用于生物传感器应用的微流控芯片上捕获-环加成反应可逆固定小分子或多组分结构

以下实验的总体目标是展示一种快速且具有广泛适用性的策略，可逆地将小分子和功能化纳米颗粒固定在传感器芯片表面。该策略首先在传感器表面固定抗GST抗体，第二步捕获GST抗原。

通过修饰反式环辛炔（trans-cyclooctyne）或四嗪（tetrazine）基团，可提供一个反应性表面，用于后续与小分子四嗪衍生物或纳米颗粒反式环辛烷缀合物进行的环加成反应，这些缀合物随后被小分子四嗪衍生物进一步功能化。接下来，功能化表面可用于与目标可溶性分子的相互作用分析。最后一步中，表面可被再生，从而实现连续的捕获-环加成循环。结合结果表明，芯片上的生物正交反应能够保持固定化小分子或原位功能化的纳米颗粒与FKBP12靶标相互作用的能力，展示了该方法如何拓展表面等离子体共振（SPR）技术的应用范围。

该芯片上捕获循环修饰技术的主要优势在于，能够快速、可逆地控制小分子的取向及其固定密度，实现小分子的灵活固定与释放。通常，捕获循环修饰过程可在数分钟内完成，显著缩短了表面准备时间。以下步骤由本实验室学生 Jason Sandler 演示。开始实验时，将 8 µL 的 DMSO 溶液中 50 mM T-C-O-N-H-S 溶液加入 100 µL 的 PBS 溶液中 1 mg/mL GST 溶液中。室温下振荡混合物反应一小时后，使用 Zeba 脱盐离心柱去除多余的试剂。

接下来，将6 µL的25 mM四-NHS酯DMF溶液加入到75 µL浓度为1 mg/mL的GST PBS溶液中，室温下震荡反应1小时。用25 µL PBS稀释反应混合物，并使用离心脱盐柱进行纯化。然后，将100 µL的50 mM T-C-O-N-H-S溶液加入到150 µL的活化纳米颗粒溶液中，以同样方式震荡混合物。

混合后，使用 NAP 10 柱通过凝胶过滤去除过量试剂。用 PBS 缓冲液洗脱，收集含有 N-P-T-C-O 产物的有色条带。

将纯化后的样品转移至含有截留分子量为100,000的离心过滤装置的离心管中。通过离心将样品浓缩至终体积约150微升。向N-P-T-C-O溶液中加入50微升DMSO中0.1摩尔的氰基乙酸酐溶液。

室温下振荡混合物一小时后，使用NAP 10柱并以PBS洗脱，通过表面等离子体共振仪纯化N-P-T-C-O产物，在AM固定化向导模板中选择在1号和2号流动池进行固定化。通过注射0.4摩尔EDC与0.1摩尔NHS的1:1溶液持续480秒，修改Amin方法以活化表面羧基。以每分钟10微升的流速，设定乙醇胺注射以淬灭剩余的活化酯，接触时间设为422秒，流速为每分钟10微升。

输入配体名称 anti GST，并设置以每分钟 10 微升的流速注射 420 秒的结合时间。接下来，将先前准备好的溶液瓶放入试剂架二中。分配文件名和数据保存位置后，务必根据内容列表核对各溶液瓶的位置。

开始固定化。编辑固定化向导程序，仅在参考流通池一上以每分钟5微升的流速注入20微克/毫升的GST配体溶液，持续420秒。将装有先前配制的10微摩尔TERAZ olaine溶液和再生溶液的G-S-T-T-C-O-A小瓶放入试剂架二中。

选择手动运行模式，将流速设置为每分钟5 µL，流路设置为流通池2。注入GST-TCO溶液420秒，随后注入四嗪苯胺（Teraz Benz Lamine）溶液600秒。之后，用再生溶液连续注射两次，每次32秒，以再生表面。

将 GST TERAZ 双烯、N-P-T-C-O、teraz Belamine 以及再生溶液小瓶放入试剂架二后，选择仪器的手动运行方法，然后将流速设置为 5 µL/min，流路设置为流通池二。注入 GST Tetra 双烯溶液 60 秒，随后注入 N-P-T-C-O 溶液 60 秒。最后，注入 tetras 双烯 belamine 溶液 60 秒。

完成后，以相同方式重新生成表面。接下来，选择一种新方法并输入常规参数，包括数据采集、速率检测、样品室、温度、浓度单位和缓冲液设置。在检测步骤面板中，创建一个新步骤并将其命名为样品。

然后设定目的，并在循环类型面板中将基于设置的参数连接至样品，创建一个新的循环步骤并插入以下命令：捕获样品再生一和再生二。选择捕获命令，并输入 G-S-T-T-C-O 作为配体。

将接触时间设为120秒，流速设为每分钟5微升，并将流路设置为第二通道。然后选择样品命令，输入182秒的接触时间、62秒的解离时间、每分钟30微升的流速，并将流路设置为双通道。

此后，选择再生一步命令并输入再生溶液。设定第32次接触时间为每分钟30 µL，并将流路设置为第二通道。对再生步骤重复相同的程序。

选择双指令以设置、运行，并将流路设为二杠一。选择“下一步”，在样品列表中填入四苯并吩嗪分析物溶液，以及浓度系列为1.5至20微摩尔、按1:2稀释的样品。然后选择“下一步”进入样品架位置面板。

将溶液瓶置于试剂架二后，在96孔板中设置稀释系列，注意与内容列表中的位置相对应。

保存方法模板并启动结合分析。当选择了一种新方法并设定了常规参数后，在分析步骤面板中创建并命名捕获样品和再生步骤。随后，选择相应的用途并连接基础设置。

然后选择循环类型面板并创建三个循环步骤：捕获、上样和再生。在捕获循环下插入两次捕获命令。

在“捕获一”面板中，选择捕获溶液作为变量。然后将接触时间设置为300秒，流速为5 µL/min，并在“捕获二”面板中将流路设置为第二通道。

选择捕获溶液作为变量。设置接触时间为250秒，流速为每分钟5 µL，并将流路设置为第二通道。接下来，在样品循环步骤下插入样品指令。

选择样品通道，将结合时间设置为 60 秒，解离时间设置为 200 秒，流速为 30 微升每分钟，并将流路设置为双通道。在再生循环步骤下插入两次再生指令，选择再生一通道，输入再生溶液。

设定接触时间为30秒，流速为每分钟30微升，并将流路设置为第二通道。再生步骤采用相同操作。双通道选择设置，运行并选择流路为二杠一，点击下一步，输入G-S-T-T-C-O和teraz AP 1,497偶联物作为捕获溶液名称，FKBP 2作为样品名称，浓度系列为1.5至96纳摩尔，按1:2倍比稀释。

将溶液小瓶放入试剂架二中，并将稀释系列加入96孔板后，保存方法模板并开始结合分析。对生物活性小分子进行高效、可逆的固定化，同时控制其取向和密度，在新型生物传感器应用的开发中起着关键作用。此处展示的是对特拉唑嗪苯偶姻固定化过程的实时监测。

将G-S-T-T-C-O溶液注入预先固定化抗GST的表面，导致响应值上升约400 R RU。随后注入特拉嗪苯并胺，响应值迅速上升15 RU。切换至运行缓冲液后，未观察到抗原解离现象，表明该复合物具有结构稳定性。

在循环的最后一步对表面进行再生，以实现多次捕获循环。通过该方法，将四嗪-苄基胺部分替换为四嗪-AP 1,497 偶联物，可生成一种用于与其靶标进行相互作用研究的生物活性表面。FK BP 12 破坏抗体-抗原相互作用后，可使抗 GST 表面再生，从而构建新的分子组装体。

在此情况下，先注射 GST TERAZ 偶氮苯，随后注射 N-P-T-C-O，从而将纳米颗粒有效固定在传感器表面。纳米颗粒上未反应的 TCO 基团可与注射的四嗪苯甲胺发生环加成反应。或者，可使用 TET INE AP 1,497 偶联物来监测功能化纳米颗粒与 FK BP 12 的相互作用。

未观察到多组分结构发生解离，表明该结构具有稳定性及生物活性，并具备实时监测固定化反应和表面再生的能力。此处展示了如何简便地表征结合速率KA。反应动力学知识为控制固定化密度以及生物传感器检测中的重要参数提供了指导依据。

在 GST-T-C-O 或 GST 三唑嗪表面分别重复注射浓度递增的特拉唑胺或 N-P-T-C-O，可获得结合数据。同一表面连续两次相同浓度分析物样品的结合数据几乎完全重叠，表明抗体结合能力损失极小。由于经历了多次捕获循环及再生循环，评估软件可为该循环反应提供最佳拟合的动力学分析结果。

我们开发了一种利用抗体-抗原捕获并结合四嗪与反式环辛烯之间快速、高特异性环加成反应的方法，可实现小分子的快速可逆固定。对于基于SPR芯片的研究，捕获-环加成方法仅需短时间接触，并使用低于10微摩尔浓度的小分子配体。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用捕获-环加成方法将小分子或多组分结构固定在传感器表面。

为此，必须使用高质量的试剂进行偶联反应，并在 SPR 仪器上正确设置检测参数。