Name: 使用气相色谱怀孕期间分析脂肪酸组成的变化在大鼠肝组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 了解如何使用气相色谱分析大鼠肝组织中脂肪酸组成的变化。该方法通过固相萃取分离脂质类别，并衍生化为脂肪酸甲酯，适用于研究孕期营养干预对脂质代谢的影响。

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作者谨此感谢 Meritxell Romeu-Nadal 对大鼠研究的贡献。

1. 动物实验操作
<ol>
	<li>所有动物实验均应遵循英国内政部《动物（科学程序）法案》（1986年）的规定进行。</li>
	<li>将10周龄的Wistar大鼠按一雄一雌配对交配，通过观察阴道栓的出现确认妊娠，并将发现阴道栓当日记为妊娠第1天，同时开始给予实验饮食。对于未交配的雌性大鼠，每只单独饲养，并开始给予实验饮食。</li>
	<li>给予实验饮食20天后，采用CO2窒息法处死大鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>使用解剖镊和剪刀暴露腹腔，剪断连接肝脏与膈肌、腹前壁、胃及十二指肠的韧带，完整切除肝脏。用PBS冲洗肝脏后，置于液氮中速冻，随后储存在-80 °C条件下。</li>
</ol>
2. 总脂质提取物的制备9
<ol>
	<li>向所有溶剂中加入分子筛（填充至溶剂容器体积的1/10&#160;），以制备“无水”溶剂。所有溶剂操作均应在通风橱内进行。</li>
	<li>取约100 mg冷冻肝脏组织并称重。将组织置于冰桶中的试管内，加入0.8 ml冰浴预冷的0.9% NaCl溶液，匀浆处理组织。</li>
	<li>加入用1 ml/mg无水氯仿:甲醇（2:1, v/v）溶解的内标物，其中含&#160;作为抗氧化剂的丁基化羟基甲苯（BHT；50 mg/L）。对于100 mg大鼠肝脏组织，加入100 μg胆固醇酯标准品（胆固醇十七烷酸酯 17:0）。注意：氯仿和BHT具有危害性。</li>
	<li>加入5.0 ml含BHT（50 mg/L）的无水氯仿:甲醇（2:1, v/v）。</li>
	<li>加入1.0 ml 1 M NaCl溶液，涡旋充分混匀直至混合物外观均匀。此步骤后样品可密封，并于-20 °C保存最多一周。</li>
	<li>在室温下以1,000 × g离心10分钟，使用低刹车模式。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管收集下层有机相，转移至新的带螺口盖的玻璃试管中，并在40 °C下用氮气吹干。此步骤后样品可密封，并于-20 °C保存最多一周。</li>
</ol>
3. 通过固相萃取（SPE）分离脂质类别10
<ol>
	<li>将固相萃取罐连接至真空泵，并在罐上安装aminopropyl silica SPE cartridge。</li>
	<li>在柱下方的收集架中放置新标记为TAG和CE的带螺口盖玻璃管，用于收集第一部分馏分。</li>
	<li>将总脂质提取物溶解于1.0 ml无水氯仿中，并涡旋混匀。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将样品加至柱中，依靠重力使其滴入下方的螺口管。当不再有液滴滴下时，用真空抽除残留液体。</li>
	<li>在真空条件下洗脱TAG和CE组分，用2次1.0 ml无水氯仿洗涤柱子。</li>
	<li>当所有液体被去除后，在40 °C下用氮气吹干TAG和CE组分。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。</li>
	<li>在柱下方的收集盘中放置新标记为PC的带螺口盖玻璃管。</li>
	<li>在真空条件下，加入2次1.0 ml无水氯仿:甲醇（60:40, v/v）洗脱PC组分，直至柱中所有液体被去除。</li>
	<li>取出PC组分并在40 °C下用氮气吹干。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。</li>
	<li>在收集盘中放置新标记为PE的带螺口盖玻璃管，并在真空条件下加入1.0 ml无水甲醇洗脱PE组分。</li>
	<li>取出PE组分并在40 °C下用氮气吹干。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。</li>
	<li>在收集盘中放置新标记为NEFA的带螺口盖玻璃管，并在真空条件下加入2次1.0 ml无水氯仿:甲醇:冰醋酸（100:2:2, v/v/v）洗脱NEFA组分。注意：冰醋酸具有危险性。&#160;</li>
	<li>收集NEFA组分并将其在40 °C下用氮气吹干。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。</li>
	<li>在固相萃取罐上安装一个新的aminopropyl silica SPE cartridge，并在柱下方的收集盘中放置一个带螺口盖的玻璃管，用于收集废液。</li>
	<li>在真空条件下用3次无水正己烷洗涤柱子&#160;，最后在重力条件下进行一次1.0 ml的洗涤。切勿让柱子完全干燥（当正己烷液面接近柱填料时，将柱通道关闭）。注意：正己烷具有危险性。</li>
	<li>将废液管更换为新标记为CE的带螺口盖玻璃管。</li>
	<li>将第3.6步制备的干燥TAG和CE组分溶解于1.0 ml无水正己烷中，并涡旋混匀。使用玻璃巴斯德吸管将溶液加至柱中，依靠重力使其滴下。</li>
	<li>当不再有液滴滴下时，用真空抽除残留液体。</li>
	<li>在真空条件下，用2次1.0 ml无水正己烷洗涤柱子以洗脱CE组分，并将收集的馏分在40 °C下用氮气吹干。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。</li>
	<li>在收集盘中放置新标记为TAG的带螺口盖玻璃管，并在真空条件下加入2次1.0 ml无水正己烷:甲醇:乙酸乙酯&#160;（100:5:5）洗脱TAG组分。</li>
	<li>将收集的组分在40 °C下用氮气吹干。此阶段样品可密封后于-20 °C保存，最长可保存一周。注意：乙酸乙酯具有危险性。</li>
</ol>
4. 从CE10制备FAME
<ol>
	<li>向分离的 CE 组分（在步骤 3.19 中收集）中加入 0.5 ml 无水甲苯，涡旋混匀。&#160;注意：甲苯具有危害性。</li>
	<li>制备甲基化试剂（含 2% (v/v) H2SO4 的无水甲醇），每份样品需 1.0 ml。将适量无水甲醇加入带盖的玻璃或合适塑料容器中，逐滴加入所需量的 H2SO4，然后通过倒置混匀。&#160;注意：硫酸具有危害性。</li>
	<li>向溶于无水甲苯的样品中加入 1.0 ml 甲基化试剂，盖紧管盖，并轻轻混匀。</li>
	<li>在 50 °C 下加热样品 2 小时。</li>
	<li>2 小时后从加热装置中取出试管。待冷却后加入 1.0 ml 中和液（0.25 M KHCO3&#160;0.5M K2CO3）。注意：碳酸氢钾和碳酸钾具有危害性。</li>
	<li>加入 1.0 ml 无水己烷，涡旋混匀。</li>
	<li>在室温下以 250 × g 离心 2 分钟，低刹车。</li>
	<li>收集含有脂肪酸甲酯（FAME）的上层相，并转移至新的非螺口一次性玻璃试管中。</li>
	<li>在 40 °C 下用氮气吹干收集的脂肪酸甲酯（FAME）。此阶段样品可加盖并在 -20 °C 下保存最多一周。</li>
</ol>
5. 去除CE FAME中的游离胆固醇污染14
（游离胆固醇可能污染样品；示例色谱图谱请参见图1，分别显示去除与未去除游离胆固醇的情况）。
<ol>
	<li>将废液管放入固相萃取罐中，并将硅胶固相萃取小柱置于罐上。</li>
	<li>在真空条件下用3次、每次1 ml的干燥正己烷洗涤柱，再在重力条件下用1次1 ml洗涤。</li>
	<li>移除废液，并将新的废液管放入罐中。</li>
	<li>将CE FAME溶解于1 ml干燥正己烷中，涡旋混匀。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将样品加入柱中，让其在重力作用下自然滴落通过。</li>
	<li>在真空条件下用3次、每次1 ml的正己烷洗涤柱。</li>
	<li>移除废液，并将标记为CE FAME的新无螺口试管放入罐中。</li>
	<li>用2次、每次1 ml的干燥正己烷：乙醚（95:5 v/v）溶液洗涤，洗脱CE FAME。</li>
	<li>在40 °C下用氮气吹干。样品在此阶段可密封后于-20 °C保存最多一周。注意：乙醚具有危险性。</li>
</ol>
6. 将脂肪酸甲酯转移至气相色谱自动进样瓶
<ol>
	<li>向样品中加入 75 μl 干燥的正己烷，涡旋混匀，然后转移至气相色谱自动进样小瓶中。</li>
	<li>再向样品中加入 75 μl 干燥的正己烷，涡旋混匀后转移至同一气相色谱自动进样小瓶中。样品在此阶段可密封后于 -20 °C 保存，最长可保存一个月。</li>
</ol>
7. 使用气相色谱仪进行分析14
<ol>
	<li>在气相色谱仪上分析脂肪酸甲酯（FAME）。示例设置：30 m × 0.25 μm × 0.25 mm BPX-70 熔融石英毛细管柱，温度程序如下： 
	初始温度115 °C，保持2 min，以10 °C/min升温至200 °C，保持18.5 min，以60 °C/min升温至245 °C，保持4 min。 
	色谱柱：氦气，流速1.0，压力14.6，流速29。 
	进样器：温度 = 300 °C。 
	检测器：氢气流速 40.0，空气流速 184.0，补充气体为氦气，流速 45.0，温度 = 300 °C。</li>
	<li>根据需要设置分割比例（例如 25:1，用于毛细管电泳FAME分析。</li>
	<li>使用适当的软件确定每个峰的面积，并通过与标准品比较鉴定FAME。参见 图2 例如色谱图。</li>
	<li>利用峰下面积数据计算每种脂肪酸占总脂肪酸的百分比贡献。</li>
	<li>通过将内标物峰面积除以其添加量，计算脂肪酸的绝对浓度。再将每种脂肪酸的峰面积除以该结果，得到所用组织样品中每种脂肪酸的绝对浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

气相色谱法是一种用于脂肪酸分析的准确技术，其高重复性使其适用于临床分析。&#160;必须选用合适的气相色谱柱，以便鉴定目标脂肪酸，现有色谱柱在固定相极性、柱长和内径方面存在差异。在该分析方法中使用熔融石英毛细管柱，由于其表面惰性强、分辨率好，因而具有良好的热稳定性和保留时间的高重复性8。

本方案中的关键步骤包括下相和上相的收集步骤（方案步骤 2.7 和 4.8）。在收集过程中，应尽可能完全收集目标相，同时避免混入任何非目标相的污染。样品中若存在杂质，将导致色谱结果不理想，如图 2所示。在固相萃取（SPE）过程中收集胆固醇酯（CE）时，必须在用正己烷洗涤后始终保持萃取柱被溶剂充分饱和（步骤 3.15），以确保样品充分渗透柱体，从而实现胆固醇酯与甘油三酯（TAG）的有效分离。进一步分离以去除游离胆固醇至关重要，可避免色谱图中出现干扰峰，如图 1所示。&#160;此外，对于需要在真空条件下去除液体的步骤，也必须严格遵循操作，确保柱内液体被彻底...

气相色谱法（GC）是一种成熟的技术，用于鉴定并定量分析脂肪酸在脂质库和细胞膜中的掺入情况1,2 在补充剂使用或肥胖（及相关疾病如糖尿病）或妊娠等生理条件下3-5它也适用于分析食品中脂肪的种类和含量。这在表征实验饮食以及确保食品工业符合相关法规时具有重要意义。例如，气相色谱法可用于确认膳食补充剂等产品中脂肪酸的种类和含量，以确保标签信息准确并符合法规要求。6,7. &#160;脂肪酸分析可为健康与疾病状态下的脂质代谢、饮食改变的影响以及生理状态变化的作用提供有价值的见解8利用气相色谱法研究妊娠期间的样本，为脂肪酸和复杂脂质稳态的变化提供了重要信息3.

在色谱分离之前，通常使用氯仿和甲醇的溶剂混合物，基于脂质在其中的溶解性，从样品中提取脂质。加入氯化钠以促进混合物分离为水相和含脂质的有机相9,10。通过固相萃取（SPE）可将感兴趣的复杂脂质类别从总脂质提取物中分离出来。该分离技术依据脂质的极性或结合亲和力来洗脱不同的脂质类别。三酰甘油（TAG）和胆固醇酯（CE）首先作为合并组分被洗脱；随后通过逐步提高洗脱溶剂的极性，依次洗脱磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）以及非酯化脂肪酸（NEFA）。将TAG与CE分离时，利用TAG仅与新的SPE小柱结合的特性，使CE先被洗脱，随后通过提高洗脱溶剂的极性将TAG洗脱出来9,10。该方法可同时处理多个样品，且得率高于薄层色谱法，因此可用于分析相对较小&#160;的样品（例如 &#60;100 µl 血浆或血清，&#60;100 mg 组织）11,12。

气相色谱（GC）是一种成熟的分析技术，最早于20世纪50年代提出；当时有研究建议，可将当时液-液体系中的流动相替换为蒸气。该技术最初用于石油分析，但迅速扩展到其他领域，如氨基酸分析和脂质生物化学，后者至今仍具有重要研究价值。随着气相色谱设备和技术的进步，例如从早期填充柱发展为毛细管柱，使得当前的技术能够在较低温度下更高效地分离脂肪酸，因此GC被广泛常规用于多种研究中脂肪酸的鉴定与定量分析13。

气相色谱法（GC）要求脂肪酸经过衍生化处理，使其具有足够的挥发性，以便在合理温度下洗脱而不发生热分解。这通常涉及将含氢的官能团取代，生成酯、硫酯或酰胺用于分析。甲酯是常见的衍生化产物，通过甲基化反应制得。本方法中，复杂脂质中的酯键被水解，释放出游离脂肪酸，再经转酯化反应生成脂肪酸甲酯（FAME）。&#160;通过气相色谱法测定得到的FAME谱图被称为脂肪酸组成，可在不同实验组之间进行简便比较9,10。该技术可同时测定各单个脂肪酸的相对比例及其浓度。

除了在营养学研究和食品工业中用于分析脂肪酸外，气相色谱法还可广泛应用于多种分析领域。例如，在环境分析中，气相色谱可用于检测杀虫剂对水体的污染，以及测定土壤中氯苯的含量。在毒理学领域，气相色谱也已被用于鉴定个体尿液和血液样本中的非法物质，例如运动兴奋剂12；此外，由于该技术能够分离复杂的碳氢化合物混合物，因此在石油工业的石油化工分析中也广受欢迎12。

妊娠与母体组织中脂肪酸组成发生显著变化相关，特别是 omega-3 (n-3) 和 omega-6 (n-6) 多不饱和脂肪酸（PUFA）含量的变化3。&#160; 在本研究中，我们以分析未孕和妊娠大鼠肝脏组织的脂肪酸组成为例，说明气相色谱法（GC）在脂肪酸测定中的应用，这些大鼠分别被喂食以不同油脂来源为基础的低脂和高脂饮食。实验中所用饮食包括：基于大豆油的低脂饮食、基于大豆油的高脂饮食（总脂肪含量为 130.9 g/kg 饮食）或基于亚麻籽油的高脂饮食（总脂肪含量为 130.9 g/kg 饮食），持续喂养 20 天。&#160; 这些饮食的完整营养成分和脂肪酸组成此前已有描述14。大豆油饮食富含亚油酸（18:2n-6），并含有一定量的 α-亚麻酸（18:3n-3），而亚麻籽油饮食则富含 α-亚麻酸。这些高脂饮食中亚油酸与 α-亚麻酸的比例不同（分别为 8:1 和 1:1）。针对单个脂类的分离及其气相色谱分析方法已得到充分建立和验证，并已有发表10，但此前未提供本文中如此详细的技术说明。

<table><tbody><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td>'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4966/17</td><td>'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级</td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>W218405</td><td>'CAUTION' 粉尘蒸气 - 无水</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S9888</td><td>无水</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/0406/17</td><td>'CAUTION' 蒸气 - HPLC 级</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>695084</td><td>'CAUTION' 腐蚀性 - 99.85%</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>339741</td><td>'CAUTION' 腐蚀性 - 99.999%</td></tr><tr><td>碳酸钾</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>209619</td><td>99% ACS 试剂级</td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>237205</td><td>99.7% ACS 试剂级</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Fisher Scientific</td><td>10204340</td><td>'CAUTION' 蒸气 - 99+% GLC 指定</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>T/2300/15</td><td>'CAUTION' 蒸气</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>309966</td><td>'CAUTION' 蒸气</td></tr><tr><td>氮气（无氧）钢瓶</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>'CAUTION' 压缩气体 - 有爆炸风险</td></tr><tr><td>氨基丙基硅胶 SPE 小柱</td><td>Agilent</td><td>12102014</td><td>小柱 - 填料质量 100 mg</td></tr><tr><td>硅胶 SPE 小柱</td><td>Agilent</td><td>14102010</td><td>小柱 - 填料质量 100 mg</td></tr><tr><td>分子筛</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>颗粒，AW-300，1.6 mm</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

利用气相色谱法分析大鼠肝组织在妊娠期间脂肪酸组成的变化

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

气相色谱法（GC）是一种高灵敏度的方法，用于鉴定和定量组织、细胞以及血浆/血清中脂质的脂肪酸含量，具有高准确性和高重复性。在代谢与营养研究中，GC 可用于评估干预措施后或生理状态变化（如妊娠）期间脂肪酸浓度的变化。使用氨基丙基硅胶柱的固相萃取（SPE）可实现主要脂类的分离，包括甘油三酯、不同类型的磷脂和胆固醇酯（CE）。结合 SPE 的 GC 技术被用于分析饲喂不同高脂和低脂饮食的未孕和妊娠大鼠肝脏中 CE 组分脂肪酸组成的变化。饮食与妊娠之间存在显著的交互作用，影响肝脏 CE 中 omega-3 和 omega-6 脂肪酸的含量，表明妊娠雌性对饮食调控的反应与未孕雌性不同。

该方法的成功取决于严格遵循实验步骤，并使用洁净的溶剂和试剂，以减少色谱图上可能出现的“噪音”和污染。样品若被污染，分析难度将增加，从而降低曲线下面积计算的准确性。若成功遵循本方案，应获得一张具有清晰、对称、峰形明确且背景噪音极低的色谱图，如图3所示。若发生污染，色谱图将出现额外峰，并表现出非对称（偏斜）的峰形，如图4所示。当分析由胆固醇酯（CE）衍生的脂肪酸甲酯（FAME）时，若未去除胆固醇（见图1），将导致游离胆固醇污染（去除方法见方案5）。
使用预先配制的校准混合物可实现对样品中脂肪酸甲酯（FAME）的鉴定。校准混合物采用与样品相同的仪器设置进行检测，以便将所得色谱图与样品进行比较，并根据保留时间准确识别各色谱峰，如图2所示。
采用峰面积来计算特定脂肪酸占总量的百分比。数据收集完成后，建议检查是否存在离群值，如图5所示。对于存在离群值的样本，可进一步调查，...

妊娠会导致母体组织中脂肪酸组成发生显著变化。可通过气相色谱法获取脂质谱，从而对妊娠期间饲喂不同高脂和低脂饮食的大鼠个体脂质类别中的脂肪酸进行鉴定和定量分析。

气相色谱法（GC）是一种高灵敏度的方法，用于鉴定和定量组织、细胞以及血浆/血清中脂质的脂肪酸含量，……

本实验的总体目标是分析肝脏中的脂肪酸组成。首先称取一定量的肝脏样品并进行匀浆处理，以实现该目标。第二步是从匀浆后的肝脏样品中提取全部脂质。接下来，使用固相萃取分离各个脂质类别，例如胆固醇酯。最后一步是将脂质类别鉴定并衍生化为脂肪酸甲酯。最终，通过气相色谱分析，展示组织中脂肪酸组成在营养干预后可能发生的变化，或受生理状态改变（如妊娠）的影响。尽管该方法可深入了解组织中的脂肪酸组成，但也适用于其他类型的样品，如油类、种子和食品。通常，初次使用该技术的用户可能会遇到困难，因为方案中的某些步骤需要熟练的手动操作并经过练习才能掌握，例如反复收集上层和下层相。本次实验操作将由我们实验室的技术员Hena Fisk和博士生Annette West进行演示。首先切取约100毫克冷冻肝脏组织并称重。将组织放入冰桶中的塑料管内，加入0.5毫升冰浴的0.9%氯化钠溶液。随后匀浆组织，并转移至带螺口盖的玻璃管中。使用另外 0.3 毫升 0.9% 氯化钠溶液，将残留的任何组织转移至玻璃螺口管中。随后，向管中加入 100 微克胆固醇七烯标准品，该标准品溶于 2:1（氯仿:甲醇）的干燥溶剂中，接着加入 5 毫升含有 50 毫克/升丁基化羟基甲苯的相同溶剂溶液。加入 1 毫升 1 摩尔氯化钠溶液后，盖紧管盖，并通过涡旋充分混匀样品，直至其外观均匀一致。然后在室温下以1000 × g离心10分钟，刹车设置为低档。离心结束后，使用玻璃巴斯德吸管收集下层相，并转移至新的带螺口盖的玻璃管中。随后在40 °C下用氮气吹干样品。此时，将固相萃取装置连接至真空泵，并在装置上安装一个氨基丙基硅胶固相萃取小柱。在柱下方的收集架中放置一支新的带螺帽玻璃管，标记为TAG和CCE，用于收集第一段洗脱组分。将总脂质提取物溶解于1毫升干燥氯仿中，并通过涡旋振荡混合样品。随后，使用玻璃棒毛细管将样品转移至层析柱中，让液体在重力作用下自然滴入螺口管。当液体不再从柱子中滴下时，通过真空抽吸去除残留液体。接下来，用一毫升干燥的氯仿在真空条件下洗涤柱子两次，以洗脱甘油三酯（TAG）和胆固醇酯（CE）组分。当所有液体从柱中流尽后，在40摄氏度下用氮气吹干TAG和CE组分。将一个新的氨基丙基硅胶固相萃取小柱置于固相萃取装置上，并在小柱下方的收集架中放置一个带螺旋盖的玻璃管以收集废液。在真空条件下，用1毫升干燥的正己烷洗涤柱子三次。关闭真空后，依靠重力用一毫升正己烷冲洗柱子一次。将废液管更换为标记为 ce 的新螺口玻璃管后，将干燥的甘油三酯（TAG）和胆固醇酯（CE）组分溶解于一毫升干燥正己烷中，并通过涡旋混合样品。然后使用玻璃移液管或移液器将样品转移至柱子中，依靠重力使液体滴过柱子。当液体不再从柱中滴出时，在真空条件下移除柱中残留的液体。用一毫升干燥的正己烷洗涤柱两次，以洗脱胆固醇酯（CE），并在40摄氏度下用氮气吹干收集的馏分。随后，向分离得到的CE馏分中加入0.5毫升干燥的甲苯，通过涡旋混合样品。向溶解于干燥甲苯中的样品中加入1毫升预先配制的甲基化试剂。然后盖紧管盖并混匀，于50摄氏度下轻轻加热样品2小时。待样品冷却至室温后，加入1毫升中和溶液。接下来，向样品中加入1 mL干燥的正己烷。涡旋混匀后，在室温下以250 × g离心2分钟，刹车设置为低档。离心结束后，收集上层有机相，并转移至新的无螺口一次性玻璃试管中。在40 °C下用氮气吹干收集的有机相样品。将废液管放入固相萃取（SPE）罐中，并将硅胶固相萃取小柱置于罐上，在减压条件下用1毫升干燥正己烷洗涤柱子三次，再在重力流条件下用1毫升干燥正己烷洗涤一次。去除洗涤废液后，向罐中更换新的废液管，然后将CE脂肪酸甲酯样品溶解于1毫升干燥正己烷中。涡旋混匀样品后，使用玻璃移液管或移液器将其转移至层析柱中。待液体在重力作用下完全流经层析柱后，在真空条件下用1毫升正己烷洗涤层析柱三次。随后，移除废液，并将一个新标记为CE fame的带螺口盖离心管放入收集罐中。用两份各一毫升的95:5无水正己烷-二乙醚混合溶剂洗脱CE fame组分。然后在40摄氏度下用氮气吹干收集的组分，将干燥后的组分溶解于75微升无水正己烷中，并在涡旋混匀后再次涡旋混合样品。重复前述步骤后，将样品转移至气相色谱自动进样小瓶中。如果成功遵循实验方案，应在气相色谱仪上分析样品。应获得一张具有清晰对称、定义明确的峰且背景噪声最小的色谱图，如图所示。如果发生污染，色谱图将显示额外的峰，并出现非对称或偏移的峰，如图所示。如果未去除胆固醇，在对来自胆固醇酯的脂肪酸甲酯进行检测时，游离胆固醇会带来污染。使用配制好的校准混合物可实现对样品中脂肪酸甲酯的鉴定。校准混合物采用与样品相同的仪器设置进行检测，以便将色谱图与样品进行比较，并根据保留时间鉴定各色谱峰，如此处所示。此处突出显示了16:0峰，以说明如何将上图色谱图中校准混合物的保留时间与脂肪酸进行比对。在下方的样品色谱图中，通过正确标记脂肪酸峰面积，用于计算特定脂肪酸占总量的百分比。数据采集完成后，如图所示，检查数据中是否存在异常值是十分必要的。随后可对异常样本进行进一步调查，并在必要时重复提取或分析。如图所示，大鼠肝脏CE中的脂肪酸以占肝脏CE总脂肪酸的百分比形式表示。这些数据描述了 virgin 或怀孕大鼠在三种不同饮食中的一种喂养20天后肝脏中CE脂肪酸的情况。采用双因素Innova进行统计分析，揭示了饮食和妊娠对多种脂肪酸比例具有显著影响，以及饮食与妊娠之间的显著交互作用。例如，饮食对妊娠大鼠肝脏胆固醇酯中onic acid含量的影响大于对未妊娠雌性大鼠的影响。若操作正确，该技术每天可完成从开始到结束的20个样本分析。一旦掌握，样本批量处理可提高通量，使每周处理的样本数量增加一倍。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用固相萃取和气相色谱法分析单个脂类组分的脂肪酸组成。请注意，使用有机溶剂具有极高危险性，在执行本实验操作时，务必采取相应预防措施，例如在通风橱中操作并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

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使用气相色谱怀孕期间分析脂肪酸组成的变化在大鼠肝组织

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