利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

本实验的总体目标是直接观察并定量活体细菌细胞中DNA结合蛋白的活性。该目标通过观察表达光激活荧光蛋白与目标DNA结合蛋白融合体的细胞来实现。实验的第二步是获取单个蛋白在成像过程中被光激活的动态影像。

然后对数据进行分析，以确定蛋白质的定位并追踪单个细胞内蛋白质的运动。当单个蛋白质与染色体接触时，其扩散系数会发生变化，由此可识别DNA结合事件。最终，通过统计每个细胞中结合态与扩散态蛋白质的数量，可获得单细胞水平上蛋白质与DNA相互作用的定量测量结果。

该方法有助于回答DNA修复领域中的关键问题，例如体内修复速率以及修复位点的空间分布。接下来，我们将通过测量DNA聚合酶I在活的大肠杆菌细胞中的修复活性来演示该方法。首先，在500摄氏度的炉中加热盖玻片一小时，以去除背景荧光颗粒。灼烧一批厚度为1.5号的盖玻片，并将其用铝箔包裹后于室温下保存。

它们在接下来的数周内均保持良好状态。接下来，取1毫升处于对数生长期早期的AB 1157菌株大肠杆菌（E coli），置于1.5毫升的微量离心管中，其中含有poly a PA m cherry，以2,300 ×g离心5分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20微升残留培养基中，并涡旋振荡使细胞充分分散。接着，用蒸馏水配制1.5%低荧光琼脂糖溶液。取500微升熔化的琼脂糖与500微升2倍最低培养基轻轻吹打数次混合均匀，用于甲基磺酸甲酯（MMS）诱导DNA损伤实验，并注意采取相应防护措施。

在混合前，将8.3 µL MMS加入500 µL最小培养基中，与aros混合，且在混合物冷却前完成。将其涂布于灼烧过的盖玻片上，均匀、居中铺展，避免产生气泡。

用第二片灼烧过的盖玻片压平琼脂垫。待冷却后，移除琼脂垫上方的盖玻片，加入一微升浓缩的细胞悬液。用一片新的灼烧盖玻片覆盖琼脂垫，并轻轻按压，以固定细胞。

应在细胞干燥前45分钟内进行成像。为了延长此时间，可在进行DNA损伤实验时将载片密封在硅胶垫圈内。成像前，将细胞在载片上孵育20分钟。

在室温下的加湿容器中，显微镜配备有405纳米的光激活激光器和561纳米的激发激光器。通过使用高度倾斜照明仅激发盖玻片表面以上薄层内的荧光分子，实现单分子灵敏度，荧光发射信号被记录在电子倍增CCD相机上。将样品放置在显微镜载物台上，并使细胞处于聚焦状态。

在透射光照明下，定义一个裁剪后的视场以减小数据量并提高相机读出速度。用遮光材料覆盖样品以隔绝环境光，开启电子倍增CCD相机增益以进行单荧光四通道检测。将帧率设置为每帧15.26毫秒。

这包括 0.26 毫秒的相机读出时间。曝光时间需要足够短，以观察到清晰的荧光点，并尽量减少运动模糊。另一方面，需要以足够长的时间间隔采样轨迹，以明确区分结合态分子与扩散态分子。现在显示相机数据，以检查暗背景信号。

打开561纳米激光器，并检查激发背景信号。开启405纳米激光器以对Paul one PA M cherry融合蛋白进行光活化，并逐步增加激光强度，直至出现单分子的荧光斑点。随后调节激发光束的角度，使仅照射样品的薄层区域。

闭合盖玻片表面。该方法依赖于对单个荧光蛋白的检测与精确定位，因此显微镜的最佳对准和灵敏度对数据质量至关重要。为此，需将激光束聚焦至100倍数值孔径为1.4的物镜的后焦平面。

将聚焦透镜沿垂直于光束的方向平移，会使焦点偏离物镜中心，导致光束以一定角度从物镜射出。调整时应使光束尽可能增强荧光强度并降低背景信号。在透射光显微镜模式下寻找新的细胞视野，并对图像进行聚焦。

拍摄显微照片以记录细胞轮廓。打开 561 纳米激光器，漂白盖玻片上的细胞自发荧光和背景荧光点。持续数秒钟。

开始数据采集前，先在持续的561纳米激发光下开始采集一段palm电影。打开405纳米激光器，并在电影采集过程中逐渐增加其强度，直至达到1瓦特每平方厘米。避免使用过高的405纳米激光强度，以免引起细胞自发荧光。

请注意荧光分子的密度。保持较低的激活率至关重要，以确保每帧图像中的荧光点清晰分离。每段视频通常采集约10,000帧，若采用裁剪后的视野，整个过程通常需要三分钟，并占用高达一吉字节的硬盘空间。

请注意，一旦某个视野被成像后，pa m cherry 荧光分子将发生不可逆的漂白，无法再被观察。同样，以下步骤使用了基于 MATLAB 的自定义软件。单个荧光分子表现为点扩散函数（point spread functions, psfs）。

在该视频中，首先使用直径为七个像素的高斯核对带通滤波图像进行处理，以识别点扩散函数（PSF）。候选位置对应于峰值像素强度高于背景标准差4.5倍的PSF。每个候选PSF所在区域中最亮的像素点被用作拟合椭圆高斯函数的初始估计值。拟合过程中的自由参数包括X坐标、Y坐标、X方向宽度、Y方向宽度、旋转角度、幅值以及背景偏移量。

椭圆高斯掩膜用于考虑曝光时间内分子的运动，这种运动会模糊并扭曲点扩散函数（PSF）图像。将PALM视频所有帧中获得的XY定位结果叠加到同一视野的透射光显微图像上时，Paul one PAM Cherry的定位应出现在大肠杆菌细胞的中央区域。自动追踪可测量蛋白质的运动，但追踪窗口的合理选择至关重要。

首先，针对一系列跟踪窗口参数运行跟踪算法。绘制每个细胞的测量轨迹数量与跟踪窗口的关系图，以确定不会分割轨迹的最小可能跟踪窗口，并将得到的轨迹叠加显示在相同视野的透射光显微图像上。为了可视化分子在细胞内的空间运动分布，P one 轨迹应显示在单个细胞内受限的扩散行为；如果部分轨迹似乎在细胞之间跨越，则表明由于跟踪窗口选择过大和/或光激活速率过高，导致不同分子被错误地连接。

绘制连续定位之间步长的累积分布。当追踪窗口足够大时，曲线会平滑上升并趋于饱和；若窗口选择过小，则会出现截断边缘。一旦选择了合适的追踪窗口，便可分析Paul one的扩散特性。

仅使用包含至少五个定位点的轨迹来计算每条轨迹在 n 步内的连续定位点之间的均方位移（MSD），以减少 MSD 的统计不确定性。接下来，根据 MSD 计算每条轨迹的表观扩散系数。第二项用于校正估计的定位误差。

这些是第二项的取值。本示例中，现绘制出在未受损细胞以及经甲基磺酸（MMS）诱导DNA损伤处理的细胞中，视野内所有轨迹所测得的聚合酶一（pol one）扩散系数值的直方图；其中红色柱状图代表与染色体结合、扩散速度低于每秒0.15平方微米的单个聚合酶一分子群体，而自由扩散的分子扩散速度约为每秒0.9平方微米。

在确定结合了Pol α分子的位点后，可以在未受损细胞以及具有mm MS损伤的细胞中可视化结合位点的位置。结合轨迹数量占观测到的总轨迹数的比例，可直接定量反映Pol α的DNA修复活性。

在活体大肠杆菌细胞中进行了 pol one PA m cherry 融合蛋白的一次体内光激活。光激活可限定于单个细胞内的单一 PA m cherry 荧光蛋白；提高光激活速率可显示出更多的荧光分子。对 PALM 视频的每一帧均进行了定位分析。

使用固定细胞中的不动分子或活细胞中结合分子测量精度，结果为40纳米，与理论预测一致。接下来，当定位阈值设置过低时，背景噪声中的随机峰会被错误地选为候选位置；而若阈值过高，则会遗漏部分信号点。

产生的 Paul one 定位占据细胞的中心区域，大体上重现了大肠杆菌拟核的空间结构。在未受损细胞中，大多数 Paul one 轨迹表现出扩散行为。一个典型的细胞包含数百个 Paul one 轨迹，与每个大肠杆菌细胞中约 400 个 Paul one 分子的拷贝数一致。

通过计算在不同延迟时间下的均方位移（MSD）值，可以识别多种类型的分子运动：定向运动呈现抛物线形曲线，布朗运动表现为一条直线，受限扩散曲线则趋于一个平台值，而静止粒子的MSD曲线偏移量反映了其定位不确定性。

Paul one 的最终 MSD 曲线在短滞后时间内呈线性上升，表明存在布朗运动，而在长滞后时间内由于细胞限制而趋于饱和。利用这些方法，测量了在未受损细胞中，Paul one 对外源性 DNA 烷基化损伤的 DNA 修复活性。Paul one 的扩散系数直方图显示出一个以扩散分子为主的主导群体。

在持续暴露于100毫摩尔MMS损伤条件下，少量结合分子可能参与了DNA复制及内源性DNA损伤的修复过程。扩散系数接近零的轨迹频率显著增加。这支持了以下模型：在诱变剂存在的情况下，需要有更多的Paul one分子参与DNA修复。遵循本实验步骤可得出上述结论。

为了量化蛋白质在细胞内的空间分布，并研究参与DNA修复的较大蛋白质复合物的存在情况，可以进行定位分析、聚类分析等其他数据分析方法。