利用杆状病毒表达系统表达新型H7N9流感病毒的功能性重组血凝素和神经氨酸酶蛋白

本实验的总体目标是制备正确折叠且纯化的流感病毒血凝素和神经氨酸酶表面糖蛋白，用于免疫学检测和疫苗接种实验。首先克隆携带流感病毒基因的重组BMid，随后生成重组杆状病毒；第二步是利用这些重组杆状病毒感染昆虫细胞，以表达血凝素和神经氨酸酶蛋白。

接下来，使用亲和层析法从细胞培养上清液中纯化重组蛋白。最后一步是表征这些蛋白，以确保其具有良好的质量和生物学功能。最终，这些重组蛋白将用于研究针对流感病毒表面糖蛋白的免疫应答。

与现有方法（例如细菌表达HA1）相比，该技术的主要优势在于纯化的抗原具有正确的折叠构象，并保持生物学活性，而无需使用全病毒制备物进行免疫学检测。这些试剂可用于检测针对血凝素和非神经氨酸酶蛋白的免疫应答。仅需按照文本版实验方案，在超净台中无菌操作，开始本实验流程：首先生成重组杆状病毒，将SF9昆虫细胞以每平方厘米200,000个细胞的密度接种于6孔板中。

在无 CO₂ 条件下，于 28 摄氏度培养箱中静置 20 分钟。然后将两微克重组杆状病毒 DNA 与 100 微升 Trico Leia 培养基（HINK 或 TNM-FH 配方）混合。再将六微升转染试剂与 100 微升 TNM-FH 昆虫培养基混合。

将两个体积的溶液轻轻混合，并让转染混合物室温静置20分钟。同时设置一个不含DNA但含有转染试剂的模拟转染作为对照。从培养板中的SF nine细胞中移除SNAT，替换为2毫升含1%青霉素-链霉素溶液的无血清TNM FH培养基。

将转染混合物的全部体积加入细胞中，轻轻晃动六孔板约五秒钟。在28摄氏度、无CO2的培养箱中孵育六小时。孵育后，更换为新鲜的完全TNM FH培养基，并在相同条件下继续孵育六天。

偶尔在显微镜下观察细胞。感染的细胞通常体积更大、更圆，细胞核增大，并开始脱落。

转染后第六天，于室温下以2000 G离心五分钟收集细胞。上清液中含有重组baula病毒，可立即用于制备工作储备液，或在4摄氏度下保存数年。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测蛋白表达，并按照文本方案中的描述制备工作储备液。

SF nine 细胞对黄病毒的生长支持效果很好，但其分泌大量重组蛋白的能力有限。因此，我们使用另一种昆虫细胞系。

用于表达分泌型重组蛋白的High Five细胞。这些细胞不能支持杆状病毒的高滴度生长，但具有非常高的分泌能力。在T 175 cm²培养瓶中，使用SFX昆虫细胞培养基培养High Five细胞，每两天传代一次。

以1:3的比例进行分瓶。为获得200毫升表达培养物用于收获并感染High Five细胞，需培养五瓶融合度达到100%的细胞。首先，通过轻敲培养瓶使High Five细胞脱落。

收集细胞悬液并转移至50毫升离心管中。在室温下以1200 ×g离心7分钟。通过倾倒去除上清液，并将沉淀合并，重悬于15毫升P3储存液中。

将细胞置于超净工作台中静置15分钟。取200毫升高表达SFX培养基转移至洁净无菌的1000毫升摇瓶中。随后，将P3代细胞悬液转移至摇瓶，用无菌铝箔密封，于28摄氏度、70转/分钟条件下振荡培养72至96小时。

在感染后72至96小时，从High Five细胞表达上清中收获重组蛋白。将培养上清转移至500毫升离心桶中，在4°C条件下以5,500 ×g离心20分钟。

同时，用双蒸水将摇瓶冲洗三次。然后，每200毫升培养物用移液器吸取3毫升镍树脂悬液加入含有45毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的50毫升离心管中。

离心后，在室温下以3000 G的转速旋转10分钟前充分振荡。倒出PBS，保留沉淀。将昆虫细胞上清液与镍树脂沉淀混合，转移至已冲洗过的摇瓶中。

在4°C下振荡孵育2至4小时。接着，将一个10毫升聚丙烯层析柱用夹子固定在支架上。取下柱子两端的盖子，并在柱子下方放置一个烧杯以收集流出液。

摇瓶孵育结束后，开始将上清液浆状混合物转移至层析柱中。镍树脂将被保留在柱内，仅有上清液会流过。将全部体积的液体通过层析柱。

用15毫升洗涤缓冲液洗涤树脂四次。让洗涤缓冲液从柱子中流尽，并用盖子封闭下端。加入2毫升洗脱缓冲液，静置5分钟。

打开层析柱并收集洗脱液，尽可能将其保持在湿冰上。重复此步骤三次。含有高浓度蛋白质的洗脱液在振荡时通常会产生泡沫。为更换缓冲液并浓缩蛋白质，先用 PBS 在 3000 G 和 4°C 条件下对 15 毫升超滤离心装置进行空转离心 20 分钟。

弃去流出液，将EIT上样至离心柱中。加入5毫升无菌冰预冷的PBS充满柱子，在相同条件下离心60分钟。再次弃去流出液，重新加入15毫升冰预冷的PBS，再离心60分钟。

再重复此步骤一次，然后收集经过缓冲液置换的浓缩液，该浓缩液即为高浓度的重组蛋白。始终将浓缩液置于冰上。用 400 微升无菌预冷的 PBS 冲洗离心柱，并将冲洗液加入浓缩液中。

随后可根据文中的实验方案对蛋白进行表征。ENUE 和上海株表达的 HA 和 NA 蛋白均表现出中等表达水平，其中上海分离的甲型流感病毒每升培养液产率为 0.2 毫克，ENUE 分离的甲型流感病毒每升培养液产率为 0.7 毫克。两种毒株的神经氨酸酶（NA）分子也表现出中等表达水平，表达量范围为上海分离的甲型流感病毒每升培养液 0.2 毫克至 ENUE 分离的甲型流感病毒每升培养液 0.7 毫克。

四种蛋白质制备物均几乎不含或仅含极微量杂质，其中ha的纯度高于nas，这可通过表达水平加以解释。对在上海收集的甲型流感病毒血凝素（HA）进一步采用ELISA检测，使用广谱中和性茎部反应性人源单克隆抗体CR9114。如图中蓝色所示，该单克隆抗体结合于茎区结构域中的一个构象敏感性表位，此处用作检测该结构域正确折叠的探针。

该抗体显示出良好的结合能力，表现为在490纳米处吸光度增加，这证实了血凝素（HA）确实正确折叠。为进一步确认所获得的蛋白为7型亚型血凝素，进行了第二步实验，即使用抗7型亚型血凝素小鼠多克隆血清进行ELISA检测。观看本视频后，您将充分了解如何在实验室中表达重组流感病毒的血凝素和神经氨酸酶蛋白。

该过程也可能适用于其他病毒或细胞膜蛋白的表达。祝您的实验顺利成功。