Name: 二硝基苯磺酸/ TNBS结肠炎模型:提供洞察炎症性肠病和膳食脂肪的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解使用二硝基苯磺酸在小鼠和大鼠中诱导结肠炎的方法，用于研究炎症性肠病。该方案操作简单、成本低廉且可重复性高，有助于深入分析肠道损伤与修复机制及膳食脂肪对疾病的影响。

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本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大克罗恩病与结肠炎基金会（CCFC）向 KJ 提供的运营资助。VM 获得加拿大呼吸研究基金会（CFRI）博士后奖学金的支持，GB 获得加拿大卫生研究院（CIHR）研究生奖学金的支持。BAV 是儿童肠道与肝脏疾病基金会（CHILD）儿科炎症性肠病研究讲席以及加拿大研究讲席计划支持的儿科胃肠病学讲席；KJ 是由 CHILD 和不列颠哥伦比亚大学儿童与家庭研究所（CFRI）临床科学家奖计划支持的高级临床科学家。

涉及动物受试对象的操作遵循不列颠哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的动物护理指南。
本方案中提及的实验步骤将同时针对大鼠和小鼠进行描述，而代表性结果则来自Sprague-Dawley大鼠。
1. DNBS 的制备与直肠内给药
<ol>
	<li>对于大鼠的DNBS直肠灌注，需新鲜配制每250 µl含15–30 mg DNBS的50%乙醇溶液。对于小鼠，配制每100 µl含2–6 mg DNBS的50%乙醇溶液。注意：各实验机构应优化所用DNBS的确切浓度。诱导DNBS结肠炎时首选雄性Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6小鼠，但也可使用其他品系的小鼠和大鼠。仅给予50%乙醇的动物可作为对照组，但由于乙醇的作用较轻微或不明显，研究中可省略该对照组。12.</li>
	<li>连接1 ml&#160;将注射器连接至19 G针头，针头末端固定有聚乙烯导管（大鼠用PE-90，小鼠用PE-50）。</li>
	<li>将大鼠或小鼠置于加热垫上并进行轻度麻醉（例如 通过鼻罩给予1.5%异氟烷，动物应仍保留眨眼和吞咽反射，并呈现规律呼吸。在动物眼睛上涂抹眼用凝胶，以防止眼睛干涩。</li>
	<li>用指尖轻轻按压动物后端，以排出远端结肠内可能存在的粪便。</li>
	<li>轻轻地将导管经直肠插入，导管插入深度约为大鼠肛门近端8 cm，或小鼠3-4 cm。插入导管时可注入少量溶液以润滑，便于顺利插入。注意：若在插入过程中感到阻力，应停止继续插入，以免导致肠壁穿孔。此时应撤出导管，尝试重新轻柔插入，并在推进过程中再次润滑结肠。</li>
	<li>缓慢注入 250（大鼠）或 100（小鼠）µl&#160;DNBS，或对对照组给予等体积的50%乙醇。注射DNBS后，将动物头朝下放置90秒，以避免DNBS流失。</li>
	<li>DNBS 给药后，在第一周内给予动物含 0.2% 生理盐水的 8% 蔗糖水，以防止脱水。</li>
	<li>仔细观察动物，在整个实验期间每天监测体重减轻情况以及脱水或痛苦的迹象。注意：体重减轻可能迅速接近加拿大实验动物管理委员会（CCAC）规定的最大允许体重减轻限度。由于体重减轻主要源于脱水，因此应将体重减轻作为给予乳酸林格氏液以控制脱水的指征。如遇健康问题，请务必咨询实验动物设施的兽医。</li>
</ol>
2. 收集DNBS攻击小鼠的组织并评估组织学损伤
<ol>
	<li>在DNBS攻击后的预定时间点，通过在麻醉室中使用足够氧气补充的异氟烷过量麻醉动物以实施安乐死。观察动物直至看不到胸部起伏且无法触及心跳。通过脚趾夹捏或角膜触碰无反应来确认动物已正确安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>打开腹腔并取出整个大肠。沿纵向切开肠管；在大鼠中，宏观黏膜溃疡应出现在距结肠远端约5-6 cm处（小鼠为2-3 cm）。注意：取出大肠后，如需可评估宏观损伤评分。从对照组动物中采集相应解剖位置的结肠段。注意：进行宏观损伤评分的人员应对治疗组的身份设盲。使用以下或类似标准对组织切片进行评分：溃疡严重程度与范围（0–10），加上腹泻有无（0 或 1）、粘连情况（0、1 或 2）以及结肠壁最大厚度（单位为毫米）11。</li>
	<li>在宏观损伤最显著部位近端采集0.5 cm的组织段。将其中一段0.5 cm组织在液氮中速冻，用于后续测定髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞浸润的指标），另一段放入10%中性缓冲福尔马林中用于组织学分析。注意：用于髓过氧化物酶检测的速冻组织可在-80 °C下保存长达1个月。</li>
	<li>将步骤2.3中采集用于组织学分析的组织在福尔马林中固定过夜，然后用70%乙醇洗涤。将组织包埋于石蜡中，切成所需厚度（3–5 µm），并用苏木精和&#160;伊红（HE）染色，用于组织学评分。</li>
	<li>由两名观察者在光学显微镜下对每只动物至少三个组织切片进行评分，以确定各组的组织学损伤评分。注意：进行组织学损伤评分的人员应对治疗组的身份设盲。使用以下或类似标准对组织切片进行评分：炎性细胞浸润程度（0 = 无，3 = 透壁性）、黏膜结构丧失（0 = 无，3 = 严重）、隐窝脓肿有无（0–1）以及杯状细胞减少程度（0–3）。将上述各项评分相加，得出组织学损伤总分11。</li>
</ol>
3. 对DNBS刺激的肠道组织进行髓过氧化物酶（MPO）检测
<ol>
	<li>测定步骤 2.3 中获得的 0.5 cm 结肠节段的髓过氧化物酶（MPO）活性。将组织在 MPO 匀浆缓冲液（含 0.5% 十六烷基三甲基溴化铵的 50 mM 磷酸钾缓冲液，pH 6.0）中匀浆，使每毫升匀浆缓冲液悬浮液中含有 50 mg 结肠节段&#160;。</li>
	<li>将匀浆液分装为每份 1 ml&#160;，于 4 °C、10,000 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
	<li>在比色皿中，取每份 100 µl&#160;匀浆液与 2.9 ml&#160;含 0.167 mg/ml&#160;邻联茴香胺二盐酸盐和 0.0005% 过氧化氢的 50 mM 磷酸缓冲液（pH 6.0）混合。</li>
	<li>使用分光光度计在 460 nm 处测定吸光度变化速率。注：MPO 活性定义为在室温下每分钟降解 1 µmol H2O2 生成 H2O&#160;所需的酶量，以每毫克组织的单位数表示。</li>
</ol>

<ol><li>Perše, M., Cerar, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPer%C5%A1e%2C+M+%22Dextran+sodium+sulphate+colitis+mouse+model%3A+traps+and+tricks%22">Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks</a>. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).</li>
<li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+inflammatory+bowel+disease+in+a+mouse+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression.</a> Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+animal+models+of+inflammatory+bowel+disease-an+update+on+the+role+of+the+hypothalamo-pituitary-adrenal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).</li>
<li>Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CD4%2B+lymphocytes+in+the+susceptibility+of+mice+to+stress-induced+reactivation+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis.</a> Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).</li>
<li>Boyer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myenteric+plexus+injury+and+apoptosis+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Auto.+Neurosci.+Basic+Clin%22%5BJournal%5D)">Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis.</a> Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).</li>
<li>Saunders, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+and+cholinergic+neural+pathways+mediate+stress-induced+reactivation+of+colitis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Auto.+Neurosci.+Basic+Clin%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat.</a> Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).</li>
<li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+inhibitor+I+reduces+colon+injury+caused+by+dinitrobenzene+sulphonic+acid+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat.</a> Gut. 48 (4), 478-488 (2001).</li>
<li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+reduces+dinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis.</a> J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).</li>
<li>Innis, S., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+lipids+in+early+development+and+intestinal+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease.</a> Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).</li>
<li>Innis, S. M., de La Presa Owens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fatty+acid+composition+in+pregnancy+alters+neurite+membrane+fatty+acids+and+dopamine+in+newborn+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain.</a> J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).</li>
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<li>Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fish+oil+reduces+progression+of+chronic+inflammatory+lesions+in+a+rat+model+of+granulomatous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis.</a> Gut. 31, 539-544 (1990).</li>
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<li>Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+and+fish+oil+mixture+increases+IL-10%2C+protects+against+DNA+damage+and+decreases+colonic+inflammation+in+rats+with+dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis.</a> Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).</li>
<li>Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+oils+modify+the+host+immune+response+and+colonic+tissue+damage+following+Citrobacter+rodentium+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).</li>
<li>Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+lipid+nutrition+alters+early+intestinal+development+and+programs+the+response+to+experimental+colitis+in+young+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案中描述的DNBS模型是一种有价值、低成本且可重复的结肠炎模型，可用于研究炎症性肠病（IBD）的多个方面。当通过直肠途径给予大鼠或小鼠时，DNBS会在结肠中引发显著的炎症反应和组织损伤，其组织学特征与人类克罗恩病相似，包括透壁性的多形核细胞浸润以及以NF-κB依赖的Th1细胞活化为主。
该模型已用于研究各种被认为会影响炎症性肠病（IBD）的因素，如应激、抑郁和饮食，以及肠神经系统的作用、损伤-修复机制、透壁性炎症和临床前治疗。DNBS模型也是小鼠和大鼠中TNBS诱导炎症的合适替代方法，并且相较于其他常用的化学性结肠炎模型（如DSS），具有成本更低的优势。本实验方案中所述步骤将有助于成功实施该模型。
与其他结肠炎实验模型一致13-16，本研究进一步证实了膳食脂肪对肠道黏膜免疫反应具有不同影响：在DNBS暴露前后摄入高剂量EPA和DHA可减轻结肠炎，而摄入高剂量ARA且n-3脂肪酸含量极低则会加重病情。本研究中观察到的膳食n-3脂肪酸的有益作用，部分原因在于n-3脂肪酸能够有效降低组织磷脂中的ARA含量，...

炎症性肠病（IBD）以胃肠道（GI）的慢性复发性炎症为特征，导致腹泻、体重减轻和腹痛等症状。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD的两种主要类型，可通过炎症在胃肠道内的位置进行区分。在UC患者中，炎症通常累及直肠，并连续向上蔓延至结肠，影响范围不一，但仅累及表层黏膜。相比之下，CD可累及胃肠道的任何部位，尽管主要影响回肠和盲肠。CD常表现为透壁性炎症，常伴有肉芽肿，并导致狭窄性（纤维性狭窄）和/或穿透性（瘘管形成）病变。尽管IBD的病因尚不明确，但普遍认为其为多因素疾病，涉及宿主免疫系统、遗传易感性以及对环境和微生物因素反应之间的相互作用。
迄今为止，已提出多种炎症性肠病（IBD）模型，这些模型表现出与溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）相关的不同临床、组织学和免疫反应特征。最常用的模型包括基因修饰小鼠（IL-2、IL-10、SAMP/Yit）、感染诱导模型（Citrobacter rodentium、Salmonella typhimurium）、过继性细胞转移模型（将CD45+ RB High或CD62L+细胞转移至SCID小鼠）以及化学诱导结肠炎模型（葡聚糖硫酸钠（DSS）、三硝基苯磺酸（TNBS）和二硝基苯磺酸（DNBS））。由于化学诱导模型成本较低且疾病发作迅速，因此在研究IBD多个方面时具有重要价值。上述每种化学性结肠炎模型在模拟IBD的临床、免疫学和组织病理学相关性方面均具有各自的优势与局限性。DSS是用于在啮齿类动物中诱导结肠炎最常用的化学方法之一1。在小鼠饮水中添加3-10% DSS（分子量：42 kDa）并持续给予7-10天，可诱发结肠炎的症状和体征，包括体重减轻、便血性腹泻、结肠缩短、黏膜溃疡及中性粒细胞浸润。该模型特别适用于药物筛选研究，以及探索上皮再生机制、先天免疫对黏膜稳态的影响，以及炎症在促进肠道异型增生和腺癌发生中的作用。然而，DSS模型也存在一些缺点，例如不同动物设施中诱导结肠炎所需的DSS浓度存在差异，同时小鼠饮水量不一致导致DSS暴露水平不稳定，从而引起结肠黏膜损伤和溃疡的程度、范围及分布出现变异。这些因素均使其结果具有异质性，并限制了不同研究团队之间研究结果的可比性。
一种替代DSS模型的结肠炎模型是半抗原诱导的DNBS或TNBS模型。该模型通过直肠给予溶于不同浓度乙醇中的黏膜致敏剂DNBS或TNBS。乙醇的使用是破坏结肠黏膜屏障的必要条件，以促进DNBS或TNBS渗透至固有层。随后，DNBS/TNBS会与局部结肠组织及肠道微生物蛋白发生半抗原化，使其具有免疫原性，从而激活宿主的固有免疫和适应性免疫应答。总体而言，该模型常表现为严重甚至带血的腹泻、体重减轻以及肠壁增厚，但具体症状因实验所用啮齿类动物种类、给药时间、剂量及DNBS或TNBS暴露程度的不同而有所差异。需特别注意大鼠与小鼠之间的差异，其中大鼠在购买和饲养成本方面更具优势，且因其个体体重较小，可降低单只动物治疗所需的药物成本 体内这一点应与小鼠结肠炎进展更快且更严重的情况相对照，因为小鼠更为脆弱且反应敏感，可能迅速达到人道终点。
肠道炎症最初由乙醇对肠上皮细胞的损伤引起，导致上皮通透性增加、微生物侵入黏膜、宿主蛋白的半抗原化，最终引发中性粒细胞、巨噬细胞和Th1 T淋巴细胞浸润至受损的黏膜组织。与DNBS相比，TNBS因其强氧化性被视为一种危险化学品，与氢氧化钠、氢氧化钾等碱性物质接触时存在爆炸风险。因此，目前DNBS被认为是诱导结肠炎的首选化学试剂，优于TNBS。在啮齿类动物中，DNBS诱导的结肠炎被认为是一种研究以下与炎症性肠病（IBD）相关的疾病调节因素最为便捷的方法之一：
<ol>
	<li>抑郁与结肠炎的复发：已有研究表明，炎症性肠病（IBD）患者的情绪压力、焦虑和抑郁常与疾病复发密切相关。DNBS诱导的结肠炎是研究抑郁及其对小鼠结肠炎复发影响的合适模型。该方法通常首先通过DNBS诱导结肠炎，随后让小鼠静置6–8周使结肠炎症状消退。然后给予小鼠可致抑郁的试剂（如利血平）或通过嗅球切除术诱导抑郁，再以亚致结肠炎剂量的DNBS进行激发，检测结肠炎是否复发2。</li>
	<li>应激与结肠炎的复发：应激是另一种与IBD发病机制相关的常见环境因素。越来越多的证据表明，慢性应激与啮齿类动物、人类及非人灵长类动物中溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）症状的发作存在显著关联3。DNBS诱导的结肠炎是研究小鼠和大鼠中应激相关性结肠炎复发的良好模型。该方法通常与上述抑郁模型类似，不同之处在于不诱导抑郁，而是使动物暴露于声学应激或束缚应激等应激源4。</li>
	<li>神经源性炎症：多项研究已描述了肠神经系统（ENS）在结构和功能上出现的暂时性或永久性改变，这些改变在IBD动物模型及患者组织样本中均可见。DNBS模型适用于探究炎症对ENS的影响5，并可用于研究去甲肾上腺素能和胆碱能神经通路6。</li>
	<li>损伤-修复机制：在IBD发病过程中，宿主来源的损伤介质，如活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、细胞间黏附分子3（ICAM-3）和P-选择素，均被证实参与了肠上皮屏障的破坏。DNBS是研究这些介质上调所致损伤以及通过特异性药物或抑制剂调控的修复机制的优良模型7,8。</li>
	<li>透壁性炎症：除上述应用外，DNBS模型还可用于研究肠道透壁性炎症，这是克罗恩病（CD）患者中的典型特征。DNBS和TNBS诱导的结肠炎均伴随大量淋巴细胞浸润结肠黏膜，因此这些模型特别适用于研究T细胞依赖性免疫机制。</li>
</ol>
与DSS模型相比，DNBS和TNBS诱导结肠炎的优点包括成本低、结肠炎发展迅速（通常需1-3天即可出现可重复的溃疡和炎症）以及对远端结肠造成一致的局部损伤。然而，其缺点是需要更高的技术操作水平、DNBS/TNBS剂量的优化，以及直肠给药时需使用麻醉。
在本方法学论文中，我们研究了不同浓度的n-6和n-3多不饱和脂肪酸对大鼠结肠黏膜在DNBS诱导结肠炎中反应的影响，所用油脂包括红花油（SO）、芥花油（CO）和鱼油（FO）。已有研究表明，n-6和n-3脂肪酸因其作为细胞膜磷脂中酰基部分的作用，是肠道炎症性疾病的重要调节介质。9与n-6脂肪酸的促炎潜力相反，当摄入量足够高时，n-3脂肪酸可能具有强效的抗炎作用。n-3脂肪酸的抗炎作用通过多种机制介导：直接机制包括以n-3脂肪酸替代花生四烯酸作为类二十烷酸的前体底物，从而抑制花生四烯酸的代谢；间接机制则涉及调控促炎基因的表达和细胞信号通路。此外，n-3脂肪酸还可衍生出消退素（resolvins），这是一类具有抗炎作用的介质分子。高摄入n-3脂肪酸与促炎性类二十烷酸、细胞因子、趋化因子、活性氧物种的生成减少以及黏附分子表达下调密切相关。在本研究中，大鼠被自由摄食营养成分完全相同、仅脂肪酸组成不同的饲料，其中脂肪供能比分别为20%大豆油（SO）、20%玉米油（CO）或18%鱼油加2%红花油（FO）。10-11百分比形式&#160;每日能量中，SO饮食提供了15%的亚油酸（LA）， &#60;0.06%的α-亚麻酸（ALA），不含二十碳五烯酸（EPA）或二十二碳六烯酸（DHA）；CO饮食组含有4.2%的亚油酸（LA）和1.9%的ALA，不含EPA或DHA；FO饮食组提供1.4% EPA、4.9% DHA、0.32% LA和0.12% ALA。在开始脂质饮食干预3周后，小鼠经直肠给予DNBS或50%乙醇处理，并在5天后处死。通过评估体重减轻程度、组织学损伤评分及组织髓过氧化物酶活性来评价炎症反应。

<table><tbody><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>19 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305187</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE-50</td><td>BD Biosciences</td><td>427517</td><td>用于小鼠直肠内给药</td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE-90</td><td>BD Biosciences</td><td>427519</td><td>用于大鼠直肠内给药</td></tr><tr><td>DNBS</td><td>MP Bio</td><td>150959</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>泪胶</td><td>Novartis</td><td>63601662596</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Fisher</td><td>5F93-4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>A-962.4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸钾缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79628-</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>邻二安息香胺二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3252</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31642</td><td>过氧化氢</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>BioRad</td><td>Benchmarker Plus</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Image.Z1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数据分析软件程序&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism Software Version 4.00</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

dnbs/tnbs 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，长期以来被认为具有遗传基础，而近期研究更发现其与宿主对微生物及环境因子的免疫应答密切相关。采用二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的结肠炎模型，可用于研究与IBD相关的环境诱因（如应激和饮食）的发病机制、潜在疗法的效果，以及肠道炎症和黏膜损伤的内在机制。本文中，我们探讨了饮食中n-3和n-6脂肪酸对大鼠DNBS诱导结肠炎后结肠黏膜炎症反应的影响。所有大鼠均饲喂相同饮食，仅脂肪酸类型不同，分别为红花油（SO）、菜籽油（CO）或鱼油（FO），持续三周&#160;在经直肠给予DNBS前数周，给予乙醇的对照组大鼠在为期5天的研究期间持续增重，而接受DNBS处理并饲喂脂质饮食的大鼠均出现体重下降，其中鱼油（FO）和玉米油（CO）饲喂组大鼠在48小时时表现出显著体重减轻&#160;hr 和喂食 SO 的大鼠在 72 小时时&#160;小时。体重在72小时后重新开始增加&#160;hr post DNBS，至 DNBS 处理后第 5 天，FO 组的体重高于 SO 组和 CO 组。于 DNBS 处理后第 5 天采集的结肠组织切片&#160;DNBS处理后数天，各饮食组均出现局灶性溃疡、隐窝破坏、杯状细胞减少以及急性和慢性炎性细胞的黏膜浸润，但组织损伤程度在各饮食组间存在差异。其中，SO饲喂组损伤最严重，其次为CO饲喂组，FO饲喂组组织损伤最轻。类似地，结肠髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞活性的标志物）在SO饲喂大鼠中显著升高，CO饲喂大鼠次之，而FO饲喂大鼠的MPO活性显著较低。这些结果表明，本方案所述的DNBS诱导结肠炎模型可用于评估饮食对炎症性肠病（IBD）发病机制的影响。

使用DNBS对大鼠（Sprague-Dawley）或小鼠（C57BL/6）进行造模，通常会导致短暂的体重下降和腹泻，有时粪便中带血。然而，遗传、饮食以及肠道微生物群等因素可能影响动物对DNBS诱导结肠炎的易感性。因此，实验中所用动物应来自同一机构，可为本地繁育或从单一动物供应商处订购。所有动物在结肠炎期间的体重下降程度及痛苦症状均需密切监测。
所展示的结果 图1-4 代表一项实验，评估了三种膳食油——红花油、芥花油和鱼油——对DNBS结肠炎严重程度的影响。组间统计学差异通过单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验确定，所用数据分析软件程序进行分析。P值为 &lt;0.05 被视为具有显著性。
经直肠给予DNBS（20 mg DNBS/250 μl 50%乙醇）后，补充鱼油（FO）和玉米油（CO）的大鼠在48小时时已出现显著体重下降，补充大豆油（SO）的大鼠则在72小时时出现显著体重下降（P&lt;0.05）。体重下降的最大值在补充FO的大鼠中出现在48小时，在补充CO...

DNBS/TNBS 诱导的结肠炎为研究炎症性肠病的发病机制提供了一种替代且经济的方法。本文讨论的实验方案概述了成功应用 DNBS 在小鼠和大鼠中诱导结肠炎的方法，从而可深入研究宿主介导的肠道免疫应答。

DNBS/TNBS 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，长期以来被认为具有遗传基础，而最近……

本实验的总体目标是提供一种替代性且经济的方法，利用二硝基苯肼酸（DNBS）研究炎症性肠病（IBD）。该方法首先通过轻柔插入肛门的方式进行直肠内给予DNBS。第二步，获取大肠组织切片，用于组织学筛查，并评估经DNBS刺激后组织的髓过氧化物酶活性。最终，可通过宏观和微观方法评估膳食油脂对体重减轻和结肠炎的影响。与现有的右旋糖酐硫酸钠方法相比，DNBS方法的主要优势在于操作简便、成本较低且具有高度可重复性。该方法有助于回答炎症性肠病（IBD）研究领域中的一些关键问题，例如应激和抑郁在IBD复发中的作用是什么，或肠道损伤与修复的潜在机制是什么。在小鼠中进行DNBS直肠给药时，首先将1毫升注射器连接至19号针头，装配聚乙烯50导管，然后吸取新鲜配制的DNBS溶液至导管中。接下来，将眼用凝胶涂抹于麻醉后的小鼠，并用指尖轻轻按压动物后端，以清除远端结肠内存在的任何粪便。然后注入少量DNBS溶液，以润滑结肠便于插入，同时轻柔地将导管经直肠插入约3至4厘米。导管就位后，向实验组小鼠注入100 µL的DNBS溶液，对照组动物则注入等体积的50%乙醇。然后将动物头部朝下放置90秒，以避免试剂流失。给予DNBS后，在第一周内为动物提供含8%蔗糖的0.2%生理盐水，以防止脱水。在整个实验期间，需密切监测动物每日的体重减轻、脱水或痛苦情况，直至达到预定的时间点。在给予 DNBS 刺激后，打开被处死动物的腹腔并取出整个大肠。然后沿肠管纵轴切开肠道。应在距结肠远端约 2 至 3 厘米的近端处观察是否存在肉眼可见的黏膜溃疡。采集实验动物中肉眼可见损伤最严重部位近端0.5厘米的肠段，以及对照动物相应解剖位置的结肠组织段。随后，将一个对照组和一个1D NBS处理组的0.5厘米组织样本在液氮中速冻，用于髓过氧化物酶活性检测；其余组织样本则用10%中性缓冲甲醛固定过夜，用于组织学分析。次日早晨，用70%乙醇清洗经甲醛固定的组织，放入组织包埋盒中，送至组织学实验室进行石蜡包埋，并进行苏木精-伊红染色，以便组织学评分。然后在光学显微镜下对每只动物至少评分三个组织切片，以确定各组的组织学损伤评分。为检测DNBS刺激组织的髓过氧化物酶活性，首先将速冻的对照组和实验组组织在髓过氧化物酶匀浆缓冲液中匀浆，制成每毫升匀浆缓冲液悬浮液含50毫克结肠组织的匀浆液。然后将匀浆液分装为每份1毫升，于4°C、10,000 × g离心2分钟。接下来，将每份等分试样各取 100 微升转移至各自的比色皿中，加入 2.9 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并添加 IDE、盐酸二氢盐和过氧化氢，充分混匀。最后，在 460 纳米波长下使用分光光度计测定吸光度变化速率。随后进行直肠内 DNBS 攻击，操作如前所述。在补充鱼油或芥花油的大鼠中，48小时即可观察到显著的体重下降；而在补充红花油的大鼠中，则在72小时出现显著体重下降。体重下降的最大

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了解使用二硝基苯磺酸在小鼠和大鼠中诱导结肠炎的方法，用于研究炎症性肠病。该方案操作简单、成本低廉且可重复性高，有助于深入分析肠道损伤与修复机制及膳食脂肪对疾病的影响。

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