使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

以下实验的总体目标是比较不同组生物样本代谢谱的快照。通过液-液萃取分离有机分子和极性分子来实现这一目标。第二步，利用液相色谱进一步分离分子，并通过高分辨质谱进行分析，从而获得保留时间、质荷比以及强度数据，用于后续分析。

接下来进行液相色谱分析，对检测到的特征峰进行对齐、定量和排序，以鉴定不同组间差异丰度的特征。结果展示了不同处理条件下特征峰的差异，这些差异基于液相色谱-高分辨质谱检测到的分析物差异丰度。

尽管该方法可用于研究细胞代谢，但也可为生物标志物的发现或衰老相关代谢提供见解。对于贴壁细胞系，在10厘米培养皿中加入1.5毫升培养基。将培养皿置于冰上，轻轻刮取以收集细胞。

将1.5毫升悬浮细胞转移至预先标记的10毫升玻璃离心管中。随后，向每个含有样品的10毫升玻璃离心管中加入6毫升2:1的氯仿-甲醇溶液。在低速下振荡样品30分钟。振荡后，以1,935 ×g、4°C离心10分钟，离心时采用低加速度和低减速设置，以彻底分离各相，并使用长柄巴斯德移液管进行后续操作。

将有机相转移至新预标记的10毫升玻璃离心管中。接着，将水相转移至洁净的2毫升塑料离心管中。此时，在氮气环境下蒸发有机相和水相样品。

用50至100微升所需UPLC方法的起始溶液重新溶解干燥的样品。轻轻吹打使分析物充分溶解。然后将每个样品转移至0.22微米尼龙管式滤器中，在约14,000 ×g条件下离心约5分钟，直至样品完全通过滤膜。

检查样品，确保样品中无可见沉淀物残留。将过滤后样品的上清液转移至已预先标记的带插入式瓶盖的UPLC小瓶中。然后轻弹小瓶，去除样品瓶底部的气泡。

将样品放入预冷的自动进样器中。现在使用液相色谱仪的控制软件为有机样品创建一个运行程序。随后，根据优化的超高效液相色谱（UPLC）条件为有机样品创建一个运行程序。

采用优化的超高效液相色谱（UPLC）条件，同样为水相建立相应的方法。如果某些目标分析物是重点关注的对象，可使用这些化合物的重同位素标记类似物来优化UPLC条件，并建立分析方法。在这些条件下，让UPLC系统充分平衡。

在连接色谱柱之前，应先对溶剂进行充分的预平衡。按照制造商提供的新色谱柱平衡体积说明操作，并记录初始背压值，以便日后利用高分辨质谱仪的控制软件诊断可能出现的问题。建立正离子模式方法，然后在相同条件下建立负离子模式方法。

清洁并校准仪器。建立稳定的喷雾进入质谱仪，并留出足够时间使校准溶液充分从离子源和光学部件中消散。在使用与液相色谱方法相同流速注入校准溶液的条件下，喷雾的稳定性应至少在连续100次扫描中使信号强度的相对标准偏差达到3%至5%。

使用随机数生成器并结合密钥以随机化方式设置样品，以避免分析过程中引入任何批次效应。为所有样品设置适当的进样体积，并在第一个样品之前运行一个空白样品。

若怀疑样品间存在残留效应或基质效应，应运行足够的空白或清洗程序，开始序列并定期监测运行过程中是否出现问题，包括压力波动或信号强度下降。若发现严重问题，应立即停止运行，对仪器进行清洁和校准。

将稳定的喷雾引入质谱仪，并留出足够时间使校准溶液充分从离子源和光学部件中消散。在开始差异分析之前，手动检查总离子流，或查看样品中任意已知化合物的过滤色谱图。为确保所有样品检测的重复性以及进样、超高效液相色谱（UPLC）和喷雾的稳定性，将质谱仪生成的 RAW 数据文件转移至安装有 Sieve 软件的工作站硬盘中。

打开Sieve软件。开始新实验，并将适当的文件加载到Sieve中。分配比较组，并选择单个参考文件，以便SIE V生成分析所需的参数。

根据提示操作，并根据各个实验的具体要求调整相应参数。在参数设置中加载适用于正离子模式或负离子模式的正确加合物列表。分析完成后，检查屏幕上是否已生成帧列表。

确保液相色谱对齐覆盖所有标志性峰。如果任何未对齐的液相色谱运行在标志性峰上显示出较大偏差，则可能表明样品存在问题。

根据相似样本群体内的变异系数绘制数据。基于目标性状对列表进行排序。随后，检查各峰在不同组间的峰位置对齐是否恰当。

峰面积积分、高斯拟合、峰形、信号强度、同位素及加合物归属。根据需要导出数据，用于进一步分析，或生成靶向质谱列表以进行确认和最终的质谱实验。通过所使用的两个程序鉴定出大量匹配结果，其中绿色圆点表示在对照组中更丰富的特征，而红色圆点表示在处理组中更丰富的特征。

较大的点表示组间变化倍数的幅度增加，而颜色的强度则表明 P 值随着颜色饱和度的增加而降低。以下是色谱图，显示了有机相正离子模式下超高效液相色谱-质谱（UPLC MS）分析结果：窗口 A 展示了来自 S Civ 2.0 的总离子流。XCMS 鉴定为 D paneth 的特征的提取离子色谱图显示在窗口 B 中。窗口 C 展示了 XCMS 鉴定为 rot known 来自 sve 的特征的提取离子色谱图。

窗口 D 显示了根据总离子流归一化后鉴定为 rot known 的特征的提取离子色谱图。通过精确质量数据库搜索，初步鉴定出在 rot known 处理组中丰度降低的一个差异性特征为 d panadine。该分析物的结构通过超高效液相色谱-高分辨串联质谱（U-P-L-C-H-R）得到了确认。

此处展示的是样品与纯品化合物的色谱图及质谱图的比较。请务必注意，氯仿的使用可能具有极高的危险性，必须采取适当的防护措施，例如在通风良好的通风橱中操作。