Name: 成年斑马鱼视网膜再生研究中使用的一种新型的光损伤范式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解一种结合紫外线与持续光照的新型光损伤范式，用于成年斑马鱼视网膜再生研究。该方法能有效损伤视杆与视锥细胞，为神经科学与视网膜再生机制研究提供可靠实验模型。

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作者谨此感谢 Xixia Luo 在鱼类饲养和技术支持方面的出色工作。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R21EY019401（RT）和 P30EY04068（RT），以及 RT 获得的启动资金，其中包括由“预防失明研究”组织向韦恩州立大学眼科系提供的无限制资助。JT 获得了韦恩州立大学研究生院提供的 Thomas C. Rumble 研究生奖学金支持。

本方案中描述的所有实验程序均经韦恩州立大学医学院动物使用委员会批准。
1. 暗适应
<ol>
	<li>将约10条成年白化或有色斑的斑马鱼从常规饲养系统转移到黑暗的封闭环境中。如果有条件，使用斑马鱼饲养模块中内置的暗盒装置，以保持水流正常通过鱼缸。（若无此类系统，可将鱼缸置于完全黑暗的封闭环境中，并确保通过氧气对鱼进行充气供氧）。</li>
	<li>将鱼在黑暗环境中饲养10天。在喂食或向暗盒中添加新鱼时，应尽可能迅速操作，避免使鱼长时间暴露于光照下。</li>
</ol>
2. 紫外光照射
<ol>
	<li>确保紫外光源的电源已关闭。从荧光体视显微镜上取下紫外灯丝。
	<ol>
		<li>使用一个倒置的直径为15 cm的玻璃培养皿（或高度相似的约2 cm的物体）作为紫外灯丝的支架。用胶带将培养皿固定在实验台上。</li>
		<li>将紫外灯灯丝固定在倒置培养皿的顶部，调整位置使灯丝末端约有 2 mm 伸出培养皿边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取一个 250 ml 玻璃烧杯。盖上 &#189; 烧杯的底部、侧面和背面用铝箔包裹，确保 &#34;有光泽的&#34; 锡箔的内侧朝向烧杯内部。如果烧杯带有刻度，用锡箔覆盖有文字的一半烧杯壁，使透明的一半烧杯壁暴露。</li>
	<li>从鱼类养殖系统中取100 ml水注入250 ml烧杯中。</li>
	<li>将250 ml烧杯放入4 L烧杯中。向4 L烧杯中加水，直至水位与250 ml烧杯上的100 ml刻度线齐平。</li>
	<li>将最多10只经暗处理的动物加入250 ml烧杯中。用一小片铝箔覆盖250 ml烧杯。</li>
	<li>将整个烧杯装置紧邻紫外灯丝放置，灯丝应接触4 L烧杯的外壁，并对准250 ml烧杯的暴露部分。确保250 ml烧杯位于4 L烧杯底部中央。</li>
	<li>在4升烧杯后方放置一个大型不透明屏幕，以便动物能够接受照射，但防止实验室人员看到紫外灯丝的尖端。警告：务必在打开紫外光源电源之前确保该屏障已放置到位。</li>
	<li>打开紫外光源，设置定时器为30分钟。放置必要的警示标签，以确保实验室人员不会意外暴露于紫外辐射。</li>
	<li>30分钟后，关闭紫外光源。取出装有鱼的250 ml烧杯。注意：如果需要进行多轮紫外照射，在重复照射程序前，需让光源冷却约20分钟。每次照射前，务必用100 ml新鲜系统水替换原有水体。4 L烧杯中的水无需更换。</li>
</ol>
3. 卤素灯光照暴露
<ol>
	<li>将鱼从250 ml烧杯转移至1.8 L透明丙烯酸鱼缸中，并加水至溢流刻度线。</li>
	<li>设置卤素灯光照处理区域。从当地五金店获取四个250 W卤素工作灯。将其中两个灯朝同一方向放置，中心间距为29 cm。另两个灯以相同方式排列。
	<ol>
		<li>将第二组灯置于与第一组灯相对的位置，两组灯之间相距约73 cm，形成一个29 × 73 cm的矩形光照处理区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从当地五金店获取一个小风扇，将其放置在两组灯之间的正中央，紧靠光照处理区域外侧。</li>
	<li>在光照处理区域中心位置放置两个盛满水的1.8 L鱼缸，使其与两组灯等距。灯与鱼缸外壁之间的距离应约为29 cm。注意：即使仅在一个1.8 L鱼缸中处理10条鱼，也应采用此布局，两个鱼缸均需使用，以确保每个鱼缸的水温维持在合适范围内。</li>
	<li>在每个鱼缸中放置一个增氧器。</li>
	<li>用透明丙烯酸盖子盖住每个鱼缸，在靠近风扇的一端留出约2 cm的缝隙。调整风扇位置，使其向该缝隙吹风。在一个或两个鱼缸中放入温度计。</li>
	<li>打开光源、风扇和增氧器的电源，持续光照处理最多4天。在光照处理期间不应喂食鱼类，以免影响水质并增加动物应激。</li>
	<li>每日监测温度和水位，将水温维持在30–33 °C。如有必要，调节风扇速度和/或鱼缸与光源之间的距离。
	<ol>
		<li>根据需要补充系统用水，通常每日一次。</li>
		<li>应始终使用健康的成年斑马鱼（通常为6–9月龄），以维持接近100%的存活率。若发现鱼死亡，应立即移除死鱼，并更换整个鱼缸的水。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织采集
<ol>
	<li>卤素灯处理开始后 48 小时，将斑马鱼从处理区域中移出。
	<ol>
		<li>配制新鲜的乙醇甲醛固定液（1 份 37% 甲醛，9 份 100% 乙醇）。</li>
		<li>使用过量麻醉剂 2-苯氧乙醇（0.4 mg/L）处死斑马鱼。</li>
		<li>将处死的斑马鱼转移至纸巾上，用弯头镊子摘除眼球。</li>
		<li>将摘除的眼球放入固定液中，并在 4 °C 下过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对眼球进行冷冻保护处理。
	<ol>
		<li>在室温下用 5% 蔗糖 1x PBS 洗涤眼球 30 分钟，然后更换为新鲜的 5% 蔗糖 1x PBS，继续孵育 2 小时。接着，在 4 °C 下用 30% 蔗糖 1x PBS 过夜洗涤眼球。随后，在 4 °C 下用组织冷冻介质与 30% 蔗糖 1x PBS 按 1:1（等体积）混合液过夜洗涤眼球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将眼球包埋于 100% 组织冷冻介质中，并在 -80 °C 下保存。包埋时应调整眼球方向，以便后续在背腹轴方向进行冷冻切片。</li>
	<li>对组织进行冷冻切片并贴附于载玻片上。将载玻片在 55 °C 下温育 2 小时。切片载玻片可于 -80 °C 保存，或立即进行常规免疫组织化学染色。</li>
	<li>对切片组织进行常规免疫组织化学染色，并使用荧光显微镜成像40,51。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了短时间紫外线照射与持续强光照射相结合，可导致广泛的感光细胞丢失，并引发强烈的再生反应。与单独的LIRD方法相比，这种联合方法也是损伤视网膜两侧视杆细胞和视锥细胞最有效的方案。重要的是，该处理方法在有色动物以及albino动物中均有效。
尽管我们提供的证据表明，与单独的LIRD方法相比，联合方案可导致更广泛且更一致的损伤，但在选择LIRD范式之前，仍需讨论相关的科学考量。我们的数据表明，当收集整个视网膜组织用于分析时，应采用联合方法即 蛋白质组学、实时PCR）。我们发现，联合方法产生的病灶面积最大，其次是卤素照射，最后是紫外照射。我们建议，在研究可能对视杆细胞和视锥细胞再生产生差异性影响的基因或通路时，也应采用联合方法。如果由于实际原因无法实现，我们的数据表明，若分析仅限于背侧中央视网膜，则紫外照射是这些研究中的次优方法。
选择合适的LIRD方法时，还需考虑一些实际因素。首先需要关注的是必要设备的成本。所有实验方案均需要较长的暗适应时间（数据未显示）。虽然将自成一体的暗室集成到斑马鱼...

光诱导视网膜变性（LIRD）常用于啮齿类动物和斑马鱼中以损伤视杆细胞和视锥细胞。在成年斑马鱼中，光感受器变性会触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并产生瞬时扩增的祖细胞。这些祖细胞在迁移到受损区域的过程中持续增殖，最终分化为新的光感受器细胞。目前，已有两种广泛应用的LIRD模型，每种模型均导致不同程度的光感受器丢失，并引起相应的再生反应差异。随着越来越多的遗传学和药理学工具可用于研究特定基因在再生过程中的作用，迫切需要建立一种可靠的LIRD模型。本文描述了一种LIRD实验方案，该方案可导致视杆细胞和视锥细胞广泛且一致地丢失，其结合了两种先前已建立的LIRD技术。此外，该方案还可扩展应用于色素型动物，从而避免了在LIRD研究中必须将目标转基因品系维持在albino背景下的需要。

<table><tbody><tr><td>紫外光源</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿（150 × 20 mm）</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 玻璃烧杯</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 L 玻璃烧杯</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W 卤素灯</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明丙烯酸水箱</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明丙烯酸水箱盖</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>风扇</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>曝气器</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子（5/45）</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于成年斑马鱼视网膜再生研究的新型光损伤模型

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

光诱导视网膜变性（LIRD）常用于啮齿类动物和斑马鱼中以损伤视杆和视锥光感受器。在成年斑马鱼中，光感受器变性会触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并产生瞬时扩增的前体细胞。这些前体细胞在迁移至受损区域的过程中持续增殖，最终分化为新的光感受器。目前存在两种广泛应用的LIRD模型，每种模型均导致不同程度的光感受器丢失，并引发相应的再生反应差异。随着越来越多的遗传学和药理学工具可用于研究特定基因在再生过程中的作用，建立一种稳定的LIRD模型变得尤为必要。本文描述了一种LIRD实验方案，可实现视杆和视锥光感受器广泛且一致的丢失，该方法结合了两种先前已建立的LIRD技术。此外，该方案还可拓展应用于色素型动物，从而避免在LIRD研究中需将目标转基因品系维持在白化背景上的需求。

此前描述的联合光照处理方案与每种单独的LIRD方法进行了比较。在黑暗处理的成年白化动物中（图3-5），每种单独的光照处理均导致视杆（图3）和视锥（图4）光感受器显著丢失。然而，这两种单独处理主要损伤视网膜背侧半部的光感受器，而腹侧视网膜则相对受到保护，免受光照处理的影响（图3和4）。此外，与卤素光照处理相比，紫外光照处理在视网膜背侧半部造成更多的视锥光感受器损伤（分别比较图4B与4C）。联合使用紫外光和卤素光照处理导致整个视网膜中视杆和视锥光感受器的丢失程度显著增加，基本消除了视网膜腹侧半部的神经保护作用（图3和4）。与单独的LIRD方法相比，采用联合光照处理方案时，在腹侧视网膜也观察到相应的细胞增殖增加（图5）。
由于视网膜色素...

已有多种光损伤方案被用于损伤感光细胞，从而诱导成年斑马鱼的视网膜再生反应。本方案描述了一种改进的方法，适用于有色系动物，并可损伤整个视网膜中绝大多数的视杆细胞和视锥细胞。

光诱导视网膜变性（LIRD）常用于在啮齿类动物和斑马鱼中损伤视杆细胞和视锥细胞光感受器。在成年斑马鱼中，...

本实验的总体目标是结合两种先前描述的光诱导视网膜变性方法，以实现对整个视网膜中视杆细胞和视锥细胞光感受器的广泛损伤。该过程首先将暗适应的成年斑马鱼暴露于紫外光下30分钟；第二步是立即将经紫外光处理的斑马鱼转移至四周环绕四个250瓦卤素灯的水族箱中，并使其持续暴露于光照下长达四天。最后一步是处死鱼类并摘除眼球以进行后续分析。最终，通过免疫荧光显微镜检测显示，视网膜中视杆细胞和视锥细胞均出现一致性的丢失。该技术相较于现有方法（如紫外线照射或卤素灯照射处理）的主要优势在于，结合这两种方法可实现视网膜中视杆细胞和视锥细胞的完全消融。光感受器受损会引发广泛的细胞增殖反应，最终导致丢失的光感受器再生。本技术将由我实验室的研究生 Jennifer Thomas 进行演示。首先，使用一个直径为 15 厘米的倒置玻璃培养皿作为支架，并将其用胶带固定在实验台上以进行紫外光照射。从荧光体视显微镜上取下紫外光源灯丝。然后将紫外光源灯丝用胶带固定在倒置的培养皿上方，使灯丝末端约两毫米伸出培养皿边缘。接着，用铝箔覆盖250毫升玻璃烧杯底部两侧及背面的一半区域，并确保铝箔的亮面朝向烧杯内部。接下来，从鱼类养殖系统中取100毫升水加入烧杯中。将该烧杯放入一个4升的烧杯内，然后向4升烧杯中加水，直至水位与250毫升烧杯中的100毫升刻度线齐平。将最多10条经暗处理的鱼放入250毫升烧杯中，用一小片铝箔覆盖该250毫升烧杯。随后立即将整个烧杯装置紧邻UV灯丝放置。灯丝应接触4升烧杯的外侧，并正对250毫升烧杯的暴露部分。确保将250毫升烧杯置于4升烧杯底部中央。随后，在4升烧杯后方放置一个大型不透明遮挡板，以使动物能够暴露在紫外线下，但防止实验室人员看到紫外灯丝的尖端。然后打开紫外电源。设置计时器为30分钟，并放置必要的警告标签，以确保不知情的实验室人员不会意外暴露于紫外辐射。30分钟后，关闭紫外光源，然后取出装有鱼的250毫升烧杯。在此步骤中，将鱼从250毫升烧杯转移至1.8升透明丙烯酸鱼缸中。接着，向鱼缸注水至溢流标记处，以设置卤素灯光照处理区域。将两个250瓦卤素工作灯以相同方向放置，并使其距离鱼缸29厘米。然后以类似方式将另外两个灯放置在对侧，两组灯之间相距约73厘米。接着，将风扇置于两组灯之间的正中央，位于光照处理区域外侧。随后，在光照处理区域的中心位置放置两个装有水的1.8升水箱，使其到两组灯的距离相等。然后在每个水箱中放入一个氧气曝气器。用透明亚克力盖将每个水箱盖住，在靠近风扇的一端留出两厘米的缝隙。调整风扇位置，使其向该缝隙吹风，并在其中一个或两个水箱中放置一支温度计。接下来，打开灯光、风扇和曝气装置的电源。光照处理持续最多四天。在光照处理期间不应喂食鱼类，因为这会影响水质，并增加动物的应激反应。每天监测温度和水位，并将温度维持在30至33摄氏度。必要时，调节风扇速度以及水箱与光源之间的距离。同时，每天用系统水补充每个水箱的水量。在卤素灯处理开始后48小时，将斑马鱼从处理区域中取出。接着，准备新鲜的乙醇甲醛固定液，并使用过量的三卡因甲烷（tricaine methanesulfonate）麻醉剂处死斑马鱼。之后，将已处死的斑马鱼转移至纸巾上，然后用一对弯头镊子摘除眼球。将带细胞核的眼球与固定剂在4°C条件下过夜保存，以进行冷冻处理。注意保护眼球。在室温下，用5%蔗糖和一倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤30分钟。然后用新鲜的5%蔗糖1×PBS替换，并将眼球置于其中保持2小时。2小时后，用30%蔗糖1×PBS在4摄氏度下过夜清洗眼球。次日，将眼球置于1:1的组织冷冻介质与30%蔗糖1×PBS溶液中，在4摄氏度下继续过夜清洗。随后，将眼球置于100%组织冷冻介质中，并沿背腹轴方向定位。然后在-80°C条件下保存至少两小时，再进行组织冷冻切片。现在将组织进行冷冻切片，并置于载玻片上。然后在 55 摄氏度下将载玻片加热两小时。之后，将载玻片在 -80 摄氏度下保存，或立即进行标准免疫组织化学染色，并用荧光显微镜成像。该图显示了在不同光损伤范式下增殖反应的变化情况。以下是成年白化斑马鱼的视网膜切片，使用PCNA进行免疫标记，以显示在不同光损伤范式下，视网膜背侧和腹侧半区在零小时时细胞增殖情况（红色所示）。在48 HLT时，增殖现象在中间层中消失。在视网膜背侧的内核层（INL）中可见单个的前体细胞，且在腹侧视网膜的一小部分区域也存在此类细胞。在紫外线照射后48小时（HPUV）。背侧视网膜中存在成列的前体细胞，而腹侧视网膜的小部分区域仅存在单个前体细胞。在紫外线照射加48小时时，背侧和腹侧视网膜均出现大量成列的前体细胞。该图显示了在不同光照损伤范式下，有色斑马鱼视杆细胞和视锥细胞光感受器的丢失情况。图中视网膜切片经 Pro3 染色以显示细胞核（蓝色），并经免疫标记：使用 zpr-3 抗体标记视杆细胞外节（品红色），或使用 zpr-1 抗体标记双视锥细胞（金色），以观察各光照损伤范式后的变化。在 48 小时光照后（HLT），背侧视网膜中视杆光感受器细胞核显著减少；在紫外光加 48 小时光照后（UV plus 48 HLT），背侧和腹侧视网膜均出现显著减少。尽管在48 HPUV时背侧视网膜的细胞核出现肥大，但在48 HLT或48 HPUV时双锥体细胞核数量并未出现显著减少。在UB加八小时光照治疗（H lt）后，背侧和腹侧视网膜的细胞核数量均出现显著减少。将该方法与其他技术（如基因特异性药物抑制剂或体内蛋白敲低）相结合，可揭示单个基因在光感受器退变及其后续再生反应中的作用。

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成年斑马鱼视网膜再生研究中使用的一种新型的光损伤范式

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