FIBS功能的无创性代谢轮廓
2014年2月3日
如何在原位代谢轮廓校正共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于描述呈现。该FIBS可用于测量非侵入性代谢物辅助的代谢模式和生物过程条件的高通量筛选的发展的细胞内水平。
该程序的总体目标是使用基于基因编码的蛋白质生物传感器无创监测细胞内葡萄糖或谷氨酰胺的水平。这是通过首先用含有质粒的生物传感器基因横切目标细胞并选择表达生物传感器的细胞来实现的。在第二步中，从分批或补料分批培养物中提取细胞培养样品，并测量其品丝比。
然后可以通过独立测定法测定样品的细胞内葡萄糖或谷氨酰胺浓度。最终，样品的品丝比可用于无创实时计算葡萄糖或谷氨酰胺的细胞内浓度。该技术的意义延伸到生物过程的改进，因为这是获取可用于在线优化和控制的实时代谢信息的可靠方法。
虽然该方法可用于深入了解生物过程，但它也可以用于其他系统，包括疾病标志物的传感。首先在 9 毫升完全生长培养基中恢复 CHO 细胞。然后旋转细胞，将沉淀重悬于 10 毫升新鲜生长的培养基中，并在蓝色模具排除中通过牛肚计数细胞。
接下来，以 3 倍 10 至 125 mL/mL 的第五个细胞的接种密度开始培养。摇床培养瓶在 37 摄氏度和 5% CO2 的轨道振荡平台上。以 125 RPM 的转速旋转，每 3 到 4 天在完全生长培养基中以每毫升 10 至 5 个细胞的 2 倍的座密度传代培养细胞，以进行细胞转染。
转染前，将细胞保持在 37 摄氏度和 5% CO2 下 12 至 24 小时，以确保细胞活跃分裂。然后在制备质粒 DNA 后，通过牛肚和蓝晶排除对细胞进行计数，并将细胞稀释至 20 毫升细胞培养基的工作体积。在 125 毫升的样品瓶中，以每毫升 10 倍至第 6 个细胞的浓度摇动培养瓶。
使用适用于所用细胞系的转染试剂盒，包括至少一个含有细胞的阴性对照孔，但不含 DNA。将转染的细胞在静态模式下孵育 4 天。现在添加用于质粒筛选的适当抗生素，使其达到由杀灭曲线确定的合适浓度。
例如，在本研究中，将 zin 添加至终浓度为 400 g/mL，以选择转染细胞，然后将培养物转移到以 125 RPM 旋转的振荡平台上。以细胞系的适当时间间隔更换培养基，每次添加抗生素，直到对照孔中的细胞死亡。使用最汇合的孔进行振荡培养。
然后将细胞冷冻在低温小瓶中，在一毫升冷冻混合物中含有 1 乘以 10 至第七个活细胞，以生成分批和补料分批生长曲线。首先，在 250 毫升工作体积为 50 毫升的摇瓶中建立转染 CHO 细胞的一式三份细胞培养物。然后将培养物置于加湿的细胞培养箱中，振荡，每隔 24 小时从每个生长培养物中取出 4.1 毫升样品。对于补料分批培养物，在第 6 天向细胞补充适量的葡萄糖或谷氨酰胺，以将其浓度恢复到初始值。
用相同体积的纯水补料对照培养物，每天使用 4.2 毫升样品中的 100 微升 4.1 毫升样品，通过跳闸和蓝晶粒排除对细胞进行计数，直到活细胞浓度降低到零。为了确定品丝比测量，离心 2 毫升每日样品，并将沉淀重悬于 2 毫升冰冷的 PBS 中，将一半的细胞悬液转移到六孔板中，并向 1 孔板中加入不含细胞的空白样品。然后立即测量蓝色和黄色荧光在带宽为 430 纳米（带宽为 35 纳米）和任务波长为 465（带宽为 35 纳米）和 520 （带宽为 10 纳米）的蓝色和黄色荧光水平。
通过确定检测到的黄色荧光与蓝色荧光的比率来计算品丝比。现在旋转最后两毫升每日样品，然后在第二次洗涤后用冰冷的 PBS 洗涤沉淀两次。对样品进行 5 次超声处理，每次 3 分钟，脉冲开 15 秒，关 15 秒。
最后，根据制造商的说明进行代谢物测定，并酌情使用所得标准曲线计算细胞内葡萄糖或谷氨酰胺水平。在这个代表性实验中，维持两种细胞系的批量过度生长培养物，正如刚刚使用用于每个 fib 体内校准的每日样品所证明的那样。该图显示了两种细胞系相对于其细胞内葡萄糖或谷氨酰胺水平的代表性活细胞生长曲线，下表列出了由酶测定确定的相应 FRET 测量值和细胞内代谢物浓度。
确定培养前 4 天存在的低细胞数量导致 fret 信号不可靠。同样，培养第 8 天后存在的高水平细胞裂解物产生了大量的光散射。因此，仅使用第 4 天到第 8 天的数据来构建葡萄糖和谷氨酰胺 fib 的校准曲线。
结果表明，FIB 信号与葡萄糖的细胞内浓度在 1 到 5 毫摩尔之间，谷氨酰胺的细胞内浓度在 0.3 到 2 毫摩尔之间产生可靠的相关性。为了验证 fibs 结果，对两种细胞系进行了补料 bash 过度生长的培养物。在细胞培养的第 6 天补充含有高底物浓度的补料，以提高底物的细胞外浓度。
正如嫁接物所描绘的那样，每天的品格比率对喂养表现出明显的反应。通过扭转趋势，他们一直跟踪到第六天。例如，在葡萄糖补料培养物中，细胞外葡萄糖浓度回升至 36 毫摩尔。
而在谷氨酰胺补料培养物中，谷氨酰胺浓度增加到 4 毫摩尔。在葡萄糖实验中，葡萄糖 fibs 选择细胞系的 fret 比在第 7 天响应于葡萄糖的添加而降低。由于葡萄糖 fibs 在配置上遵循 APO。
同样，在谷氨酰胺实验中，谷氨酰胺 fibs 选择的细胞系的品丝比响应于谷氨酰胺的添加而增加，这与 APO 关闭传感器的原理一致。这些 Fret 测量值最终用于根据上述校准曲线计算相应的细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。将它们与通过葡萄糖和谷氨酰胺酶测定法测定的这些底物的实际细胞内浓度进行比较，并在其开发后显示出足够的一致性。
该技术为该领域的研究人员探索不同培养基配方对蛋白质生产率的影响铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用基因编码的生物传感器来监测细胞内代谢物浓度有很好的了解。
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概览
本文介绍了一种校准Förster共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于非侵入性代谢分析的方法。FIBS能够测量细胞内代谢物水平，促进代谢模型的开发和生物过程条件的高通量筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物技术
- 代谢分析
背景
- 遗传编码的蛋白质传感器用于监测代谢物。
- 非侵入性技术对于实时分析至关重要。
- 理解代谢过程可以增强生物过程优化。
- 该方法为在线控制提供了可靠的代谢信息。
研究目的
- 非侵入性地监测细胞内葡萄糖或谷氨酰胺水平。
- 通过实时代谢数据改进生物过程。
- 促进代谢模型的开发。
使用的方法
- 用生物传感器基因质粒转染细胞。
- 选择表达生物传感器的细胞。
- 从细胞培养样品中测量fret比率。
- 使用独立的检测方法确定代谢物浓度。
主要结果
- FRET比率与细胞内代谢物浓度相关。
- 实现了无需侵入性技术的实时监测。
- 该方法适用于生物过程的在线优化。
- 可以高效获得可靠的代谢信息。
结论
- FIBS技术对于非侵入性代谢分析是有效的。
- 这种方法可以显著增强生物过程控制。
- 未来的应用可能扩展到各种代谢研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Noninvasive, real-time monitoring of intracellular metabolites addresses a critical gap in bioprocess optimization and metabolic modeling. By enabling continuous, label-free tracking of glucose and glutamine dynamics in live CHO cells, this approach supports data-driven decision-making in cell culture processes. The method enhances predictive confidence in metabolic models and reduces reliance on destructive sampling, aligning with industry needs for scalable, reproducible analytical tools in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of metabolic flux and pathway activity in live cells without perturbing the system.
- Operational Value: Provides constitutive, real-time readouts that support longitudinal studies of cellular physiology.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating biosensor signals with independent metabolite quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, ratiometric FRET outputs that are proportional to intracellular metabolite concentrations.
- Operational Value: Enables standardized, high-frequency sampling from batch and fed-batch cultures for calibration and monitoring.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cell lines for downstream metabolite screening and media optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical bioprocess development through consistent, longitudinal data.
- Predictive De-risking: Reduces uncertainty in metabolic modeling by providing empirically grounded, real-time intracellular concentration data.
- Model Refinement: Supports iterative improvement of computational models used in bioprocess design and control.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing real-time metabolic data that informs cell line screening, media optimization, and process control strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of metabolic dependencies and pathway modulation in live cell systems.
- Screening: Enables reproducible, quantitative metabolite measurements across culture conditions for assay standardization.
- Analytics: Delivers ratiometric FRET readouts that serve as quantitative proxies for intracellular glucose and glutamine levels.
- Translational Research: Connects intracellular metabolic states to extracellular feeding strategies in fed-batch processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform for longitudinal metabolic monitoring across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic models through direct, noninvasive intracellular measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of metabolite monitoring in suspension cell cultures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in bioprocess development by reducing metabolic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of cell lines and media formulations based on validated metabolic performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and FRET-based fluorescence measurement.
- Dependent on access to fluorescence microscopy or plate reader systems capable of dual-wavelength excitation and emission detection.
- Necessitates standardization of sampling, washing, and lysis protocols to minimize variability in FRET signal.
- Involves adaptation considerations for different metabolite biosensors and host cell lines beyond CHO.
- Limited by the dynamic range of the biosensor and potential interference from cellular autofluorescence or light scattering at high cell density.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Cell Line Revival and Maintenance
2:06
Cell Line Transfection with the Biosensor Gene-containing Plasmid
3:47
Batch and Fed-batch Cell growth Curve
4:44
FRET Ratio Measurements
6:08
Results: Representative Fed-batch Culture and Corresponding FRET Measurements
8:54
Conclusion
5:36
Metabolite Assays
