FIBS 实现的无创代谢谱分析

本实验的总体目标是利用基因编码的基于蛋白质的生物传感器，以非侵入方式监测细胞内葡萄糖或谷氨酰胺的水平。该目标的实现分为两个步骤：首先将含有生物传感器基因的质粒转染至目标细胞，并筛选出表达该生物传感器的细胞；第二步，从分批或补料分批培养体系中采集细胞培养样品，测定其FRET比率。

随后可通过独立的检测方法测定样品中细胞内的葡萄糖或谷氨酰胺浓度。最终，可利用样品的FRET比率非侵入性地实时计算细胞内葡萄糖或谷氨酰胺的浓度。该技术的应用前景广泛，有助于生物工艺的改进，因为这是一种可靠的方法，可获取用于在线优化与控制的实时代谢信息。

尽管该方法可用于深入了解生物加工过程，也可应用于其他系统，包括疾病标志物的检测。首先，在9毫升完全培养基中复苏CHO细胞。然后离心收集细胞，将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中，并使用台盼蓝染色排除法对细胞进行计数。

接下来，在125毫升培养瓶中，以每毫升3×10⁵个细胞的接种密度接种，在37°C、5% CO₂条件下，于旋转摇床平台上进行培养，转速为125 RPM。每三至四天使用完全生长培养基传代一次，传代时接种密度为每毫升2×10⁵个细胞，用于细胞转染。

转染前将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养 12 至 24 小时，以确保细胞处于活跃分裂状态。随后，在制备质粒 DNA 后，使用台盼蓝排斥法计数细胞，并将细胞稀释至 20 毫升细胞培养基的工作体积，在 125 毫升摇瓶中调整细胞浓度至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。

使用适用于当前细胞系的转染试剂盒进行转染，包括至少一个阴性对照孔，该孔含有细胞但不加入DNA。将转染后的细胞在静置条件下培养四天。随后根据杀灭曲线确定的浓度，加入适合的抗生素以进行质粒筛选。

例如，在本研究中，加入锌以达到终浓度为 400 克/毫升，用于筛选转染的细胞，然后将培养物转移至以 125 转/分钟旋转的摇床平台上。根据细胞系的特点，在适当的时间间隔更换培养基，每次更换时均加入抗生素，直至对照孔中的细胞死亡。选择汇合度最高的孔中的细胞，用于后续的摇瓶培养。

然后将含有一千万个活性细胞的细胞悬液（每毫升冻存液）分装至冻存管中，进行冷冻保存，以用于后续生成批次培养和补料分批培养的生长曲线。首先，在250毫升摇瓶中建立转染的CHO细胞三组平行培养，工作体积为50毫升。随后将培养物置于加湿并振荡的细胞培养箱中，并在培养期间每隔24小时从每瓶生长中的细胞培养物中取出4.1毫升样品。对于补料分批培养，在第6天补充适量的葡萄糖或谷氨酰胺，使它们的浓度恢复至初始水平。

向对照培养物中加入等体积的纯水，每天从4.2毫升样品中取100微升，通过台盼蓝染色排除法进行细胞计数，直至活细胞浓度降至零。为测定FRET比率，将每日样品2毫升离心，将沉淀重悬于2毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，将一半细胞悬液转移至6孔板中，并向其中一个孔加入不含细胞的空白样品，随后立即在激发波长430纳米（带宽35纳米）下检测蓝色和黄色荧光水平，蓝色荧光的发射波长为465纳米（带宽35纳米），黄色荧光的发射波长为520纳米（带宽10纳米）。

通过确定检测到的黄色荧光与蓝色荧光的比值来计算FRET比值。现在将每日样品最后的2毫升离心，然后在第二次洗涤后用预冷的PBS洗涤沉淀两次。每次超声处理3分钟，共进行5次，每次脉冲设置为开启15秒、关闭15秒。

最后，根据制造商的说明书进行代谢物检测，并利用所得的标准曲线，计算相应的细胞内葡萄糖或谷氨酰胺水平。在此代表性实验中，两种细胞系的批量过量培养物按照前述方法维持培养，并每日取样用于对每根光纤进行体内校准。本图展示了两种细胞系的代表性活细胞生长曲线及其细胞内葡萄糖或谷氨酰胺水平的关系，相应的FRET测量结果以及通过酶法检测确定的细胞内代谢物浓度列于本表中。

确定培养前四天中细胞数量较少，导致 fret 信号不可靠。同样，培养第八天后存在的高水平细胞裂解物产生了大量光散射。因此，仅使用第四至第八天的数据来构建葡萄糖和谷氨酰胺 fibs 的校准曲线。

结果表明，FIB 信号与葡萄糖在 1 至 5 毫摩尔浓度范围以及谷氨酰胺在 0.3 至 2 毫摩尔浓度范围内的细胞内浓度之间具有可靠的关联性。为了验证 FIB 的研究结果，对两种细胞系进行了补料分批过量培养实验。在细胞培养的第 6 天，添加含有高浓度底物的培养基，以提高底物的细胞外浓度。

从图中可以看出，移植物在每一天的比值均表现出对喂养的明显响应，并逆转了此前至第6天为止的趋势。例如，在葡萄糖喂养的培养物中，细胞外葡萄糖浓度回升至36毫摩尔。

在谷氨酰胺培养的细胞中，谷氨酰胺浓度增加至4毫摩尔。在葡萄糖实验中，葡萄糖FIBS选择的细胞系在第7天因添加葡萄糖而导致FRET比率下降。由于葡萄糖FIBS遵循APO构型。

类似地，在谷氨酰胺实验中，根据 APO 关闭型传感器的原理，添加谷氨酰胺后，谷氨酰胺 FIBS 选择性细胞系的 FRET 比值随之升高。最终利用这些 FRET 测量值，结合前述的校准曲线，计算出相应的细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。将计算结果与通过葡萄糖和谷氨酰胺酶法测定所获得的实际细胞内底物浓度进行比较，显示出良好的一致性。

该技术为相关领域的研究人员探索不同培养基配方对蛋白质生产效率的影响奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基因编码的生物传感器来监测细胞内代谢物浓度。