DNBS/TNBS 结肠炎模型：揭示炎症性肠病及膳食脂肪影响

本实验的总体目标是提供一种替代性且经济的方法，利用二硝基苯肼酸（DNBS）研究炎症性肠病（IBD）。该方法首先通过轻柔插入肛门的方式进行直肠内给予DNBS。第二步，获取大肠组织切片，用于组织学筛查，并评估经DNBS刺激后组织的髓过氧化物酶活性。最终，可通过宏观和微观方法评估膳食油脂对体重减轻和结肠炎的影响。

与现有的右旋糖酐硫酸钠方法相比，DNBS方法的主要优势在于操作简便、成本较低且具有高度可重复性。该方法有助于回答炎症性肠病（IBD）研究领域中的一些关键问题，例如应激和抑郁在IBD复发中的作用是什么，或肠道损伤与修复的潜在机制是什么。在小鼠中进行DNBS直肠给药时，首先将1毫升注射器连接至19号针头，装配聚乙烯50导管，然后吸取新鲜配制的DNBS溶液至导管中。

接下来，将眼用凝胶涂抹于麻醉后的小鼠，并用指尖轻轻按压动物后端，以清除远端结肠内存在的任何粪便。然后注入少量DNBS溶液，以润滑结肠便于插入，同时轻柔地将导管经直肠插入约3至4厘米。导管就位后，向实验组小鼠注入100 µL的DNBS溶液，对照组动物则注入等体积的50%乙醇。

然后将动物头部朝下放置90秒，以避免试剂流失。给予DNBS后，在第一周内为动物提供含8%蔗糖的0.2%生理盐水，以防止脱水。在整个实验期间，需密切监测动物每日的体重减轻、脱水或痛苦情况，直至达到预定的时间点。

在给予 DNBS 刺激后，打开被处死动物的腹腔并取出整个大肠。然后沿肠管纵轴切开肠道。应在距结肠远端约 2 至 3 厘米的近端处观察是否存在肉眼可见的黏膜溃疡。

采集实验动物中肉眼可见损伤最严重部位近端0.5厘米的肠段，以及对照动物相应解剖位置的结肠组织段。随后，将一个对照组和一个1D NBS处理组的0.5厘米组织样本在液氮中速冻，用于髓过氧化物酶活性检测；其余组织样本则用10%中性缓冲甲醛固定过夜，用于组织学分析。次日早晨，用70%乙醇清洗经甲醛固定的组织，放入组织包埋盒中，送至组织学实验室进行石蜡包埋，并进行苏木精-伊红染色，以便组织学评分。

然后在光学显微镜下对每只动物至少评分三个组织切片，以确定各组的组织学损伤评分。为检测DNBS刺激组织的髓过氧化物酶活性，首先将速冻的对照组和实验组组织在髓过氧化物酶匀浆缓冲液中匀浆，制成每毫升匀浆缓冲液悬浮液含50毫克结肠组织的匀浆液。然后将匀浆液分装为每份1毫升，于4°C、10,000 × g离心2分钟。

接下来，将每份等分试样各取 100 微升转移至各自的比色皿中，加入 2.9 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并添加 IDE、盐酸二氢盐和过氧化氢，充分混匀。最后，在 460 纳米波长下使用分光光度计测定吸光度变化速率。随后进行直肠内 DNBS 攻击，操作如前所述。

在补充鱼油或芥花油的大鼠中，48小时即可观察到显著的体重下降；而在补充红花油的大鼠中，则在72小时出现显著体重下降。体重下降的最大值出现在补充鱼油的大鼠中，时间为48小时；而在补充芥花油或红花油的大鼠中，最大体重下降出现在72小时。

在DNBS给药后72小时，体重增加重新开始，到第5天时，鱼油和红花油处理组的体重已恢复至接近其基线水平。经饮食用油补充并接受直肠内乙醇刺激的对照组大鼠在整个为期五天的研究期间体重持续增加。DNBS引起的肠道损伤可能较为广泛。

然而，最大损伤区域通常局限于大鼠结肠远端六厘米处和小鼠结肠远端三厘米处。通过更细致的组织学评估，可观察到广泛的上皮损伤，包括溃疡形成、中性粒细胞和淋巴细胞浸润、黏液减少以及水肿。尽管在DNBS刺激后，三种膳食油补充组均表现出明显的炎症和组织损伤的组织学征象，但最严重的损伤出现在红花油组，其次是芥花油组。

而鱼油组的大鼠表现出极轻微的上皮损伤，且炎症细胞向黏膜层的浸润有限。各样本间组织学损伤的差异可进行量化，以便各组之间进行更准确的比较。该图表展示了DNBS结肠炎期间三种膳食油脂组的组织学损伤评分。

如苏木精和伊红染色切片所示，红花油补充组的损伤程度最严重，其次是菜籽油组。尽管鱼油组的损伤程度最小，但通过髓过氧化物酶活性检测可进一步评估炎性细胞（尤其是中性粒细胞）的浸润程度。该结果与组织学损伤评分的预期一致。

在DNBS暴露后第5天检测大鼠结肠中的髓过氧化物酶活性，结果显示所有三个组的酶活性均升高，其中红花油组的髓过氧化物酶活性最高，其次是芥花油组和鱼油组。在进行该操作时，需注意对小鼠进行轻度麻醉，并在其建立模型后优化DNBS的剂量。该技术为炎症性肠病领域的研究人员探索IBD动物模型中调控肠道炎症的机制奠定了基础。

请注意，使用DNBS可能具有极高危险性，因此在配制溶液时，必须始终穿戴防护服、手套、护目镜和面部防护装备。