li>向孔中加入 200 μl 的 PEG 细胞悬液，覆盖 DEX 液滴。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养 12 小时。操作过程中确保培养皿不倾斜，并将其放置在水平的培养箱搁板上，以避免破坏图案结构。</li>
	<li>移除 PEG 溶液，并用 200 μl 培养基洗涤三次。</li>
	<li>加入新鲜培养基，放回培养箱继续培养。</li>
	<li>定期观察培养物，监测细胞向排斥区域迁移的情况。</li>
</ol>
3. 配置 2：岛状图案化（96 孔板格式）
<ol>
	<li>按照上述方法，用细胞培养基配制5.0%（质量/质量）PEG溶液和12.8%（质量/质量）DEX溶液。</li>
	<li>收集用于岛状图案化的细胞，测定可获得的细胞总数/浓度。</li>
	<li>将细胞离心并重悬于适当体积的12.8% DEX溶液中，以达到岛状图案化所需的细胞浓度。对于强黏附性细胞类型，建议使用5,000个细胞/μl或更低的浓度；对于贴壁困难或弱黏附性细胞，可考虑使用高达10,000个细胞/μl的浓度。</li>
	<li>为避免干燥，迅速操作，按照上述方法将0.5 μl DEX液滴加到干燥的细胞培养基底上。切勿让液滴干燥。可选步骤：可提前在孔中加入200 μl PEG溶液，随后将DEX液滴加入PEG溶液中，液滴会沉降至底部并与培养表面接触，这有助于形成更清晰的岛状图案。</li>
	<li>用200 μl PEG溶液覆盖DEX液滴。</li>
	<li>置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育12小时。确保在操作过程中培养皿不倾斜，并将其放置在水平的培养箱架上，以避免图案被破坏。</li>
	<li>移除PEG溶液，并用200 μl培养基洗涤三次。</li>
	<li>加入新鲜培养基，放回培养箱继续培养。</li>
	<li>定期观察培养物，监测细胞从岛状区域向外迁移和增殖的情况。</li>
</ol>
4. 配置 3：排斥共培养（96 孔板格式）
<ol>
	<li>按照上述方法，用细胞培养基配制 5.0% wt/wt 的 PEG 溶液和 12.8% wt/wt 的 DEX 溶液。</li>
	<li>收集用于排除法和岛状图案化的细胞，确定每种细胞类型的总数量/浓度。可选步骤：某些细胞组合可能表现出显著不同的增殖指数。为防止排除的细胞过度增殖而覆盖岛状图案化的细胞（特别是在长期培养中），可在收获前用丝裂霉素 C 处理用于排除的细胞 2 小时，或对其进行照射，以抑制其增殖。必要时可使用荧光细胞示踪染料（Fluorescent CellTracker dyes）区分两种细胞群体。</li>
	<li>将细胞离心，按上述方法将用于排除图案化的细胞沉淀重悬于适当体积的 5.0% PEG 溶液中，以达到所需细胞数量；将用于岛状图案化的细胞沉淀重悬于适当体积的 12.8% DEX 溶液中，以达到所需细胞浓度。</li>
	<li>使用微量移液器，将 0.5 μl 的 DEX 细胞悬液滴加到干燥的细胞培养基底上。注意勿使液滴干燥。</li>
	<li>用 200 μl 的 PEG 细胞悬液覆盖 DEX 液滴。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 12 小时。操作过程中确保培养皿不倾斜，并将其放置在水平的培养箱搁板上，以避免破坏图案结构。</li>
	<li>移除 PEG 溶液，并用 200 μl 培养基洗涤三次。</li>
	<li>加入新鲜培养基，放回培养箱继续培养。</li>
	<li>观察共培养体系中两种细胞群体之间的相互作用。可选对照实验：可单独进行排除法或岛状图案化操作，或共培养不发生相互作用的细胞，或在图案化前后阻断一种或两种细胞群体中特定的信号通路，以作为对照。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

ATPS细胞微图形化方法仅需具备细胞培养技术的基本熟练程度，无需其他专业技能，且可快速掌握。该方法的优势在于成本低廉、操作快速，并可兼容多种细胞类型和培养形式。基于这些原因，本实验方案可被生命科学家轻松采用，尤其适用于研究细胞增殖、迁移与趋化性，以及细胞群体间接触依赖性（juxtacrine）和旁分泌（paracrine）相互作用的研究人员。本文所展示的检测方法可利用ImageJ等软件中的标准图像分析流程，在细胞群体水平上轻松实现定量分析。
为获得一致的图案，建议采取以下预防措施。首先，在每次滴加 DEX 溶液后应更换移液枪头，以确保滴液体积更加一致。由于 DEX 溶液相对黏稠，还需注意避免将附着在移液枪头外表面的过量 DEX 滴加到体系中，并确保全部 DEX 体积完全从枪头中排出。其次，若加入 PEG 时力度过大或培养皿发生倾斜，液滴可能发生移动。为尽量减少 DEX 液滴的扰动，应将培养皿置于水平面上，并让 PEG 溶液从上方缓慢覆盖液滴，避免 PEG 弯月面产生较大力量导致部分液滴移位。液滴扰动更常发生于较大的 DEX 液滴，因此应尽可能使用体积不超过 0.5 μl 的液滴。除...

当两种不相容的聚合物溶液在足够高的浓度下混合时，会形成水溶液两相体系（ATPSs）。相分离受到多种因素影响，包括聚合物的分子量和极性、溶液温度、水相溶剂的pH值和离子含量1, 2。两种聚合物溶液发生分离的临界点由所选两相体系的物理化学性质决定，但通常在低聚合物浓度（低于20% wt/wt）和非变性条件下即可发生，因此ATPSs可用于生物技术应用3-9。
迄今为止，研究最为广泛的双水相体系是聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEX）体系。这种由廉价且生物相容性良好的聚合物形成的双水相体系，最初被用于通过分子分配实现生物分子的纯化2, 10。当加入不参与成相但可溶于体系的其他分子或颗粒时，这些分子或颗粒会因对DEX或PEG相的相对亲和性不同，而优先分布于两相之一或两相界面处，此即为分配现象。PEG/DEX双水相体系的另一特性是两聚合物相之间存在界面张力。PEG与DEX形成的双水相体系，其界面张力通常远低于其他液-液两相体系（如油-水体系）；然而，该界面张力仍足以对病毒、细胞及蛋白质聚集体等微小颗粒产生显著影响2, 11-13。最后，由于高分子量的PEG和DEX在生理盐浓度条件下，仅需较低浓度（高分子量聚合物通常低于5% wt/wt）即可实现相分离，因此该体系对其中所含的哺乳动物细胞几乎不产生或仅有极轻微的不利影响14-16。
近期，本实验室已将ATPS体系的界面特性与分配效应应用于细胞图案化14, 16-20。该方法通过在PEG存在下，将密度较高的DEX溶液在细胞培养基底上进行微图案化来实现。当细胞被引入PEG相时，由于PEG/DEX之间的界面张力，细胞被排斥而无法进入DEX液滴20。当细胞被图案化于DEX相中时，则通过界面张力与分配效应被保留在细胞培养基底的表面16, 17, 19。
与其他细胞图案化方法相比，ATPS细胞图案化技术易于掌握，仅需掌握聚合物本身的基本知识，以及细胞培养和使用微量移液器的能力。其他细胞图案化方法通常需要专门的设备和培训，难以在生命科学领域广泛推广。例如，某些方法（如微接触印刷或喷墨印刷）通过在培养基底上施加细胞黏附性生物分子的图案，间接实现细胞图案化，这些图案随后作为细胞附着的位点21, 22。尽管间接方法对某些细胞类型具有应用价值，但其需要较高的操作技能和专门设备来制备图案化工具，且可能因特定细胞类型或生物分子图案的不同而缺乏特异性。另一种方式是采用直接图案化方法，如层流图案化、模板法和喷墨印刷，可实现细胞高特异性沉积23-26。然而，这些技术同样需要操作者具备专业知识和专用设备，并可能在打印过程中对细胞造成损伤。尽管这些方法通常能够产生精确的细胞图案，但要使细胞图案化成为生命科学中实用的工具，必须具备成本效益高且操作简便的特点。
本文报道了一种利用我们先前发表的应用中所描述的ATPS（水相分离系统）生成图案化细胞培养物的详细实验方案。仅使用微量移液器，用户即可生成用于迁移实验的细胞排斥区或细胞岛。该方法通过PEG/DEX界面张力实现，该张力可将细胞保留在DEX相中，或阻止沉积在PEG相中的细胞进入DEX相。通过结合这两种基本的图案化技术，可快速构建共培养体系，例如肝细胞-成纤维细胞共培养。文中详细描述了图案化方法、ATPS参数及预期结果。

<table><tbody><tr><td>右旋糖酐 500,000 kDa</td><td>Pharmacosmos, 丹麦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 35,000 kDa</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>ATCC, 马纳萨斯, 弗吉尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2 C3A</td><td>ATCC, 马纳萨斯, 弗吉尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>ATCC, 马纳萨斯, 弗吉尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞示踪剂</td><td>Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

快速、易用且经济实惠的细胞图案化技术，将是未来高通量细胞检测、细胞间相互作用研究平台以及组织工程系统发展的必要条件。本详细实验方案描述了一种利用右旋糖酐（DEX）和聚乙二醇（PEG）的生物相容性溶液生成细胞共培养的方法，当这两种溶液的浓度超过阈值时会自发发生相分离。利用该方法可实现多种构型的细胞图案化。通过在基底上打印DEX液滴，并用含有细胞的PEG溶液覆盖，可实现细胞排阻图案化。两种聚合物溶液之间形成的界面张力会使细胞围绕DEX液滴外周分布，形成圆形的无细胞区域，可用于细胞迁移实验。通过将富含细胞的DEX相注入PEG溶液中，或用PEG溶液覆盖DEX液滴，可形成细胞岛图案。将细胞排阻法与DEX细胞岛图案化相结合，可直接构建共培养体系。这些方法适用于多种液体处理方式，包括手动微量移液，且几乎可用于所有贴壁细胞类型。

为了选择适用于细胞图案化的合适PEG和DEX组合，确定双节线至关重要。该曲线界定了可形成ATPS的条件点，其具体形态会因聚合物体系的不同而随温度、pH值和离子含量的变化而改变。对于需要定制培养基配方的细胞培养，可能需要通过实验确定双节线。这一过程可通过制备一系列远离双节线、且PEG与DEX含量不同的ATPS来实现（图1，紫色圆点）。当ATPS存在时，混合后的聚合物溶液会呈现浑浊状态，并在静置后平衡为分离的两相。通过向聚合物混合物中逐步添加额外溶剂，ATPS将趋近于0% PEG/0% DEX。在某一时刻，混合物将不再发生相分离。此时对应的PEG/DEX浓度即为双节线上的一点：该点以上区域可形成ATPS，而该点以下则不能。 图1 中的曲线代表了三种常用细胞培养基在有无10%胎牛血清（FBS）条件下的双节线。在含有FBS的情况下，形成ATPS所需的浓度略高。
在我们此前的报告中，采用基于临界点的双水相体系（即在双节线上，聚乙二醇和葡聚糖达到平衡后形成等体积两相的点），该体系由2.5% PEG 35 kDa和3.2% DE...

利用水相双相系统同时对多种细胞群体进行图案化。这种快速且简便的细胞图案化方法利用了葡聚糖和聚乙二醇水溶液之间的相分离特性以及两种聚合物溶液之间的界面张力。

快速、易用且经济实惠的细胞图案化技术将是未来高通量细胞检测发展的必要条件，……

本实验的总体目标是在完全水性的环境中直接对细胞进行图案化。首先将长链聚合物（如聚乙二醇和葡聚糖）分别溶解于含有细胞培养基的离心管中。第二步是用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞沉淀，并将细胞以所需的接种密度重悬于一种或两种聚合物溶液中。接下来，将聚合物溶液滴加到细胞培养皿中。由于两种聚合物互不相容，可实现两种全水相液体的空间图案化。可在其中一种或两种聚合物溶液中加入细胞，以形成多种不同的图案。最后一步是在细胞贴壁培养四小时或更长时间后，去除聚合物溶液，并更换为培养基。最终可通过明场或荧光显微镜观察以确认细胞的图案化效果。该技术相较于微接触印刷等现有方法的主要优势在于，细胞是在完全水相环境中进行图案化的，且仅需使用微移液管图案等简单工具即可实现。该方法可用于组织工程，以评估细胞迁移，并研究细胞间的旁分泌和自分泌信号传导。演示该操作流程的人员为来自高山实验室的本科生 Abraham 和研究生 Joshua White。首先，将两种不同的聚合物溶解于实验中将使用的特定培养基中。本示例中，聚乙二醇（又称 PEG）和葡聚糖（又称 Dex）的分子量分别为 35 千道尔顿和 500 千道尔顿。在15毫升锥形管中制备16个2毫升样品，每个样品含有不同浓度的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex），类似于此处所示图表中的配比。具体操作为：根据图表称取相应量的PEG和葡聚糖，加入培养基中，轻轻摇动混合，直至两种聚合物完全溶解。即使聚合物完全溶解后，仍可能需要数小时才能达到平衡。溶液应呈浑浊状。通过将样品在1000 G下离心5分钟以确认相分离。密度较大的下层为富含右旋糖酐的相。上层相将富含聚乙二醇（PEG）。接下来，缓慢向各管中加入0.1毫升的额外培养基，并将样品涡旋振荡20秒。然后再次离心样品，以检查相分离情况。加入额外体积的培养基后，溶液变得澄清，重复此步骤，每次加入0.1毫升培养基，混匀后离心样品，直至溶液澄清且不再发生相分离。这表明该特定混合物已达到临界点阈值。在此时记录每支试管的最终重量。最后，确定两种聚合物在相分离点的质量百分比。绘制双节线，将聚乙二醇（PEG）的质量百分比置于 y 轴，葡聚糖（dex）的质量百分比置于 x 轴。该曲线表示在此介质中 PEG 与 dex 发生相分离的临界浓度。开始细胞排阻图案化实验时，需分别配制浓度为双倍临界点值的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex）溶液，临界点值由双节结点阈值确定。本实验中，将5%（质量分数）PEG和12.8%（质量分数）葡聚糖加入含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM培养基中。将试管置于摇床上，使其充分溶解。接下来，收集本实验用于排斥图案化的细胞，将汇合度为80%的HeLa细胞用0.5%胰蛋白酶消化3分钟。收集细胞后，使用血细胞计数板计数细胞数量，随后离心形成细胞沉淀，并将细胞重悬于添加5%PEG的培养基中，浓度为每毫

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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