成年斑马鱼视网膜再生研究中使用的一种新型的光损伤范式

多个光损伤协议已损坏感光细胞，从而诱发成年斑马鱼视网膜的再生反应。此协议描述了一种改进的方法，可以用在着色的动物，并在整个视网膜杆和视锥细胞，损害绝大多数。

该程序的总体目标是结合两种先前描述的光诱导视网膜变性方案，以损害整个视网膜的视杆细胞和视锥细胞光感受器。这是通过首先将深色适应的成年斑马鱼暴露在紫外线下 30 分钟来实现的。第二步是立即将经过紫外线处理的鱼转移到被四个 250 瓦卤素灯包围的鱼缸中，并将鱼暴露在连续光照下长达四天。

最后一步是对鱼实施安乐死，并将眼睛成核以进行进一步分析。最终，免疫荧光显微镜用于显示整个视网膜中视杆细胞和视锥细胞光感受器的持续丢失。与紫外线治疗或卤素灯类治疗等现有方法相比，该技术的主要优点是，将这两种方法相结合，可以在整个视网膜中消融视杆细胞和视锥细胞。

对光感受器的损伤会诱导广泛的增殖反应，最终导致丢失的光感受器再生。演示这项技术的将是我实验室的研究生 Jennifer Thomas。首先，使用直径为 15 厘米的倒置玻璃培养皿用作支架，并将其粘在实验室工作台上以进行紫外线照射。

从荧光立体显微镜中取出紫外灯丝。然后将紫外线灯丝贴在倒置培养皿上方，并让灯丝末端约两毫米悬垂在培养皿上。之后，用铝箔覆盖 250 毫升玻璃烧杯的底部和背面的一半，并确保铝箔的闪亮面面向烧杯的内部。

接下来，用来自鱼类设施系统的 100 毫升水装满烧杯。将此烧杯放入 4 升烧杯中。然后将 4 升烧杯中装满水，直到水位与 250 毫升烧杯中的 100 毫升水线持平。

在 250 毫升烧杯中最多 10 条经过深色处理的鱼时，用一小块铝箔覆盖 250 毫升烧杯。接下来，将整个烧杯装置紧邻 UV 细丝。细丝应接触 4 升烧杯的外部，并面向 250 毫升烧杯的外露部分。

确保 250 毫升烧杯位于 4 升烧杯底部的中心位置。然后，在 4 升烧杯后面放置一个大的不透明筛网，这样可以让动物暴露在外，但会阻止任何实验室人员看到紫外线细丝的尖端。然后打开 UV 电源。

将计时器设置为 30 分钟并放置必要的警告标签，以确保毫无戒心的实验室人员不会意外地将自己暴露在紫外线辐射下。30 分钟后，关闭 UV 电源。然后取出装有鱼的 250 毫升烧杯。

在此过程中，将鱼从 250 毫升烧杯转移到 1.8 升透明丙烯酸鱼缸中。接下来，将水箱加注至溢流标记处，以设置卤素灯灯处理区域。沿同一方向放置两个 250 卤素多用灯，并与水箱保持 29 厘米的距离。

然后以类似的方式将另外两盏灯放在另一侧，在两组灯之间留出约 73 厘米的距离。之后，将风扇等距放置在光疗区外的两组灯之间。随后，在光处理区的中心放置两个装满水的 1.8 升水箱，两组灯之间的距离相等。

然后在每个水箱中放置一个氧气曝气器。用透明的丙烯酸盖住每个水箱，在最靠近风扇的一端留出 2 厘米的间隙。布置风扇，使其将空气吹入该缝隙，然后将温度计放入一个或两个水箱中。

接下来，打开灯、风扇和曝气器的电源。保持光疗长达 4 天。在光照处理期间不应喂食鱼，因为这会影响水质并给动物带来更大的压力。

每天监测温度和水位，并将温度保持在 30 至 33 摄氏度。如有必要，根据水箱和灯之间的距离调整风扇速度。还要每天用系统水填充每个水箱。

卤素光处理开始 48 小时后，将鱼从处理区域移走。接下来，准备新鲜的乙醇，以隐藏固定剂，用麻醉剂过量的屯氧乙醇对斑马鱼实施安乐死。之后，将安乐死的斑马鱼转移到纸巾上，然后用一对弯曲的镊子给眼睛去核。

将有核的眼睛和固定剂在 4 摄氏度下放置过夜至冷冻。保护眼睛。在室温下用 5% 蔗糖 1 XPBS 洗涤 30 分钟。

然后用新鲜的 5% 蔗糖 1 XPBS 替换它，并保持眼睛 2 小时。两小时后，用 30% 蔗糖清洗眼睛，在 4 摄氏度下放置 1 个 XPBS 过夜。第二天，用一对一的纸巾、冷冻培养基和 30% 蔗糖、一种 XPBS 溶液在 4 摄氏度下过夜。

之后，将眼睛嵌入沿背腹轴定向的 100% 组织冷冻培养基中。然后将它们在零下 80 摄氏度下储存至少两个小时，然后再冷冻切片组织。现在将组织冷冻切片并将其放在载玻片上。

然后将载玻片在 55 摄氏度下加热 2 小时。之后，将载玻片储存在零下 80 摄氏度或立即用荧光显微镜进行标准免疫组织化学和成像。该图显示了各种光损伤范式后增殖反应的变化。

以下是成年白化斑马鱼的视网膜切片，用 PCNA 免疫标记，显示视网膜背侧和腹侧半部的细胞增殖，在零小时遵循不同的光损伤范式，以红色表示。在 48 HLT 时，透明层不存在增殖。单个祖细胞存在于横跨视网膜背侧的 INL 中，以及腹侧视网膜的一小部分。

在 48 HPUV。祖细胞列存在于视网膜背侧，而只有单个祖细胞存在于腹侧视网膜的一小部分。在 UV 加 48 时，视网膜背侧和腹侧存在大柱祖细胞。

该图显示了遵循各种光损伤范式的着色斑马鱼的视杆和视锥光感受器损失。以下是用 Pro 3 染色的视网膜切片，以蓝色显示细胞核，用 zpr R 3 标记的免疫切片，以洋红色显示视杆外段，或 zpr R 1 以金色显示双视锥细胞，遵循每个光损伤范式。在 48 HLT 时，视杆细胞感光细胞核在背侧视网膜中，在 UV 加 48 HLT 时存在于背侧和腹侧视网膜中。

尽管在 48 HPUV 时视网膜背核肥大，但在 48 HLT 或 48 HPUV 时双锥核没有显着减少。在 UB 加 8 H lt 时，视网膜背侧和腹侧视网膜的核显著减少。将该程序与其他方法（如基因特异性药理学抑制剂或体内蛋白质敲低）相结合，可以揭示单个基因和光感受器变性以及随后的再生反应的作用。