焦磷酸测序的微生物鉴定和表征
August 22nd, 2013
焦磷酸测序法是一种通用的技术，可用于确定细菌种类，区分细菌的菌株，并检测抗微生物药物抗性的基因突变，有利于微生物的基因组测序。在这段视频中，微生物扩增子，扩增子的焦磷酸测序，DNA序列分析的程序将被证明。
以下实验的总体目标是使用 pyro 测序方法通过 16 s 核糖体 DNA 序列分析来鉴定细菌。这是通过首先使用生物素化引物通过聚合酶链反应扩增靶 DNA 来实现的。然后使用链霉亲和素包被的球状微珠固定生物素化的扩增子，并使用洗涤缓冲液进行纯化。
接下来，将扩增子变性，并将 16 s 核糖体测序引物 ELL 到 DNA 的单链上。此步骤的目标是准备用于测序的 DNA。最后，通过焦磷酸测序进行 DNA 测序反应，这是一种基于合成测序原理对核酸进行快速准确的测序方法。
生物素化的 alicon 被 DNA 聚合酶用作模板，一次掺入一个碱基的 DN TPS，导致焦磷酸盐的产生。TP Sul 脲酶按比例将焦磷酸盐转化为 A-T-P-A-T-P 催化荧光素酶介导的荧光素转化为荧光素，从而产生与 TP 量成比例的光。该光在热释曲线上记录为峰，表明核苷酸掺入。未掺入的 DN NTP 在添加下一个 DNTP 以继续合成之前被 apras 降解。
rogram 上记录的化学发光信号可以确定 DNA 序列。获得的结果是核糖体 16 SDNA 序列，通过与核糖体 DNA 参考数据库进行比较来用于鉴定细菌。Pyro 测序是一种多功能技术，可促进微生物基因组测序，可用于鉴定细菌种类、区分细菌菌株和检测赋予抗菌剂耐药性的基因突变。
在本视频中，将演示细菌扩增子生成扩增子焦磷酸测序和 DNA 序列分析的程序 要开始模板扩增程序，请解冻所有需要的溶液并彻底混合每种溶液。所有工作都可以在室温下完成。根据此表设置 PCR 反应。
请注意，在大多数情况下，1.5 毫摩尔的最终氯化镁浓度将提供令人满意的结果。但是，如果需要更高的镁浓度，最高可达 3.5 μL 的 25 毫摩尔，则可以在反应中加入氯化镁。一种引物的五个引物末端必须经过生物素化，建议对引物进行 HPLC 彻底纯化。
通过轻轻上下吹打来混合反应混合物，然后将适当体积分配到 PCR 管中。接下来，将模板 DNA 添加到每个 PCR 管中。建议每次反应使用 10 ng 基因组 DNA。
将 PCR 管放入 PCR 仪中，并在制备预混液之前启动此循环程序。旋转装有 strep avid 和包被的血清珠的瓶子，以确保悬浮液的均匀性。根据此流程图制作预混液。
将磁珠、结合缓冲液和高纯度水混合在微量离心管中。根据所用 PCR 产物的体积，将 60 至 75 μL 预混液分配到 PCR 板的每个孔中，使总体积为每孔 80 μL。向每个孔中加入 5 至 20 μL 生物素化 PCR 产物。
每孔的体积现在应为 80 微升。用联排管盖密封孔，并在室温下使用定轨摇床以 1， 400 RPM 的转速搅拌 PCR 板 5 至 10 分钟。通过用跪姿缓冲液将测序引物稀释至 0.3 微摩尔并将 25 微升分配到反应板的每个孔中来开始此过程。
将板放在真空工作站上。根据此图填充工作站槽。1 号槽中 50 毫升 70% 乙醇，2 号槽中 40 毫升变性溶液，3 号槽中加入 50 毫升洗涤缓冲液，4 号槽中加入 50 毫升高纯水，5 号槽中加入 70 毫升高纯水。
打开真空泵，确保真空工具上的开关设置为打开，用高纯水冲洗过滤器探头。在第 5 槽中，将带有磁珠的 PCR 板放置在工作站上，确保 PCR 板和反应板的方向相同。将真空工具放入 PCR 板的孔中。
在 20 秒内或直到吸出所有体积，在真空仍处于开启状态的情况下，真空工具将捕获珠子。用 70% 乙醇冲洗工具20 秒，或直到吸出所有体积。接下来，用变性溶液冲洗工具20秒或直到吸出所有体积。
之后，用洗涤缓冲液冲洗工具20秒，或直到在真空仍处于开启状态的情况下吸出所有体积。将真空工具升高到垂直 90 度以上 5 秒钟，让所有液体从真空工具中排出。现在关闭泵并将真空工具与三个反应板对齐。
将真空工具放入孔中。然后轻轻左右摇晃约 10 秒，将微珠释放到含有测序引物的孔中。将真空工具放入水槽中进行清洁，以将测序引物与 DNA 结合。
将反应板放入预热的板架中。将板在 80 摄氏度下加热两分钟。从支架中取出板，将其放在柜台上，在室温下冷却 5 分钟。
使用电源线上方的电源开关打开仪器，以确定所需的体积，以开始此过程。在仪器软件中设置运行文件，然后在工具菜单下选择运行前信息。根据运行前信息页面中提供的说明填充磁带。
将移液器吸头尽可能向下放在每个孔的角落中，确保没有气泡。打开墨盒门，将墨盒标签朝前插入。确保磁带已正确插入并关闭门。
打开板固定框架，将反应板放在仪器内。关闭板固定框架和仪器盖。将装有使用仪器软件创建的运行文件的 U 盘插入仪器压力机前部的 USB 端口。
好的，可以看到所需运行文件的菜单。使用滚动箭头选择所需的运行文件，然后按 select。当达到所有预设的压力和温度水平时，仪器将在运行期间开始分配试剂。
仪器屏幕实时显示所选孔的热释。使用滚动箭头查看其他井的 Pyros。当仪器确认运行已完成且运行文件已保存到 U 盘时，按下关闭键。
取出 U 盘。典型焦磷酸测序运行的结果如下所示。正向和反向 PCR 引物设计用于 DNA 模板的保守区域，即 16 s 核糖体序列。
在这个例子中，测序引物位于扩增子内一个表征良好的识别高变 DNA 序列的上游，以蓝色显示。这种高可变序列允许使用保守的测序引物作为内部质量控制来鉴定大量细菌种类，可以检查包围可变区的 DNA 序列以确保分析了正确的 DNA 区域。Pyro 测序软件可以将生成的序列与细菌核糖体序列的内部数据库进行比较和比对，以便进行细菌鉴定。
此外，可以分析序列以确定赋予抗生素耐药性的突变。例如，对幽门螺杆菌 23 s 核糖体基因突变的分析揭示了两种突变模式，即 GAA 或 GA，它们赋予抗生素耐药性。Pyro 测序是一种促进微生物基因组测序的多功能技术。
微生物学应用中的焦磷酸测序的优势包括快速可靠的高通量筛选以及准确鉴定微生物和微生物基因组突变。此外，焦磷酸测序方法可以分析抗菌素耐药性的完整遗传多样性，包括 SNP 点突变、插入和缺失的分型，以及某些抗菌素耐药模式中可能出现的多个基因拷贝的定量。感谢您观看此视频，祝您的测序实验好运。
概述
本文讨论了用于微生物基因组测序的焦磷酸测序技术，该技术有助于识别细菌物种和检测基因突变。视频展示了微生物扩增子生成、焦磷酸测序和DNA序列分析的过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物基因组学
- DNA测序
- 基因突变检测
背景
- 焦磷酸测序是一种快速准确的核酸测序方法。
- 它基于合成测序的原理。
- 该技术可以识别细菌物种并区分菌株。
- 它还检测赋予抗微生物药物耐药性的基因突变。
研究目的
- 通过16S核糖体DNA序列分析来识别细菌。
- 展示微生物扩增子生成的程序。
- 说明焦磷酸测序过程和DNA序列分析。
使用的方法
- 使用聚合酶链反应（PCR）扩增目标DNA。
- 使用链霉亲和素包被珠子固定生物素化扩增子。
- 扩增子变性和测序准备。
- 通过光生成来确定DNA序列的焦磷酸测序。
主要结果
- 成功扩增和纯化了目标DNA。
- 在核苷酸结合过程中产生焦磷酸。
- 记录的光信号表明核苷酸结合。
- 将获得的序列与核糖体DNA参考数据库进行比较。
结论
- 焦磷酸测序对微生物基因组测序有效。
- 该方法允许识别细菌物种和菌株。
- 它可以检测与抗微生物药物耐药性相关的基因突变。
常见问题
Executive Industry Relevance
Pyrosequencing enables rapid, high-throughput microbial identification and genetic characterization, directly supporting early-stage anti-infective discovery and resistance surveillance. Its quantitative, sequence-based outputs provide actionable data for target validation and mechanistic de-risking in anti-microbial R&D pipelines. This technology enhances portfolio decision-making by delivering reliable microbial genotyping and resistance mutation detection at critical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise identification of microbial species and strain-level discrimination for target validation.
- Supports detection of resistance-conferring mutations, informing mechanistic de-risking of anti-microbial targets.
- Provides high-confidence sequence data to triage candidate targets and prioritize discovery efforts.
Screening & Assay Development
- Delivers validated microbial genotypes for downstream phenotypic or biochemical screening workflows.
- Facilitates assay standardization through reproducible, quantitative sequence outputs.
- Enables high-throughput screening of microbial panels for resistance markers and genetic diversity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial genotyping with translational biomarker strategies for resistance monitoring.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking genotype to phenotype.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming resistance mechanisms early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
Pyrosequencing integrates at the interface of early discovery, screening, and translational research, providing a reusable platform for microbial genotyping and resistance mutation analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying microbial species and resistance mutations.
- Screening: Provides quantitative, reproducible sequence data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates actionable sequence outputs and mutation profiles for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of microbial genotypes with resistance biomarkers for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, high-throughput capability for ongoing microbial surveillance and resistance monitoring.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial identification and resistance mechanism validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable genotyping workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds based on genetic resistance profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and microbial genomics for assay design and data interpretation.
- Needs access to pyrosequencing instrumentation and robust analytical software for sequence analysis.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data reporting protocols.
- Adaptation may be necessary for diverse microbial species and resistance gene targets.
- Throughput and read length limitations should be considered for large-scale or complex genomic analyses.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:40
Amplification of the Template
4:01
Vacuum Workstation Protocol
4:05
Immobilizing the Biotinylated PCR Products
5:06
Denaturation of DNA and Addition of Sequencing Primer
7:30
Annealing Sequencing Primer to DNA Strands
7:55
Pyromark Q24 Operation for Pyrosequencing
7:58
Preparing for a Run
8:58
Starting a Run
9:46
Completing a Run
10:03
Results: Pyrosequencing Identifies Bacteria and Detects Antibiotic Drug Resistance
11:35
Conclusion
