可视化的活细菌细胞蛋白-DNA相互作用使用光活化的单分子跟踪
2014年3月10日
光敏定位显微镜（PALM）结合单分子跟踪允许直接观察活的大肠杆菌细胞蛋白-DNA相互作用的定性和定量。
该程序的总体目标是直接可视化和量化活细菌细胞中 DNA 结合蛋白的活性。这是通过可视化表达与目标 A DNA 结合蛋白融合的光激活荧光蛋白的细胞来实现的。该程序的第二步是获取单个蛋白质在成像时被光激活的电影。
然后分析数据以确定蛋白质定位并追踪单细胞内的蛋白质。DNA 结合事件是通过单个蛋白质接触染色体时扩散系数的变化来识别的。最终，通过计算每个细胞的结合和扩散蛋白的数量，结果可以在单细胞水平上提供蛋白质 DNA 相互作用的定量测量。
这种方法可以帮助回答 DNA 修复领域的关键问题，例如体内修复率和修复位点的空间分布。现在我们将通过测量生命中 DNA 聚合酶 one 的修复活性来演示该方法 大肠杆菌 首先，在 500 摄氏度的炉子中制作没有背景荧光颗粒的盖玻片一小时。燃烧厚度为 1.5 的盖玻片库存，在室温下将它们存放在铝箔中。
他们在接下来的几周里都很好。接下来，将一毫升早期指数期 E 大肠杆菌浓缩在菌株的 1.5 毫升微量离心管中。AB 1157 poly a PA m 樱桃细胞以 2， 300 G 离心 5 分钟。
去除上清液，将细胞沉淀重悬于 20 μL 残留培养基中，并将细胞涡旋至溶液中。接下来，在蒸馏水中制备 1.5% 低荧光 aros 溶液。通过轻轻上下吹打几次，将 500 微升熔化的 aeros 与 500 微升 2 x 最小培养基混合，用于使用甲烷磺酸盐甲酯或 MMS 进行 DNA 损伤实验，采取预防措施。
将 8.3 微升 MMS 添加到 500 微升最小培养基中，然后在混合物冷却前将其与 aros 混合。将其铺在烧焦的盖玻片上。均匀涂抹并居中，不要产生气泡。
用第二个烧焦的盖玻片压平垫子。冷却后，从垫上取下顶盖，加入一微升浓缩细胞悬液。用新烧焦的盖玻片覆盖垫并非常轻柔地向下按压，以固定细胞。
细胞应在干燥前 45 分钟内进行成像。为了延长这个时间，可以将垫密封在硅垫圈内，用于 DNA 损伤实验。在对细胞进行成像之前，将它们放在垫上孵育 20 分钟。
在室温下的加湿容器中，显微镜具有 405 纳米光活化激光器和 561 纳米激发激光器。通过使用高度倾斜的照明仅激发盖玻片表面上方薄片内的荧光四分子来实现单分子灵敏度，荧光发射记录在电子倍增 CCD 相机上。将样品放在显微镜载物台上，使细胞聚焦。
在透射光照明下，定义裁剪的视野以减小数据大小并提高相机读出速度。将样品从环境光中覆盖，并打开电子倍增 CCD 相机增益以进行单荧光 4 检测。将帧速率设置为每帧 15.26 毫秒。
这包括 0.26 毫秒的相机读出时间曝光时间需要足够短，以观察到尖锐的荧光点，几乎没有运动刺耳的声音。另一方面，需要以足够长的时间间隔对轨迹进行采样，以清楚地区分结合分子和扩散分子。现在显示摄像机数据以检查深色背景信号。
打开 561 纳米激光器并检查激发背景信号。打开 405 纳米激光器以光激活 Paul one PA M 樱桃融合蛋白并增加强度，直到出现单分子的荧光点。现在调整激发光束的角度，仅照亮样品的一小部分。
关闭盖玻片表面。该方法依赖于单个荧光蛋白的检测和精确定位，因此显微镜的最佳对准和灵敏度对于数据质量至关重要。为此，将激光束聚焦到 100 x 数值孔径 1.4 物镜的后焦平面中。
垂直于光束平移聚焦透镜会使焦点远离物镜中心，导致光束以一定角度离开物镜。瞄准光束以最大化荧光强度并最小化背景。在透射光显微镜模式下找到细胞的新视野并聚焦图像。
拍摄相机快照以记录单元格轮廓。打开 561 纳米激光器并漂白盖子上的细胞自发荧光和背景点。滑几秒钟。
在开始数据采集之前，在 561 纳米连续激发下开始采集掌上电影。打开 405 纳米激光器，并在电影过程中逐渐增加强度，最高可达每平方厘米 1 瓦。避免使用导致细胞自发荧光的较高强度 405 纳米。
注意荧光分子的密度。保持低激活率很重要，以便在每个帧中清楚地分离荧光点。每个影片录制大约 10， 000 帧，如果裁剪的视野，通常需要长达 3 分钟和高达 1 GB 的硬盘空间。
请注意，一旦对视场进行了成像，pa m 樱桃荧光团就会不可逆地漂白，无法观察到。同样，以下过程使用 MATLAB 中的自定义软件。单个荧光基团表现为点扩散函数或 psfs。
在影片中，首先使用高斯核在带通过滤图像中识别 psfs，其中 7 个像素直径的候选位置对应于峰值像素强度比背景标准差高 4.5 倍的 P SFS。每个候选 PSF 的局部最亮像素用作拟合椭圆高斯函数的初始估计值。自由拟合参数包括 X 位置 y、位置 X 宽度、Y 宽度旋转、角度、振幅和背景偏移。
椭圆高斯掩码考虑了曝光期间分子的运动，这会使 PSF 图模糊和变形。从手掌电影的所有帧得到的 XY 定位到 Paul one PAM Cherry 相同视场定位的透射光显微镜图像上，应出现在大肠杆菌细胞的中心区域内。自动追踪可测量蛋白质的运动，但成功选择追踪窗口至关重要。
首先，为一系列跟踪窗口参数运行跟踪算法。绘制每个细胞与跟踪窗口的测量轨迹数量，以确定不分割轨迹的最小可能跟踪窗口，在相同视野的透射光显微镜图像上显示结果轨迹。为了可视化细胞内分子运动的空间分布，如果一小部分轨迹似乎在细胞之间交叉，则 P one 轨迹应显示局限在单个细胞内的扩散，这表明单独的分子被错误地连接，因为轨迹窗口选择得太大和/或光激活率太高。
绘制连续定位之间步长的累积分布。对于足够大的跟踪窗口，曲线会平滑地上升和饱和，但如果窗口选择得太小，则会显示截止边缘。一旦选择了合适的跟踪窗口，就可以分析 Paul 1 的扩散特性。
计算每个轨道的连续定位之间的均方位移或 MSD，总共 n 个步骤仅使用至少具有五个定位的轨道，以减少 MSD 的统计不确定性。接下来，根据 MSD 计算每个磁道的表观扩散系数。第二个项用于校正估计的定位误差。
这些是第二项的值。在这个例子中，现在绘制了未受损细胞中 pol one 和接受 MMS DNA 损伤处理的细胞中 pol one 的视野中测得的扩散系数值的直方图，红色条标识了似乎与染色体结合并以低于 0.15 平方微米/秒的速度扩散的单个 pol one 分子的群体。而自由扩散的分子每秒移动约 0.9 平方微米。
结合的 Paul one 分子被鉴定出来。结合位点的位置可以在未受损的细胞和 mm MS 损伤的细胞中可视化。结合轨迹的比例相对于观察到的轨迹总数提供了 pol DNA 修复活性的直接定量测量。
在活的大肠杆菌细胞中进行了 pol one PA m 樱桃融合蛋白的体内光激活。光活化可能仅限于一个细胞中的单个 PA m 樱桃荧光团，更高的光活化率揭示了更多的荧光分子。对棕榈电影的每一帧执行定位分析。
使用固定细胞中的固定分子或活细胞中的结合分子测量精度，发现精度为 40 纳米，与理论预测一致。接下来，当定位阈值过低时，将其设置。背景噪声中的随机峰值被错误地选为候选位置，而如果阈值太高，则会错过一些点。
由此产生的 Paul one 定位占据了细胞的中心区域，大致概括了大肠杆菌类核的结构。未受损细胞中的大多数 Paul one 轨迹显示扩散。一个典型的细胞包含数百个 Paul one 轨迹，与每个大肠杆菌细胞约 400 个 Paul one 分子的拷贝数一致。
通过计算定向运动在一定滞后时间内的 MSD 值，可以识别不同类型的分子运动，从而得到抛物线曲线。布朗运动的特点是直线。受限扩散曲线达到平台期，固定颗粒的 MSD 曲线偏移表示定位不确定性。
Paul one 的 MSD 曲线在指示布朗运动的短滞后时间内呈线性上升，而由于细胞限制，在较长的滞后时间内饱和。使用这些方法，测量 Paul 的 DNA 修复活性，1 响应未受损细胞中的外源性 DNA 烷基化损伤。Paul 1 的扩散系数直方图显示了扩散分子的主要群体。
在连续 100 毫摩尔 MMS 损伤下，少数结合分子可能参与 DNA 复制和内源性 DNA 损伤的修复。扩散系数接近零的磁道的频率显著增加。这支持了以下模型：在此过程之后，必须有更多的 Paul one 分子参与 DNA 修复，并存在诱变剂。
可以执行其他数据分析方法，如定位、聚类，以量化细胞中蛋白质的空间分布并研究参与 DNA 修复的较大蛋白质复合物的存在。
概述
本研究展示了一种方法，通过光激活定位显微镜（PALM）结合单分子跟踪，在活的大肠杆菌细胞中可视化和量化DNA结合蛋白的活性。该方法允许研究人员直接观察蛋白质-DNA相互作用，并分析它们在细胞环境中的动态。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- 理解蛋白质-DNA相互作用对于洞察细胞过程至关重要。
- 传统方法可能无法提供单分子分析所需的分辨率。
- PALM为实时观察这些相互作用提供了强大的技术。
- 本研究专注于细菌细胞中的DNA结合蛋白。
研究目的
- 在活细胞中可视化和量化DNA结合蛋白的活性。
- 测量大肠杆菌中DNA聚合酶一的修复活性。
- 提供单细胞水平上蛋白质-DNA相互作用的定量测量。
使用的方法
- 制备表达光激活荧光蛋白的细胞。
- 在光激活过程中获取单个蛋白质的影像。
- 数据分析涉及跟踪蛋白质定位和扩散系数。
- 优化显微镜技术以检测单分子。
主要结果
- 成功可视化活大肠杆菌中的蛋白质-DNA相互作用。
- 提供每个细胞中结合和扩散蛋白数量的定量数据。
- 洞察修复位点的空间分布。
- 展示的方法可以解决DNA修复中的关键问题。
结论
- 该方法提供了研究蛋白质-DNA相互作用的新方法。
- 它增强了对活细胞中DNA修复机制的理解。
- 未来应用可能扩展到涉及DNA结合蛋白的其他细胞过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of protein-DNA interactions in live bacterial cells, providing a single-cell level readout of DNA-binding protein activity. By measuring the fraction of bound molecules via changes in diffusion coefficient, it offers a quantitative proxy for substrate abundance and target engagement in a native cellular context. This supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular behavior to functional output in DNA repair pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying target engagement of DNA-binding proteins in live cells.
- Operational Value: Provides a direct readout of protein activity through bound vs. diffusing molecule ratios, supporting functional validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring DNA repair activity in response to genotoxic stress, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, single-cell resolution data on protein-DNA binding events suitable for high-content screening formats.
- Reproducibility: Uses standardized photoactivation and tracking parameters to ensure consistent localization and diffusion measurements across experiments.
- Scalability: Compatible with microfluidic and high-throughput imaging setups for screening compound effects on DNA repair protein dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly measures DNA repair activity in live cells, aligning with biomarker strategies in genotoxicity and oncology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to in vivo functional readouts, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of target modulation under DNA damage conditions, informing preclinical safety and efficacy assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for compounds targeting DNA repair or genome maintenance pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing how DNA-binding proteins engage chromosomes under basal and stressed conditions.
- Screening: Enables assessment of compound effects on protein-DNA interaction kinetics through changes in bound molecule fractions.
- Analytics: Generates diffusion coefficient histograms and mean square displacement curves as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular binding events to functional DNA repair outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any DNA-binding protein of interest in live bacterial or adaptable eukaryotic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time visualization of target engagement in a physiological context.
- Operational Value: Standardizes single-molecule imaging and tracking workflows for reproducible quantification of protein dynamics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional DNA repair activity, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative engagement and pathway modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule microscopy, photoactivation techniques, and MATLAB-based tracking analysis.
- Needs a TIRF-capable microscope with 405 nm and 561 nm lasers, EM-CCD camera, and environmental control for live bacterial imaging.
- Demands standardization of photoactivation intensity and tracking window parameters to avoid artifacts in molecule linkage and diffusion measurements.
- Adaptation to eukaryotic systems may require optimization of nucleoid structure, photoactivation density, and background fluorescence.
- Practical limitations include photobleaching of PA-mCherry after acquisition and the need for low activation rates to ensure single-molecule resolution.
