定量检测，以研究蛋白质:DNA的相互作用，发现转录基因表达的调节，并确定新的抗肿瘤剂

该程序的总体目标是展示定量 DNA 结合测定，该测定可用于检查蛋白质 DNA 相互作用、发现基因表达的转录调节因子和鉴定新型抗肿瘤药物。这是通过首先制备具有适当生物素化 DNA 靶标的链霉亲和素包被的检测板来实现的。第二步是添加有或没有潜在抑制剂的核提取物蛋白，并让它们与 DNA 靶标结合。

接下来，用一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗检测结合的转录因子。最后一步是将辣根过氧化物酶底物添加到孔中，以引发颜色显色。最终，使用分光光度计测量显色。

随着时间的推移，颜色变化的量将表明 DNA 结合的程度和 DNA 结合的潜在抑制剂的影响。与其他技术（例如电泳迁移率变化测定）相比，该技术的主要优点是它是一种定量 DNA 抑制剂结合测定。首先，为每种测试条件准备足够数量的细胞培养物，至少由 3 乘以 10 到 7 个细胞组成。

在这里，使用了人骨髓内皮细胞，它表达 run X 2 蛋白。一旦细胞 80% 汇合。用 0.2 μg/mL 处理细胞，不含康唑，以阻止细胞生长在 G 两个 M 细胞周期边界。

这将稳定 run X 2 蛋白，并在 16 小时后产生最大的 DNA 结合。按照随附文本方案中的指示裂解细胞并分离蛋白质。分离蛋白质后，使用标准 BCA 测定法测量蛋白质浓度。

然后将样品储存在零下 80 摄氏度的 10 微升等分试样中，浓度在 2 至 5 毫克/毫升之间。通过添加 300 微升混合物，用 0.1 摩尔的碳酸钠溶液固定 96 孔板。好吧，准备足够充分，以便每个样品一式三份运行。

将板在室温下在摇床上孵育 2 小时。然后用 300 微升 strep avid 和洗涤缓冲液洗涤板 3 次，并与 100 微升生物素标记的双链寡核苷酸以每孔 1.25 纳摩尔的速度孵育 2 小时，同时摇动。接下来，用 strep din 洗涤缓冲液再洗涤板 3 次。

然后每孔添加 100 微升预混液，其中含有一种 XDNA 结合缓冲液、每孔 3 至 9 微克的 DNA 结合蛋白和每孔 1 微克的多聚 DIGC。然后将含有任何潜在抑制剂（如维生素 D 3）或适当稀释的溶剂对照（如乙醇）的预混液添加到各自的孔中。然后盖上板并将其放在 4 摄氏度的摇床上过夜，然后与细胞核提取物一起孵育。

用 strep avid 和洗涤缓冲液洗涤板 3 次。然后每孔加入 90 μL 的运行 X 两种特异性单克隆抗体，稀释至 0.2 ng/μL 和 strep avid 和洗涤缓冲液。盖上板，在室温下在摇床上孵育一小时。

然后用 strep avid 和洗涤缓冲液再次冲洗孔，并在每孔中加入 90 微升的二抗混合物，每微升含有 5 ng/μL 的 fab 特异性亲和纯化的 HRP 偶联抗体，在 strep 中稀释。AVID 和洗涤缓冲液。在室温下在摇床上孵育二抗 30 分钟。

然后用每孔 300 微升的 Strp 和洗涤缓冲液洗涤六次。接下来，通过直接从储备瓶中向每个孔中加入 50 微升四乙基 benadine 底物来显影结果，以连续监测样品。将样品放入分光光度计中，连续测量 635 纳米处的吸光度。

对于一次性测量，请将样品在室温下避光孵育 10 至 20 分钟。在此期间，井应从透明变为不同程度的蓝色。通过向每个中加入 50 微升硫酸来终止反应。

然后，使用 96 孔读板器在 450 纳米处测量每个孔的吸光度。此处显示的图表是持续监测生物活性维生素 D 3 对 run X 2D NA 结合影响的示例。测试的浓度对 run X 2D NA 结合几乎没有影响。

尽管其他维生素 D 三种化合物已被证明具有显着效果。这里测试的化合物 5 2 2 1 9 7 5 是使用计算机辅助药物设计鉴定的。经测试，该化合物表现出从 1 纳摩尔到 100 微摩尔的 rux 2 结合的剂量依赖性抑制，仅用 0.01 微摩尔的化合物就能抑制 50% 的 renx 2D NA 结合。

观看此视频后，您应该对如何进行 DNA 结合测定和测试 DNA 结合的潜在抑制剂有一个很好的了解。