利用双水相系统的细胞共培养图案
2013年3月26日
双水相系统，用于同时图案多个的细胞群体。此快速和容易的方法，细胞图案利用葡聚糖和聚乙二醇的水溶液，和两者之间的聚合物溶液中存在的界面张力的相分离。
该程序的总体目标是在完全水性环境中直接对细胞进行图案化。这是通过首先将长链聚合物（如聚乙二醇和糊精）溶解在含有细胞培养基的单独试管中来实现的。第二步是用胰蛋白酶茴香化，收获沉淀，并在一种或两种聚合物溶液中以所需的接种密度重悬细胞。
接下来，将聚合物溶液分配到细胞培养皿上。两种聚合物的不相容性允许两种全水性液体的空间图案。单元可以包含在聚合物溶液或两种聚合物溶液中，以产生各种图案。
最后一步是在细胞粘附 4 小时或更长时间后去除聚合物溶液，并用培养基替换。最终，明场或荧光显微镜可用于确认细胞模式。与微接触打印等现有方法相比，该技术的主要优点是，细胞在完全水性环境中使用微管图案等简单工具进行图案化。
该方法可用于组织工程，以评估细胞迁移并研究细胞间的周分泌和自分泌信号传导，证明这些程序将是本科生 Abraham 和 Joshua White，来自 Takayama 实验室的研究生。首先将两种不同的聚合物溶解到实验中使用的特定介质中。在这个例子中，聚乙二醇（也称为 PEG）和糊精（也称为 Dex）的分子量分别为 35 道尔顿和 500 道尔顿。
在 15 毫升锥形管中制备 16 个 2 毫升样品，每个样品具有不同浓度的 PEG 和 dex，类似于此处显示的图表。为此，根据图表称取适量的 PEG 和 dex，然后轻轻摇动它们在介质中混合，直到两种聚合物完全溶解。聚合物完全溶解后，这可能需要几个小时。
解决方案应该是多云的。通过以 1000 Gs 离心样品 5 min 来确认相分离。更密集的底层阶段将富含 dex。
顶部阶段将是富含挂钩的。接下来，向试管中缓慢添加 0.1 mLs 其他培养基，并将样品涡旋 20 秒。然后再次离心样品以检查相分离。
加入额外体积的培养基后，溶液澄清，重复此步骤，再加入 0.1 mL 培养基混合并离心样品，直到溶液变澄清且不再相分离。这表示已达到该特定混合物的临界点阈值。此时记录每根管的最终重量。
最后，确定两种聚合物在表面分离点的单位重量百分比。绘制箱节点曲线，将每个权重挂钩的权重百分比放在 y 轴上，将每个权重挂钩的权重百分比放在 X 轴上。该曲线是该培养基中 PEG 和 dex 表面分离的阈值浓度。
要开始细胞的排除模式化，请以 bin 节点阈值确定的临界点值的两倍准备 PEG 和 dex 的单独溶液。对于这些实验，将 5% 重量/重量的 PEG 和 12.8% 重量的甲板添加到 DMEM 中，其中包含 10% FBS 和 1% 抗生素。将试管放在摇杆上，让它们完全溶解。
接下来，收获用于本实验排除模式的细胞，使用 0.5% tripsin 对 80% 汇合度的 hela 细胞进行胰蛋白酶浸泡 3 分钟。收获后，使用血细胞计数器计数细胞数，然后沉淀并以每毫升 375， 000 个细胞的浓度重悬于添加 5%PEG 的培养基中。该浓度将产生样品，培养后将在第二天汇合。
接下来，使用微量移液器将 0.5 微升 12.8% 甲板溶液液滴分配到干燥的 96 孔板上以进行排斥图案。Dex 液滴可以在无菌条件下干燥以备后用。然后将 200 微升 PEG hela 细胞悬液缓慢分配到孔中。
为了覆盖 D 液滴，重要的是在填充周围区域之前先用 PEG 溶液覆盖 D 液滴，因为这可以防止它在液滴扩散到孔中时破坏液滴。一旦所有孔都经过精心建模和接种，将细胞培养板放入加湿的培养箱中。确保培养皿在处理过程中没有倾斜，并将其放置在水平培养箱架上，以避免在细胞粘附 12 小时后破坏模式。
取出 PEG 溶液，用 200 微升培养基洗涤 3 次，以去除任何残留的聚合物。然后加入 200 微升新鲜培养基，将板放回培养箱中。定期监测培养物，观察细胞增殖和迁移到排除区 开始岛状模式。
在细胞培养基中制备 5%/重量 PEG 和 12.8%/重量的溶液。还要收获用于岛状图案的 hela 细胞，然后再次使用血细胞计数器确定可用的细胞总数。接下来颗粒和复苏。
在培养基中以每毫升 500 万个细胞的速度旋转细胞。继续使用 12.8%dex，如果细胞不像 heela 细胞那样粘附，则可能需要更高浓度的细胞才能在 24 小时内达到汇合。接下来，将 200 微升 PEG 溶液移液到 96 孔板的每个孔中。
然后在含有 PEG 溶液的每个孔中缓慢加入 0.5 μL 甲板细胞悬液液滴。液滴会沉到底部并接触培养物表面。然后小心地将板转移到培养箱中，注意不要在任何点倾斜培养皿，这可能会在 12 小时后破坏模式。
取出 PEG 溶液，用 200 微升培养基洗涤 3 次。然后加入 200 微升新鲜培养基，将板放回培养箱中。定期监测培养物以观察细胞增殖和从岛屿向外迁移。
通过在 DMEM 中制备 5% 重量/重量的 PEG 和 12.8% 重量的溶液开始共培养模式化，其中含有 10%FPS 和 1%抗生素，也生长出两种细胞类型用于排除和岛状模式，因此它们接近汇合。同时在这里，我们将使用 Hep G 两个 C3 a 肝细胞岛，周围有 NIH 三个 T 三个成纤维细胞。然后收获两种细胞类型并使用血细胞仪分别计数。
使用明场显微镜沉淀可以很容易地区分这两种细胞类型，Hep G 两个 C3 A 肝细胞用于岛状模式和复苏花费在 12.8% 的甲板中。然后将成纤维细胞沉淀以排除、图案化和复苏，悬浮在 5% PEG 中。接下来，将 0.5 微升 D 细胞悬液滴分配到干燥的 96 孔板上，并用 200 微升 peg 细胞悬液轻轻覆盖 dex 液滴。
然后在 12 小时后将板转移到培养箱中。取出培养基，用 200 微升培养基冲洗 3 次。然后加入 200 微升新鲜培养基，将板放回培养箱中。
最后，监测共培养物白蛋白染色强度可用于评估成纤维细胞共培养的有益影响。形成各种水性两相体系所需的聚合物浓度在此处由 bin 节点曲线以上的浓度的 bin 节点曲线描述。该系统在 bin 节点曲线下方形成两个相。
解决方案是至少两次的透明单相两相系统。在二元曲线上发现的浓度足以用于本视频中描述的水性两相系统。它们使用的第一个示例是排除模式，其中小区域可以没有单元格。
岛状模式与排除模式完全相反，在排除模式中，小区域可以包含单元格。这两个程序的组合可用于形成独特的共培养，其中细胞岛可以被另一种细胞类型包围，如图所示。使用排阻模式接种的 Hela 细胞将增殖并迁移以填充空隙。
随着时间的推移。可以监测空隙的大小，以提供对不同条件下细胞迁移和生长的宝贵见解。另一方面，岛状模式可用于测量细胞生长。
岛屿和排斥模式的结合产生了定义明确的共育区域。这里显示的是被成纤维细胞包围的肝细胞岛。已发现这些菌落在培养中至少维持其组织四天。
使用该系统，多个细胞岛可以在同一板上生长。当单独作为岛生长时，肝细胞产生的白蛋白比与成纤维细胞共培养时产生的白蛋白略少。在尝试此程序时，请务必记住使用两倍于临界浓度的聚合物浓度来形成两相溶液。
观看此视频后，您应该对如何构建水性两相体系并使用它来形成单元图案和定义几何结构有了很好的了解。
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概述
本文介绍了一种使用水相两相系统进行细胞排列的方法。通过利用右旋糖酐和聚乙二醇的相分离，研究人员可以以直接的方式实现细胞的空间组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物技术
- 聚合物科学
背景
- 水相两相系统允许分离不同的细胞群体。
- 聚乙二醇和右旋糖酐是细胞培养中常用的聚合物。
- 细胞排列对于组织工程中的各种应用至关重要。
- 这种方法提供了一种快速和有效的创建细胞排列的方法。
研究目的
- 开发一种在水环境中直接进行细胞排列的技术。
- 探索使用聚合物溶液进行细胞的空间组织。
- 为研究应用创建多样化的细胞排列。
使用的方法
- 在细胞培养基中溶解长链聚合物。
- 用胰蛋白酶处理、收集并在聚合物溶液中重新悬浮细胞。
- 将聚合物溶液分配到细胞培养皿上。
- 利用聚合物的不相容性进行空间排列。
主要结果
- 使用水溶液成功地进行多种细胞群体的排列。
- 展示了创建各种细胞排列的多样性。
- 突出了该方法与传统技术相比的效率。
- 为进一步研究细胞组织提供了基础。
结论
- 该方法提供了一种快速有效的细胞排列方式。
- 水相两相系统可用于细胞生物学的多种应用。
- 这种方法可能会增强组织工程策略的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell patterning technologies that are fast, easy to use, and affordable are essential for advancing high-throughput cell assays, studying cell-cell interactions, and developing tissue-engineered systems. This method enables spatial organization of cells in entirely aqueous environments using biocompatible polymer solutions, supporting predictive confidence in early discovery workflows. It provides a scalable, reagent-efficient approach for probing mechanistic hypotheses and de-risking target validation through controlled co-culture geometries.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining precise cell-cell interaction geometries to clarify signaling pathways and functional dependencies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible patterning of exclusion zones and cell islands, facilitating mechanistic target validation without complex fabrication.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative readouts on cell migration, proliferation, and co-culture organization under defined microenvironmental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by creating stable, defined co-culture patterns that mimic tissue-level organization.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through phase-separated aqueous systems compatible with manual pipetting and liquid handling platforms.
- Scalability Value: Facilitates screening readiness and platform reuse across adherent cell types, supporting high-throughput evaluation of compound effects on cell behavior.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by modeling cell-cell pericrine and autocrine signaling in disease-relevant configurations.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions on preclinical progression by quantifying functional outcomes such as albumin secretion in hepatocyte-fibroblast co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by isolating variables in cell interaction studies to reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, enabling iterative refinement of cell-based assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise spatial control over cell populations to interrogate signaling mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through reproducible patterning compatible with microscopy-based readouts for migration, proliferation, and functional assays.
- Analytics: Generates measurable readouts such as cell migration into exclusion zones and outgrowth from islands, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling tissue-like architectures relevant to evaluating therapeutic candidates.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects, reducing reliance on specialized microfabrication and enabling cross-team standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cell-cell communication studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of cell patterning workflows using accessible liquid handling tools.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early functional de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative co-culture phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer solution preparation and phase behavior characterization using binodal curve determination.
- Depends on access to microfluidic or manual pipetting equipment for precise droplet dispensing and cell handling.
- Necessitates cross-team standardization of polymer concentrations and cell seeding densities to ensure pattern fidelity across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different adherent cell types, as patterning efficiency may vary with cell adhesion properties and size.
- Includes practical limitations such as the need to maintain phase stability during culture and avoid mechanical disruption of patterns during medium exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Phase System Characterization: Determining Thresholds for Phase Separation
3:22
Configuration 1: Exclusion Patterning of HeLa Cells
5:24
Configuration 2: Island Patterning
6:41
Configuration 3: Exclusion / Island Patterned Co-Cultures
8:08
Results: Cell Patterning with the Aqueous Two-phase System
9:47
Conclusion
