稳态，稳定前的状态，单营业额动力学测量DNA糖基化酶活性
August 19th, 2013
时间8 - 羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶糖基化酶活性课程双相参展产品的形成和爆发出的线性稳态阶段。利用淬火流技术中，突发和可以测量的稳态速率，分别对应到8 - 羟基鸟嘌呤和释放从产物DNA糖基化酶切除。
以下实验的总体目标是使用快速动力学技术确定人类 8 个 OXO Guine、DNA 糖基化物的 8 个 OXO Guine 切除和产物释放的速率。这是通过首先测量低酶浓度的稳态时间过程来确定在第一次周转期间是否发生快速阶段来实现的。如果第一次周转是快速的，则稳态时间过程不会外推到零，而是将活性酶浓度反映为第二步。
预稳态期间产物形成的速率可以通过具有较高酶浓度的快速混合和淬灭技术来测量，以观察第一次周转期间的大量产物。接下来，还可以在底物被酶饱和的单次周转条件下监测化学步骤。为了在没有催化循环的情况下分离酶活性位点的事件，结果表明，根据时间过程在零时间不外推为零产物的观察，酶的产物释放在稳态期间是限速的。
这种方法可以帮助回答 DNA 唇部修复领域的关键问题。这包括 DNA 结构的影响、活性位点残基的作用、金属离子和细胞辅助蛋白对化学和产物释放的影响。首先，通过在 1.5 毫升微量离心管中的跪姿缓冲液中以 1 比 1.2 的摩尔比例混合 5 个 prime 6 fam 标记的寡核苷酸与其互补链，制备含有 8 个 OXO G 的双链 DNA 底物。
将试管放在浮子中，在沸水中浸泡 5 分钟。让水慢慢冷却至室温，然后从浮子上取下管子。在冰上 1.5 mL 微量离心管中的反应缓冲液中分别制备 DNA 底物和 OG G one 溶液。
请注意，DNA 的浓度为 400 纳摩尔，Ogg 1 的表观浓度为 30、60、90 或 120 纳摩尔，通过 Bradford 蛋白测定法测定。将反应管从冰中取出后，将试管置于 37 摄氏度的加热块中预孵育每种溶液 1 分钟。接下来，通过将等体积的 DNA 底物和 OG one 溶液混合以得到最终浓度为 200 纳摩尔 DNA 和 15、30、45 或 60 纳摩尔 OG G one 来开始反应。按列出的时间间隔取出 10 微升等分试样，并与 1 微升 1 摩尔氢氧化钠混合作为时间过程的对照，使反应淬灭。
将 10 微升不含酶的反应混合物与 1 微升 1 摩尔氢氧化钠混合。将反应样品置于 90 摄氏度的加热块中 5 分钟，以切割所得产物 AP 位点。加热后，加入 1 微升 1 摩尔盐酸以中和每个样品。
然后，向每个反应样品中加入 12 微升凝胶上样缓冲液，然后将混合物放入设置为 95 摄氏度的加热块中。两分钟后，从加热块中取出管子并将其放在冰上。将每个样品 5 微升加载到 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶上。
凝胶电泳后，使用成像仪进行扫描，该成像仪可以检测荧光标记的 DNA 并可视化底物和产物条带。凝胶成像后，如果在用氢氧化钠处理底物后观察到背景裂解，则定量条带，从每种反应产物的测量量中减去该背景。接下来，绘制在每个反应时间形成的产物量。
使用以下方程分析原始数据，以确定一个结、爆发的振幅和 VSS 线性稳态阶段的斜率 绘制相对于总蛋白质浓度的 Y 截距。提供酶活性分数的量度。使用具有零截距的线性拟合来提供校正因子，以确定活性酶的分数。
然后绘制相对于活性酶浓度的稳态，在两个单独的 1 个 5 ml 微量离心管中提供产物结合速率常数。如前所述，在反应缓冲液中制备 400 纳摩尔 DNA 底物和 80 纳摩尔活性 ogg one 溶液。将循环水浴连接到快速淬火流仪，并将温度设置为 37 摄氏度。
然后，调整仪器参数并为所需的时间点选择合适的反应回路。根据制造商的说明，制备反应缓冲液和 142 氢氧化钠淬灭溶液。在 10 毫升诱饵锁一次性注射器中。
将装有氢氧化钠的注射器连接到驱动端口，并将阀设置到加载位置。在注射器 Q 中加入氢氧化钠，以去除注射器中的气泡。来回作几次解决方案。
接下来，将带有反应缓冲液的注射器连接到驱动端口，并将缓冲液装入注射器中。B，以相同的方式，在所有阀门都处于火焰位置时，降低步进电机，直到它接触到注射器的顶部。在样品加载阀处于冲洗位置的情况下，用水和甲醇冲洗样品定量环、反应定量环和出口管路。
然后，用空气冲洗线圈和出口管路，使其完全干燥。在加盖的 1.5 毫升试管顶部打一个孔。使用 16 号针头，通过管路将管路连接到出口管路，以收集淬灭反应。
接下来，设置所需的反应。使用键盘的时间（以秒为单位）。步进电机备份后，通过添加缓冲液将一次性注射器连接到驱动端口，将注射器 B 的柱塞靠在步进电机平台上。
分别用 DNA 底物和 ogg one 溶液填充 1 毫升诱饵锁一次性注射器。将样品阀置于上样位置，将带有 DNA 底物的注射器和 ogg one 溶液连接到每个样品上样端口，然后用溶液组填充样品定量环。所有注射器加载阀和样品加载阀都通过按下 G 键开始反应。
按下 G 键后，步进电机推动注射器顶部以启动和淬灭反应。36 μL 反应混合物后，用 86 μL 的 142 毫摩尔自动淬灭。氢氧化钠从出口管线收集样品。
反应完成后，将注射器负载阀设置到负载位置，将样品负载阀设置到冲洗位置。用水和甲醇冲洗样品定量环、反应定量环和出口管路，并完全干燥冲洗区域。对每个时间点重复前面的步骤。
确定背景校正。使用快速淬灭仪进行无酶对照实验。用 DNA 底物填充 DNA 样品环，但保持 ogg one 样品环为空。
设置反应时间。使用与以前相同的条件进行混合和淬灭。用两摩尔氢氧化钠、两摩尔盐酸水和甲醇清洗样品定量环，然后干燥清洗后的管路。
将步进电机设置到原位后，将注射器负载阀切换到负载位置，并用水清洗驱动储液罐。加热淬灭的反应样品后，通过 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离底物和产物 DNA。然后如上所述观察和量化凝胶上的条带。
以前通过非线性回归分析将产物形成的时间过程拟合到以下方程中，其中上升指数和线性项提供一阶速率常数 K 观察到的爆发幅度、一个结和一个线性速率 VSS。对于单一周转时间过程实验。在单独的 1.5 毫升试管中制备 100 纳摩尔 DNA 底物和 500 纳摩尔活性 ogg one 溶液。
使用前面描述的条件，准备快速淬灭流仪器，并以相同的方式进行反应和预稳态时程实验。一旦淬灭的样品被加热并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，如前所述观察和定量凝胶上的条带。最后，将产物形成的时间过程拟合为单个指数，以确定以下方程中给出的一阶速率常数。
通过使用 200 纳摩尔的 DNA 底物和四种不同浓度的 ogg 进行稳态动力学分析。一种通过 Bradford 蛋白测定法确定。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解产物和裂解底物。
产物形成的时间过程拟合线性方程以确定 y 截距，相对于每种蛋白质浓度分别为 2.2 1115 和 26 纳摩尔，进一步绘制相对于每种实际蛋白质浓度的 Y 截距。测定活性酶的分数为线斜率的 38%，以确定稳态速率。先前确定的 VSS 值是相对于 Y 截距绘制的。
该线的斜率为每秒 0.0028，这相当于 DNA 糖基酸连接活性形成的产物的解离速率常数。使用 200 纳摩尔、DNA 底物和 40 纳摩尔活性 OG 一遵循前稳态时间进程。产物形成的时间过程可以拟合到具有上升指数和线性项的方程。
Kay observed 和 koff 分别被确定为每秒 0.75 和 0.0055。在单次周转条件下，8 个 Oxo g 切除反应在 6 秒内完成。产物形成的时间过程可以拟合到单个指数方程，并产生每秒 0.74 观察到的 K。
观看本视频后，您应该对如何分离催化循环过程中的关键步骤以及测量化学和酶周转速率有很好的了解。
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概述
本研究探讨了8-oxoguanine DNA糖基化酶的糖基化酶活性，揭示了其特征为初始产品形成的爆发期后跟随线性稳态期的双相时间过程。研究采用快速动力学技术测量这些阶段，为酶动力学提供了洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 酶动力学
- 分子生物学
背景
- 8-oxoguanine是一种常见的DNA损伤，可能导致突变。
- DNA糖基化酶在DNA修复机制中起着关键作用。
- 理解糖基化酶的动力学可以为治疗策略提供信息。
- 快速动力学技术允许对酶活性进行详细分析。
研究目的
- 确定8-oxoguanine切除和产品释放的速率。
- 评估酶的首次周转过程中是否存在快速阶段。
- 在不同条件下分离酶活性位点的事件。
使用的方法
- 猝灭流动技术测量爆发和稳态速率。
- 低酶浓度下的稳态时间过程测量。
- 高酶浓度下的快速混合和猝灭技术。
- 单周转条件监测化学步骤。
主要结果
- 研究确认了糖基化酶的双相活性谱。
- 产品释放被确定为稳态期间的速率限制步骤。
- 初始周转是快速的，表明显著的酶活性。
- 结果表明酶浓度影响观察到的动力学。
结论
- 8-oxoguanine DNA糖基化酶的动力学是复杂的且双相的。
- 理解这些动力学对阐明DNA修复机制至关重要。
- 未来的研究可能探索糖基化酶活性的治疗意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative kinetic dissection of DNA glycosylase activity enables mechanistic de-risking at the target validation stage for DNA repair enzyme programs. Measuring steady-state, pre-steady-state, and single-turnover rates provides predictive confidence in the catalytic efficiency and turnover limitations of OGG1, informing early portfolio triage and downstream assay development. These kinetic insights are critical for prioritizing DNA repair targets and optimizing lead identification strategies in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise measurement of catalytic steps to clarify rate-limiting events in DNA repair enzymes.
- Supports functional target validation by isolating chemistry versus product release steps.
- Provides mechanistic data to de-risk target selection and inform pathway interrogation.
- Facilitates predictive confidence in enzyme activity for portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated kinetic parameters for robust assay design and standardization.
- Enables reproducible quantification of enzyme activity across compound screens.
- Supports scalability and platform reuse by defining assay windows and detection thresholds.
- Improves reliability of compound evaluation by distinguishing between chemistry and turnover limitations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns kinetic outputs with disease-relevant DNA repair mechanisms when modeling cellular contexts.
- Provides continuity from biochemical validation to preclinical model selection for DNA repair targets.
- Informs risk-adjusted advancement by quantifying rate-limiting steps that may impact in vivo efficacy.
- Supports translational biomarker development by linking enzyme kinetics to functional DNA repair outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This kinetic measurement workflow bridges early discovery, assay development, and preclinical validation for DNA repair enzyme programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of catalytic mechanisms and clarifies pathway bottlenecks.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for compound triage and assay optimization.
- Analytics: Delivers rate constants and burst amplitudes to compare enzyme variants or conditions.
- Translational Research: Connects biochemical kinetics to preclinical model selection and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable kinetic profiling capability for diverse DNA repair targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes kinetic measurements for reproducibility and cross-team comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA repair enzyme programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzyme kinetics and rapid mixing instrumentation.
- Needs access to fluorescence detection and gel-based analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay conditions and data analysis.
- May require adaptation for different DNA repair enzymes or lesion types.
- Manual and rapid mixing steps may limit throughput for large-scale screening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Sample Preparation and Measurement of Steady-state Time Course and Active Site Titration of OGG1
5:53
Measurement of Pre-steady-state Time Course
10:56
Single-turnover Time Course
11:50
Results: Kinetic Measurements of DNA Glycosylase Activity
14:01
Conclusion
