Name: 从人骨骼肌隔离血管源性多能前体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解从人骨骼肌分离血管源性多能前体细胞的方法，使用胶原酶消化和荧光激活细胞分选技术纯化肌源性内皮细胞、周细胞和外膜细胞。该技术为再生医学研究提供重要工具。

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作者谨此感谢 Alison Logar 在流式细胞术方面提供的出色技术支持。本研究得到了美国国防部（J.H.）、Henry J. Mankin 捐赠讲席基金（J.H.）以及哈萨克斯坦共和国教育与科学部（A.S.）资助项目的资助。C.W.C. 部分受美国心脏协会博士前奖学金（11PRE7490001）支持。M. Corselli 受加州再生医学研究所培训资助项目（TG2-01169）支持。

1. 肌肉活检样本处理
<ol>
	<li>在运输过程中，将人骨骼肌活检样本置于冰上，并保存于添加了5%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
	<li>收到肌肉活检样本后，在无菌条件下将其从运输容器中取出，并用添加了2%抗生素-抗真菌溶液（A/A）的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次。</li>
	<li>在添加了2% A/A的DMEM中，使用无菌剪刀和镊子去除附着的脂肪和结缔组织。</li>
	<li>在解剖显微镜下去除大血管，随后将肌肉样本切成小块（&#60;1 cm2 大小）。</li>
	<li>将切好的肌肉组织块（&#60;5 克）保存于20 ml保存液（PM；含10% FBS和1% P/S的DMEM）中，4 ℃条件下最多可保存5天。</li>
</ol>
2. 肌肉组织解离与细胞分离
<ol>
	<li>在细胞分离当天，从PM中取出肌肉组织，用含2% P/S的PBS洗涤两次。制备消化液时，将I型、II型和IV型胶原酶（100 mg/ml）新鲜加入PM中。</li>
	<li>用无菌剪刀和镊子在培养皿中将肌肉组织块精细剪切并机械匀浆，同时加入少量PM培养基，直至组织悬液能顺利通过10 ml血清移液管且无凝块形成。在此过程中去除残留的脂肪和结缔组织。每次细胞分离至少使用8–10克成年肌肉组织或2克胎儿肌肉组织。</li>
	<li>将4-5克剪碎的成年肌肉组织用10 ml血清移液管转移至20 ml消化液中（或将2克剪碎的胎儿肌肉组织转移至10 ml消化液中）。在37℃下消化50–60分钟。 &#8451; 在70 - 80 rpm的摇床上进行振荡。根据组织量相应调整消化时间和/或振荡速度，以优化细胞得率和表面抗原的保存。每15-20分钟观察一次消化情况，直至浑浊度几乎消失。</li>
	<li>用10 ml血清移液管将消化后的组织剧烈吹打3-5次。加入等体积的PM终止反应，然后在400 × g下离心4分钟。</li>
	<li>小心移除上清液；用 10 ml PM 重悬沉淀，洗涤后经 100 μm 细胞筛过滤&#160;&#956;m细胞滤筛</li>
	<li>在400 × g下离心4分钟，小心去除上清液。将沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl）中。4Cl, 10 mM KHCO₃3，0.1 mM EDTA），经70 μm滤膜过滤&#160;&#956;m细胞筛以获得单细胞悬液，然后在室温下孵育10分钟。经70-&#61549;如果观察到任何沉淀，请再次使用 m 细胞滤器。</li>
	<li>以 400 × g 离心 4 分钟，将细胞沉淀重悬于 0.5 ml PBS 中。计数细胞数量，至少收集 500 万个细胞用于细胞分选。用 PBS 将单细胞悬液稀释至每毫升少于 500 万个细胞，用于染色。取 50–100 &#956;将细胞悬液分装至11个管中，用于对照染色（未染色对照、阴性对照和单色阳性对照）。</li>
</ol>
3. 细胞标记与分选
<ol>
	<li>如有必要，将单细胞悬液在小鼠血清（用 PBS 1:10 稀释）中于 4 ℃ 孵育 10 分钟，以进行封闭。</li>
	<li>向单细胞悬液中加入 CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PE 和 CD146-FITC（均为 1:100），于 4 ℃ 孵育 20 分钟。阴性对照组中加入等浓度的 APC-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PE- 和 FITC-偶联的同型 IgG 抗体，并于 4 ℃ 孵育 20 分钟。单色阳性对照组中，分别向各管中加入等浓度的 CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PE 和 CD146-FITC 抗体，并于 4 ℃ 孵育 20 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，以 400 × g 离心 4 分钟进行洗涤。将细胞沉淀重悬于 1–2 ml 含 5% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 培养基中，细胞悬液终浓度应低于每毫升 500 万个细胞。加入 7-AAD（1:100），于室温孵育 15 分钟以排除死细胞。阴性对照组和单色阳性对照组的细胞沉淀则重悬于 0.5 ml 含 5% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 培养基中。</li>
	<li>将所有细胞悬液转移至圆底聚苯乙烯流式细胞仪检测管中。准备细胞收集管（每管预先加入 500 μl 对应的培养基：MECs 使用 MPM 培养基；PCs 使用 EGM-2 培养基；ACs 使用 AC 培养基）。将细胞悬液置于冰上，运送至细胞分选仪。</li>
	<li>按未染色对照、阴性对照、单色阳性对照及主细胞悬液的顺序上机进行细胞分选，严格调节激光强度、通道补偿及细胞群门控，以最大化细胞纯度（有关流式细胞术的详细操作，请参考 JoVE 及其他期刊发表的相关文章）。</li>
	<li>将目标细胞群收集至对应的收集管中。如不立即接种，应将收集的细胞置于&#160;4 ℃ 保存。</li>
</ol>
4. 分选后细胞培养
<ol>
	<li>将 freshly sorted MECs（P0）接种 &#60;10,000 个细胞/cm2在预先包被I型胶原的培养板中接种MPM。对于MEC的后续传代，以每平方厘米3,500 - 4,000个细胞的密度接种2 在预先包被了I型胶原的培养板/培养瓶中接种MPM细胞。</li>
	<li>将 freshly sorted PCs（P0）接种 &#60;20,000 个细胞/cm2 在新鲜涂有0.2%明胶的培养板中，用EGM-2培养基接种细胞。后续传代PCs时，以1:3比例将细胞接种至PC培养基（DMEM添加20% FBS和1% P/S）中的普通聚苯乙烯培养板，直至P2代。从P3代开始，以每平方厘米6,500–7,000个细胞的密度接种细胞。2 在PC培养基中接种于常规的聚苯乙烯培养板/瓶。</li>
	<li>将新近分选的ACs（P0）接种于 &#60;20,000 个细胞/cm2 在AC培养基（DMEM添加20% FBS和1% P/S）中接种于常规聚苯乙烯培养板上。后续传代AC时，以6,500 - 7,000个细胞/cm²的密度接种细胞2 在AC培养基中接种于常规聚苯乙烯培养板/瓶。</li>
</ol>

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</ol>

J.H. 在上述研究进行期间，因向 Cook MyoSite, Inc. 提供咨询服务以及技术许可所获得的版税而收到报酬。其他所有作者均无利益冲突需要披露。

鉴定和纯化人骨髓血管周围干细胞（hBVSC）亚群是理解间充质干细胞（MSC）发生过程的重要进展。越来越多的证据表明，MSCs起源于血管周围区域，并且组织特异性前体细胞与血管之间存在关联22-25。&#160;此外，分离出均一的hBVSC亚群的能力，有助于进一步理解MSC的异质性以及血管细胞生物学特性26。
在过去几年中，MECs、PCs 和 ACs 已通过不同的实验方案在各自独立的研究中被分别鉴定和分离。然而，由于难以优化组织解离步骤以及缺乏能够同时识别 MECs、PCs 和 ACs 的特异性细胞谱系标志物组合，目前尚未有研究尝试从人类骨骼肌组织中同步纯化这三种 hBVSC 亚群。本文介绍了一种新的细胞分离方案，通过改进组织解离流程并采用一组新的特异性细胞表面标志物组合，可从单个人类肌肉活检样本中同时纯化 MECs、PCs 和 ACs（图 1）。为获得最佳结果，本方案中需特别关注的关键步骤包括：1. 组织样本的新鲜程度与保存条件；2. 通过密切监控消化过程并调整组织解离时间，以优化细胞得率和表面抗原的完整...

人类骨骼肌被认为是临床上极具吸引力的干细胞/前体细胞来源。骨骼肌不仅含有定型的肌源性前体细胞——骨骼肌母细胞，还含有原始的肌源性干细胞，包括卫星细胞和肌肉来源干细胞（MDSCs）1。&#160;在再生医学中，自体或异体来源的人类肌肉干细胞/前体细胞的应用已在临床前动物模型和临床试验中得到广泛研究。肌肉干细胞/前体细胞的再生应用范围广泛，从修复杜氏肌营养不良症（DMD）患者的肌萎缩肌肉，到治疗心肌梗死患者受损的心脏组织。 
自发现间充质干细胞/基质细胞（MSCs）及其他多能前体细胞群体（包括骨髓来源的多能成体前体细胞（MAPCs）和脂肪来源的干细胞（ADSCs））以来，成体干细胞/前体细胞迄今已得到广泛研究1-9.&#160;然而，它们的天然身份和定位 原位 由于回顾性分离方法的局限，这些细胞一直未能被清晰识别。近期，我们及其他研究团队利用荧光激活细胞分选技术（FACS），前瞻性地鉴定并纯化了来源于人体骨骼肌及多个其他器官血管壁内的三种多能前体细胞群体：肌源性内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和外膜细胞（ACs）10.&#160;这三种人源血管干细胞（hBVSCs）亚群可分别存在于血管的三层结构中：内膜层、中膜层和外膜层。具体而言，MECs 和 PCs 存在于微血管和毛细血管中，而 ACs 则定位于较大动脉和静脉的外膜层。每种前体细胞亚群均表达一组独特的细胞表面抗原：MECs（CD34）+/56+/144+/45-），PCs（CD146+/34-/45-/56-）以及AC（CD34+/31-/45-/56-/146-).
对这些hBVSC亚群的进一步表征显示，所有三种前体细胞群体均具有与典型MSCs相似的中胚层发育潜能，包括骨骼肌生成、成骨、软骨形成和脂肪生成。所有hBVSC亚群在新鲜分离状态及培养条件下均表达经典的MSC标志物，如CD44、CD73、CD90和CD105。这些证据 collectively 支持MSCs具有血管来源。此外，MECs、PCs和ACs的治疗能力已在近期的独立研究中得到证实。从成人骨骼肌活检组织中分选得到的MECs被证明比骨骼肌成肌细胞和血管内皮细胞（ECs）更高效地再生受损和营养不良的骨骼肌，并修复受损心肌。从不同人源器官中纯化的PCs也被证实可修复/再生受损和营养不良的骨骼肌，并贡献于卫星细胞池13-16。最近，我们已证明来源于人骨骼肌的PCs可通过间接旁分泌效应和直接细胞间相互作用有效修复梗死心肌17。另一方面，ACs可通过组织块培养法直接从移植血管中分离，或通过FACS从人脂肪组织和骨骼肌中纯化获得。在小鼠后肢缺血模型中，已证实ACs具有显著的促血管生成作用19。&#160;此外，ACs也被证明比传统MSCs更高效地修复梗死心肌，表明ACs在缺血组织修复中具有强大的治疗潜力20。
目前的纯化方案可从单个人体骨骼肌活检样本的脉管系统中，同时前瞻性地纯化出肌内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和血管周围细胞（ACs）。这使得我们能够研究和/或选择最适合特定治疗目的的人体骨血管干细胞（hBVSC）亚群。此外，这一新技术进一步拓展了可从人体骨骼肌获取的干细胞/前体细胞种类，使其成为再生医学中多能前体细胞的理想来源。

<table><tbody><tr><td>1 型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C5894</td><td>无菌瓶装</td></tr><tr><td>2 型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C1764</td><td>无菌瓶装</td></tr><tr><td>4 型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C1889</td><td>无菌瓶装</td></tr><tr><td>抗人 CD34 APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>抗人 CD45 APC-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557833</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>抗人 CD56 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>557747</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>抗人 CD144 PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07481</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>抗人 CD146 FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141F</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>FACS Aria II 流式细胞仪</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 完全培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>用于祖细胞培养（仅 P0 代）</td></tr><tr><td>DMEM 高糖（1X），液体，含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>用于祖细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM 高糖（1X），液体，含 L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td>用于肌上皮细胞和成纤维细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.5%（10X）</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco&amp;rsquo;s PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>Accurate Chemical</td><td>CE650T-10</td><td>使用前过滤</td></tr></tbody></table>

从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

自发现间充质干细胞/基质细胞（MSCs）以来，其天然身份与定位&#160;的 MSCs 由于在培养中进行回顾性分离，这些细胞的特性曾长期不明确。近期，我们及其他研究人员利用荧光激活细胞分选技术（FACS），前瞻性地鉴定并纯化出三种与人类骨骼肌血管系统相关的多能前体细胞亚群。这三种细胞群体分别为：肌源性内皮细胞（MECs）、周细胞（PCs）和外膜细胞（ACs），它们分别定位于血管的三层结构：内膜、中膜和外膜。这些来源于人类血管的干细胞（hBVSC）群体不仅表达典型的间充质干细胞（MSC）标志物，还具有与典型MSC相似的中胚层发育潜能。以往，MECs、PCs和ACs是通过不同的分离方案分别获得，并在各自独立的研究中进行表征。本研究所采用的分离方案，通过对分离流程的改进以及对选择性细胞表面标志物的调整，能够从单一人肌肉活检样本中通过FACS同时纯化出全部三种hBVSC亚群。这一新方法不仅将简化多种血管源性干细胞亚群的分离过程，还将促进hBVSC在不同治疗目的下的未来临床应用。

首先根据未染色对照、阴性对照和单色阳性对照获得的数据校正FACS参数。在排除死细胞后，对荧光标记的细胞悬液进行一系列阴性和阳性细胞表面标志物筛选。首先圈选CD45+细胞，然后从CD45-组分中分离出CD56+和CD56-细胞。CD56+组分进一步进行CD34-CD144筛选，仅将CD34+/CD144+（双阳性）细胞标记为MEC（CD34+/56+/144+/45-），并随后收集（图1）。类似地，CD56-组分进一步进行CD34-CD146筛选，仅将CD34-/CD146+细胞标记为PC（CD146+/34-/45-/56-），并随后收集（图1）。CD34+/...

人类骨骼肌中的血管含有多种多能前体细胞群体，非常适合用于再生医学应用。该分离方法可同时从血管的三个结构层中分别纯化出三种多能前体细胞群体：来自内膜的肌源性内皮细胞、来自中膜的周细胞以及来自外膜的外膜细胞。

自发现间充质干细胞/基质细胞（MSCs）以来，由于对其特性进行回顾性定义，MSCs的天然身份和定位一直不甚明确……

本实验的总体目标是首先从单次骨骼肌活检样本中分离和纯化来源于人血管的多能前体细胞亚群，具体步骤包括：解离肌肉活检组织，并使用 I 型、II 型和 IV 型胶原酶联合消化；随后，用荧光标记的抗体对单细胞悬液进行染色，这些抗体可识别特定组合的细胞表面标志物；接下来，通过流式细胞术进行荧光激活细胞分选。在特定培养条件下以最佳密度观察并扩增已分选的细胞亚群。最终，通过对纯化细胞进行分选后分析，以及对培养的细胞亚群进行流式细胞术和逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）分析，以验证这些均一的BVSE细胞亚群的纯度。是的，这种方法能够解答 meso camel 干细胞的来源问题。众所周知，许多研究人员已在不同组织中发现多种类型的干细胞。因此，我认为这项研究能够阐明这些干细胞的来源，以及血管周围细胞和其他来源于血管的细胞在组织再生与修复过程中所发挥的作用。该方法的可视化演示至关重要，就如同肌肉活检一样。解离步骤可能较难掌握。胶原酶消化的技术细节和优化对于目标细胞的得率和纯化至关重要。将人骨骼肌活检样本置于冰上运输。在无菌条件下，将样本置于添加了5%FBS和1%青霉素-链霉素的DM M培养基中，用含有2%抗生素-抗真菌剂的PBS洗涤两次，然后在添加了2%aa的dms中洗涤。去除附着的脂肪和结缔组织。同时在解剖显微镜下去除大血管。现在将肌肉样本切成小块。将样品转移至20毫升保存液中，于4°C条件下保存，最长可保存五天。细胞分离当天，取出肌肉组织，用含2% pen strip的PBS洗涤两次。随后配制消化液，在pm中加入浓度均为100毫克/毫升的I型、II型和IV型胶原酶。最后，加入少量 pm，用剪刀将肌肉组织剪碎并进行机械匀浆。将悬液通过10毫升血清移液管，观察是否无凝块形成。在此过程中去除残留的脂肪和结缔组织。然后将一半的成年样本转移至20毫升消化液中，或将全部胎儿样本转移至10毫升消化液中。在37摄氏度下，以70至80转/分钟的转速在摇床中消化样本50至60分钟。每15至20分钟观察一次消化状态。根据组织量，通过相应调整消化时间和/或振荡速度，以优化细胞得率并保护表面抗原；当浑浊度几乎完全消失时，剧烈吹打消化后的组织三到五次。加入等体积的 PM 以终止反应，随后在 400 ×g 下离心 4 分钟。小心吸除上清液，洗涤沉淀物，并重悬于 10 毫升 PM 中。经 100 微米细胞筛过滤后，在 400 ×g 下离心 4 分钟，并小心吸除上清液。接下来进行重悬，将沉淀物悬浮于红细胞裂解缓冲液中，并通过70微米细胞滤网，以获得单细胞悬液。在室温下孵育10分钟后，再次通过70微米细胞滤网过滤悬液。若观察到任何沉淀物，通过离心重新沉淀细胞。用0.5毫升PBS重悬细胞，并计数用于染色的细胞数量。用PBS分装液将单细胞悬液稀释至每毫升少于500万个细胞，取50至100微升细胞悬液分装到1

isolation-blood-vessel-derived-multipotent-precursors-from-human

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从人骨骼肌隔离血管源性多能前体

根据细胞贴壁速度从肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞。...

从软性肌肉骨骼组织中分离干细胞

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。...

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

体外培养系统已证明对我们理解脊椎动物肌发生过程至关重要。然而，关于非哺乳类脊椎动物骨骼肌的发育与生长，尤其是在基部分类群中，仍有许多未知之处。建立一种高效且稳定的原代培养方案，用于分离该组织中的成肌前体细胞（MPCs）——即具有自我更新能力的成肌祖细胞，并维持其自我更新、增殖和分化能力，有助于揭示脊椎动物各谱系中保守与分化的调控机制。...

从基础脊椎动物谱系制备原代成肌前体细胞/成肌细胞培养物

本文介绍了一种优化的、高度可重复的人骨髓（hBM）中胚层祖细胞（MPCs）分离方案。通过流式细胞术和巢蛋白（nestin）表达对MPCs进行了表征。这些细胞能够产生呈指数生长的类似间充质干细胞（MSC）的细胞培养物，同时保留其血管生成潜能。...

从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPCs）

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

骨骼肌微血管内皮细胞（MMEC）构成肌毛细血管的内壁，调控肌肉组织与血液之间液体/分子的交换以及（免疫）细胞的迁移。本文所述原代小鼠MMEC的分离方法，可实现对"肌血管单元"的全面体外研究。...

分离原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。...

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其诱导分化为骨骼肌谱系的实验方案。...

从人脐带组织中生成间充质干细胞及其向骨骼肌谱系的分化

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。...

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

了解从人骨骼肌分离血管源性多能前体细胞的方法，使用胶原酶消化和荧光激活细胞分选技术纯化肌源性内皮细胞、周细胞和外膜细胞。该技术为再生医学研究提供重要工具。

从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

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