Name: FIBS功能的无创性代谢轮廓 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解FIBS无创代谢轮廓技术，利用FRET生物传感器实时监测细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。该方法通过测量荧光共振能量转移比率实现高通量生物过程优化与代谢模型构建。

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我们感谢Wolf Frommer教授（斯坦福大学卡内基科学研究所）慷慨提供葡萄糖FRET质粒，感谢Uwe Ludewig博士（霍恩海姆大学）慷慨提供克隆于pUTKan植物表达载体中的谷氨酰胺FRET构建体。AB由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）定向优先奖学金项目资助。&#160;CK和KP均获得英国研究与创新署（RCUK）生物制药加工领域研究员职位的支持。&#160;CK还感谢Lonza Biologics提供的资金支持。&#160;合成生物学与创新中心获得了英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）的大力支持。

1. 细胞系复苏与维持
<ol>
	<li>在9 ml添加了8 mM L-谷氨酰胺和10 ml/L 100倍浓度次黄嘌呤/胸腺嘧啶补充剂的CD-CHO培养基（完全生长培养基）中复苏CHO细胞。</li>
	<li>以100 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于10 ml新鲜完全生长培养基中。</li>
	<li>取1 ml样品，使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板在光学显微镜下测定活细胞浓度。</li>
	<li>以3 × 105 个细胞/ml的接种密度，在125 ml摇瓶中启动培养。</li>
	<li>将培养物置于37 °C、含5% CO2的加湿环境中，在转速为120 rpm的轨道摇床上培养。</li>
	<li>每3–4天在完全生长培养基中传代一次，接种密度为2 × 105 个细胞/ml。</li>
</ol>
2. 用含有生物传感器基因的质粒转染细胞系
<ol>
	<li>使用大规模质粒纯化试剂盒制备质粒DNA。</li>
	<li>转染前12-24小时，在适宜条件下（37 °C，5% CO2）培养细胞，以确保转染时细胞处于活跃分裂状态。</li>
	<li>采用台盼蓝染色排除法计数细胞，随后在125 ml摇瓶中制备20 ml细胞培养液，细胞浓度为1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>根据所用细胞系选择合适的转染试剂盒。质粒DNA与转染试剂的比例取决于细胞系和载体类型。建议在进行最终转染前，按照试剂生产商推荐的范围测试多个比例以优化条件。同时至少设置一个不含DNA的阴性对照组。</li>
	<li>静置培养4天后，转移至以125 rpm旋转的摇床中继续培养。</li>
	<li>根据杀灭曲线确定的合适浓度，加入适用于质粒筛选的抗生素。本研究中，使用zeocin进行筛选，终浓度为400 μg/ml。</li>
	<li>按照细胞系所需的时间间隔更换培养基，每次更换时均加入抗生素，直至对照孔中的细胞完全死亡。</li>
	<li>选择融合度最高的孔中的细胞进行摇瓶培养扩增。</li>
	<li>通过将1 ml冻存液（含107 个活细胞）分装至冻存管中建立细胞库。本实验中冻存液组成为92.5%生长培养基和7.5%二甲基亚砜。</li>
</ol>
3. 分批与补料分批细胞生长曲线
<ol>
	<li>按照上述细胞培养维护说明，在250 ml 摇瓶中建立转染CHO细胞的三组平行培养，工作体积为50 ml。</li>
	<li>将培养物置于37 °C、含5% CO2的加湿细胞培养箱中，在转速为125 rpm的轨道摇床上培养，并每隔24小时从每瓶培养物中取出4.1 ml 样品。</li>
	<li>取100 μl 样品，采用台盼蓝染色排除法测定活细胞浓度和细胞活力。</li>
	<li>重复操作，直至活细胞浓度降至零。</li>
	<li>对补料分批培养的细胞，在第6天补充适量葡萄糖或谷氨酰胺，使其浓度分别恢复至初始值36 mM和4 mM。建议同时维持额外的对照培养组，该组在相同时间点加入相同体积（本例中为12 ml）的纯水。</li>
</ol>
4. FRET 比值测量
<ol>
	<li>取上述3.2步骤中每天采集的2 ml样品，在4 °C条件下以100 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于2 ml预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，转移至6孔板，并在其中一个孔中加入不含细胞的空白样品。</li>
	<li>立即在激发波长430/435 nm、发射波长465/435 nm（蓝色）和520/510 nm（黄色）条件下测定蓝色和黄色荧光水平。</li>
	<li>计算FRET比值（检测到的黄色荧光与蓝色荧光的比值）。</li>
</ol>
5. 代谢物检测
<ol>
	<li>取上述步骤3.2中每天采集的2 ml样品，在4 °C条件下以100 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于3 ml预冷的PBS中，并在相同条件下再次以100 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀如上所述重悬于3 ml预冷的PBS中。对样品进行超声处理，每次3分钟，共5次，超声程序设置为每15秒开启后暂停15秒。此时，若需要，可将细胞提取物冷冻保存。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用合适的葡萄糖检测试剂盒对细胞提取物样品进行检测，以测定细胞内葡萄糖浓度（参见材料表）。 
	注意：使用适当的标准品绘制标准曲线。本研究中，标准品浓度范围为0–100 mM。</li>
	<li>根据标准品的测定值绘制标准曲线，并求出最佳拟合直线方程（本例中：y = 1310.51x - 723.43，其中y为吸光度读数，x为葡萄糖浓度）。</li>
	<li>利用标准曲线计算葡萄糖浓度，并考虑稀释倍数。然后可通过以下公式计算细胞内葡萄糖浓度： 
	<img alt="细胞内浓度计算公式；浓度计算方法；生化分析流程" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	对于CHO细胞，单个细胞体积是基于12 μm的细胞直径计算得出的12。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用合适的谷氨酰胺检测试剂盒对细胞提取物样品进行检测，以测定细胞内谷氨酰胺浓度（参见材料表）。 
	注意：使用适当的标准品绘制标准曲线。本研究中，标准品浓度范围为0–2 mM。</li>
	<li>同5.5步骤，绘制校准曲线（本例中y = 203.1x + 17.1，其中y为吸光度读数，x为谷氨酰胺浓度）。</li>
	<li>利用标准曲线计算样品的谷氨酰胺浓度，并考虑稀释倍数。细胞内谷氨酰胺浓度可通过上述公式1进行计算。</li>
</ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FIBS 能够实现 体内 和 原位 关键分子（在此为限制生长的营养物质）的定量，消除了由淬灭和提取方法引起的不确定性。研究结果表明，FIBS信号与细胞内葡萄糖浓度在1-5 mM范围以及谷氨酰胺浓度在0.3-2 mM范围内具有良好的相关性。在批次CHO细胞培养中，这些浓度出现在对数生长期、平台期和早期衰退期。其中，对数生长期和平台期在制定适当补料策略方面最为关键；因此，利用这些生物传感器估算细胞代谢需求在工业上具有重要意义。流加批次实验的结果证实了FIBS适用于估计细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。早期时间点出现的偏差可能源于活细胞数量较低和/或其它代谢物的干扰。 例如 在葡萄糖FIBS的情况下由半乳糖引起，而在谷氨酰胺FIBS的情况下由其他氨基酸引起。具体而言，已有研究表明，在天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸存在时，FRET比率最多可降低20%。15总体而言，这些结果表明FIBS信号的误差相当低。
尽管该方法一次只能监测有限数量的分子，但它可为细胞系和工艺开发提供有用信息，甚至可用于数学模型验证所...

代谢物监测在生物加工过程中具有多种应用，包括工艺开发、培养基与补料设计以及代谢工程。通过使用酶法等多种方法可进行浓度测定1化学2或结合实验3一种有趣的选择是使用基于荧光蛋白的 体内 生物传感器作为报告细胞内关键代谢物浓度的工具。在超低体积检测中，荧光是一种便捷的技术手段，因为微型化实际上能够提高信噪比4,5 基于蛋白质的传感器可实现基因编码，这意味着代谢物分析无需外源试剂。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器由两个荧光蛋白通过一个配体结合域连接而成。FRET 是一种非辐射能量转移过程，能量从光激发的供体分子传递至邻近的受体荧光分子。&#60;100）。配体的切割或结合会引起传感器的构象变化，进而改变荧光团之间的相对位置，导致荧光共振能量转移（FRET）效率发生变化，这种变化可通过发射光谱的改变来检测。FRET整合型生物传感器（FIBS）在细胞系中持续表达，其光谱特性随细胞内代谢物浓度的变化而改变。FIBS具有快速响应的特性，非常适合用于动态模型的实时测量。6. 此前的应用包括监测单个7-9 以及多个10 代谢物&#160;并提供时空分布数据11FIBS 可以构建为两种构型：Apo-Max，其中配体结合会破坏荧光团之间的接近性，从而降低能量转移；以及 Apo-Min，其中配体结合使两个荧光团更紧密接触。图1).
本研究提出了一种构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的方案，该细胞系可组成型表达针对代谢物葡萄糖或谷氨酰胺的FIBS。同时建立了一种传感器校准方法。 体内 以实现对细胞内代谢物浓度的未来定量测量，如文中所示 图2根据这一原理，可测定在补料分批式CHO细胞培养过程中添加了高浓度葡萄糖或谷氨酰胺时细胞内的营养物浓度。结果表明，利用FIBS的荧光信号及先前构建的校准曲线，能够准确预测细胞内浓度，并经独立的酶法测定验证。该方法相较于现有的分析技术具有显著优势，因其具有非侵入性、低成本和快速的特点，可实时监测FIBS信号并贯穿整个培养过程。

<table><tbody><tr><td>CHO-S 细胞</td><td>Life Tecnologies</td><td>11619-012</td><td>细胞系将根据研究目标的不同而有所变化</td></tr><tr><td>pCDNA4/TO 载体&amp;nbsp;</td><td>Life Tecnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-PRO 转染试剂</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>可使用任何适用于所研究细胞系的转染方法完成转染</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>细胞生长培养基取决于所研究的细胞类型</td></tr><tr><td>100x HT 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100x)，液体</td><td>Life Technologies</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>InfinitePRO 200 酶标仪</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>任何能够检测所需波长的 96 孔荧光酶标仪均可替代</td></tr><tr><td>酶标仪滤光片</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>可使用任何合适的试剂盒替代</td></tr><tr><td>Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td><td>可使用任何合适的试剂盒替代</td></tr><tr><td>EnzyChrom&amp;nbsp; 谷氨酰胺检测试剂盒</td><td>BioAssay Systems</td><td>EOAC-100</td><td>可使用任何合适的试剂盒替代</td></tr><tr><td>改进型纽鲍尔血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

fibs 实现的无创代谢谱分析

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

在计算生物学时代，为了填充和优化可用于预测性验证的模型，有必要开发新的高通量实验系统。理想的系统应具备低反应体积的特点，从而在需要获取时间序列数据时避免取样和破坏性分析。目前亟需一种 原位 一种可实时、无创报告必要信息的监测工具。一种有趣的选择是使用基于荧光蛋白的 体内 生物传感器作为细胞内浓度的报告分子。其中一类特别的 体内 基于荧光蛋白间 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器已应用于代谢物定量，该传感器由两个荧光蛋白通过一个配体结合域连接而成。FRET 集成生物传感器（FIBS）可在细胞系中持续表达，具有快速响应特性，且其光谱特征会随细胞内代谢物浓度变化而改变。本文介绍了构建稳定表达葡萄糖和谷氨酰胺 FIBS 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的方法，以及对 FIBS 进行校准的流程。 体内 在批次细胞培养中，为实现未来对细胞内代谢物浓度进行定量而描述的方法。补料分批CHO细胞培养的数据表明，FIBS在每种情况下均能检测到细胞内浓度的相应变化。通过FIBS的荧光信号及先前构建的校准曲线，可准确测定细胞内浓度，并经独立的酶法测定验证。

方法学概述见图2。本研究中，使用FIBS载体转染CHO细胞，并在400 μg/ml杀稻瘟菌素（zeocin）的抗生素压力下筛选获得稳定细胞系。由此建立了两个分别稳定表达葡萄糖和谷氨酰胺传感器的细胞系。图1展示了本研究中所用两种生物传感器的结构。葡萄糖传感器基于Apo-Max原理，对应的质粒为pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite。该质粒将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的Aphrodite变体融合至大肠杆菌（E. coli）葡萄糖/半乳糖周质结合蛋白的F16A突变体上。为提高FRET效率，从连接区删除了11个氨基酸残基13。该载体通过独特的EcoRI和PstI限制性酶切位点克隆至pCDNA4/TO载体中，后者含有巨细胞病毒（Cytomegalovirus）启动子和SV40增强子。
谷氨酰胺传感器基于Apo-Min原理（图1），其相应的质粒是通过将黄色荧光蛋白...

Förster共振能量转移整合生物传感器（FIBS）的校准方法描述 原位 代谢谱分析被介绍。&#160;FIBS 可用于无创测量细胞内代谢物水平，有助于代谢模型的构建以及生物工艺条件的高通量筛选。

FIBS 实现的无创代谢谱分析

在计算生物学时代，为了充实和优化模型，使其能够……，必须开发新的高通量实验系统。

本实验的总体目标是利用基因编码的基于蛋白质的生物传感器，以非侵入方式监测细胞内葡萄糖或谷氨酰胺的水平。该目标的实现分为两个步骤：首先将含有生物传感器基因的质粒转染至目标细胞，并筛选出表达该生物传感器的细胞；第二步，从分批或补料分批培养体系中采集细胞培养样品，测定其FRET比率。随后可通过独立的检测方法测定样品中细胞内的葡萄糖或谷氨酰胺浓度。最终，可利用样品的FRET比率非侵入性地实时计算细胞内葡萄糖或谷氨酰胺的浓度。该技术的应用前景广泛，有助于生物工艺的改进，因为这是一种可靠的方法，可获取用于在线优化与控制的实时代谢信息。尽管该方法可用于深入了解生物加工过程，也可应用于其他系统，包括疾病标志物的检测。首先，在9毫升完全培养基中复苏CHO细胞。然后离心收集细胞，将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中，并使用台盼蓝染色排除法对细胞进行计数。接下来，在125毫升培养瓶中，以每毫升3×10⁵个细胞的接种密度接种，在37°C、5% CO₂条件下，于旋转摇床平台上进行培养，转速为125 RPM。每三至四天使用完全生长培养基传代一次，传代时接种密度为每毫升2×10⁵个细胞，用于细胞转染。转染前将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养 12 至 24 小时，以确保细胞处于活跃分裂状态。随后，在制备质粒 DNA 后，使用台盼蓝排斥法计数细胞，并将细胞稀释至 20 毫升细胞培养基的工作体积，在 125 毫升摇瓶中调整细胞浓度至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。使用适用于当前细胞系的转染试剂盒进行转染，包括至少一个阴性对照孔，该孔含有细胞但不加入DNA。将转染后的细胞在静置条件下培养四天。随后根据杀灭曲线确定的浓度，加入适合的抗生素以进行质粒筛选。例如，在本研究中，加入锌以达到终浓度为 400 克/毫升，用于筛选转染的细胞，然后将培养物转移至以 125 转/分钟旋转的摇床平台上。根据细胞系的特点，在适当的时间间隔更换培养基，每次更换时均加入抗生素，直至对照孔中的细胞死亡。选择汇合度最高的孔中的细胞，用于后续的摇瓶培养。然后将含有一千万个活性细胞的细胞悬液（每毫升冻存液）分装至冻存管中，进行冷冻保存，以用于后续生成批次培养和补料分批培养的生长曲线。首先，在250毫升摇瓶中建立转染的CHO细胞三组平行培养，工作体积为50毫升。随后将培养物置于加湿并振荡的细胞培养箱中，并在培养期间每隔24小时从每瓶生长中的细胞培养物中取出4.1毫升样品。对于补料分批培养，在第6天补充适量的葡萄糖或谷氨酰胺，使它们的浓度恢复至初始水平。向对照培养物中加入等体积的纯水，每天从4.2毫升样品中取100微升，通过台盼蓝染色排除法进行细胞计数，直至活细胞浓度降至零。为测定FRET比率，将每日样品2毫升离心，将沉淀重悬于2毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，将一半细胞悬液转移至6孔板中，并向其中一个孔加入不含细胞

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科研

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生物工程

FIBS功能的无创性代谢轮廓

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

这项工作证明了一种方法的可行性 体内 磷-31磁共振波谱学（31采用磷酸磁共振波谱（PMRS）技术定量人体骨骼肌中线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）能力。...

体内磷-31磁共振波谱：一种用于测量人体骨骼肌线粒体氧化磷酸化能力的工具

本研究描述了一种利用 18F-FDG 与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）成像结合动力学建模，用于定量分析 体内实时摄取 18F-FDG...

使用18F-FDG 微型PET/CT测定葡萄糖代谢动力学

本文介绍了一种在灌注心脏中使用心室内光学导管的方法，用于对心脏壁进行跨壁吸收光谱分析。所获得的数据可在此广泛应用的实验模型中，同步提供关于组织氧张力、底物利用和膜电位的信息，同时结合心脏功能的测量指标。...

用于灌注哺乳动物心脏跨壁吸收光谱监测细胞代谢的腔内心脏侧向发光导管

实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。...

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

本方案描述了内源性代谢辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）以及氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像与分析。对NAD(P)H和FAD进行自发荧光成像，可提供一种无需标记、非破坏性的细胞代谢评估方法。...

利用自发荧光成像评估细胞代谢

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。...

中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

本文详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中提取巨噬细胞的方法，并进一步评估活细胞中代谢通量的实验流程。...

分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

本文介绍了一种优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）方案，结合微流控平台，作为检测microRNA（miRNA）表达水平的高通量筛选工具，具有成本低、耗时短的优点，尤其适用于样本量有限的情况。...

高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR

了解FIBS无创代谢轮廓技术，利用FRET生物传感器实时监测细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。该方法通过测量荧光共振能量转移比率实现高通量生物过程优化与代谢模型构建。

FIBS 实现的无创代谢谱分析

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