利用气相色谱法分析大鼠肝组织在妊娠期间脂肪酸组成的变化

本实验的总体目标是分析肝脏中的脂肪酸组成。首先称取一定量的肝脏样品并进行匀浆处理，以实现这一目标。第二步是从匀浆后的肝脏样品中提取全部脂质。

接下来，使用固相萃取分离各种脂质类别，例如胆固醇酯。最后一步是将脂质类别鉴定并衍生化为脂肪酸甲酯。最终通过气相色谱分析，揭示组织中脂肪酸组成在营养干预后的变化，或受生理状态改变（如妊娠）的影响情况。

尽管该方法可深入了解组织中的脂肪酸组成，但也适用于其他类型的样品，如油类、种子和食品。通常，初次使用该技术的用户可能会遇到困难，因为方案中的某些步骤需要熟练的手动操作并经过练习才能掌握，例如反复收集上层和下层相。本次实验操作将由我们实验室的技术员 Hena、Fisk 以及博士生 Annette West 演示。

首先切取约100毫克冷冻肝脏组织并称重。将组织放入冰桶中的塑料管内，加入0.5毫升冰冻的0.9%氯化钠溶液。然后匀浆组织，并转移至带螺口盖的玻璃管中。

使用另外0.3毫升0.9%氯化钠溶液，将残留的组织转移至玻璃螺口管中。随后，向管中加入100微克胆固醇七烯标准品，该标准品溶于2:1（v/v）的干燥氯仿-甲醇溶液中，接着加入5毫升含有50毫克/升丁基化羟基甲苯的相同溶剂溶液。加入1毫升1摩尔氯化钠溶液后，盖紧管盖，并通过涡旋充分混匀样品，直至溶液外观均匀一致。

然后在室温下以1000 × g离心10分钟，刹车设置为低。离心结束后，使用玻璃巴斯德移液管收集下层相，并转移至新的带螺口盖的玻璃管中。随后在40 °C下用氮气吹干样品。

此时，将固相萃取装置连接至真空泵，并在装置上安装一个氨基丙基硅胶固相萃取小柱。在柱下方的收集架中放置一支新的带螺帽玻璃管，标记为TAG和CCE，用于收集第一段洗脱组分。将总脂质提取物溶解于1毫升干燥氯仿中，并通过涡旋振荡混合样品。

随后，使用玻璃棒将样品转移至层析柱中，并让液体在重力作用下自然滴入螺口管。当液体不再从柱中滴下时，通过真空抽吸去除残留液体。接下来，用一毫升干燥的氯仿在真空条件下洗涤柱两次，以洗脱甘油三酯（TAG）和胆固醇酯（CE）组分。

当所有液体从柱中流出后，在40摄氏度下用氮气吹干TAG和CE组分。将一个新的氨基丙基硅胶固相萃取小柱置于固相萃取装置上，并在小柱下方的收集架中放置一个带螺旋盖的玻璃管以收集废液。在真空条件下，用1毫升干燥的正己烷洗涤柱3次。

关闭真空后，用一毫升正己烷在重力作用下冲洗柱子。将废液管更换为标记为 ce 的新螺口玻璃管后，将干燥的甘油三酯（TAG）和胆固醇酯（CE）组分溶解于一毫升干燥正己烷中，并通过涡旋混合样品。然后使用玻璃移液管或移液器将样品转移至柱子中，在重力作用下让液体自然滴过柱子。

当液体不再从柱子中滴下时，在真空条件下移除残留的液体。用一毫升干燥的正己烷洗涤柱子两次，以洗脱胆固醇酯（CE），并在40摄氏度下用氮气吹干收集的组分。随后，向分离得到的CE组分中加入0.5毫升干燥甲苯，通过涡旋混合样品。

向溶解于干燥甲苯中的样品中加入1毫升预先配制的甲基化试剂。然后盖紧管盖并混匀，于50摄氏度下轻轻加热样品2小时。待样品冷却至室温后，加入1毫升中和溶液。

接下来，向样品中加入一种干燥的正己烷。涡旋混匀后，在室温下以250 × g离心样品两分钟，刹车设置为低档。操作完成后，收集上层液相，并转移至一个新的非螺口一次性玻璃试管中。在40°C下用氮气吹干所收集的液相样品。

将废液管放入固相萃取罐中，并将硅胶固相萃取小柱安装到罐上后，在真空条件下用1 mL干燥正己烷洗涤柱子三次，再在重力条件下用1 mL干燥正己烷洗涤一次。去除洗涤废液后，向罐中更换新的废液管，然后将CE脂肪酸甲酯样品溶解于1 mL干燥正己烷中。

涡旋混匀样品后，使用玻璃移液管或移液器将其转移至层析柱中。待液体在重力作用下完全流经层析柱后，在真空条件下用1毫升正己烷洗涤层析柱三次。随后，移除废液，并将一个新标记为CE fame的带螺口盖离心管放入接收容器中。

用两份一毫升的95:5无水正己烷-二乙醚混合液洗脱CE薄层色谱的条带组分。然后在40摄氏度下用氮气吹干收集的组分，将干燥后的组分溶解于75微升无水正己烷中，并在涡旋混匀后再次涡旋混合样品。重复前述步骤后，将样品转移至气相色谱自动进样小瓶中。

如果成功遵循实验方案，应在气相色谱仪上分析样品。应获得一张具有清晰对称、定义明确的峰且背景噪声最小的色谱图，如图所示。如果发生污染，色谱图将显示额外的峰，并出现非对称或偏移的峰，如图所示。

除非去除胆固醇，否则在运行由CE制备的FAME时会受到游离胆固醇的污染。使用预先配制的校准混合物可实现对样品中FAME的鉴定。校准混合物采用与样品相同的仪器设置进行分析，以便将色谱图与样品进行比较，并根据保留时间鉴定各色谱峰，如此处所示。

此处突出显示了16:0峰，以说明如何将上方色谱图中校准混合物的保留时间与脂肪酸进行比对。在下方的样品色谱图中，通过正确标记脂肪酸峰面积，用于计算特定脂肪酸占总量的百分比。数据采集完成后，如图所示，检查数据中是否存在异常值是十分必要的。

随后可对异常样本进行进一步调查，并在必要时重复提取和/或分析。如图所示，大鼠肝脏CE中的脂肪酸以占肝脏CE总脂肪酸的百分比表示。这些数据描述了 virgin 或怀孕大鼠在三种不同饮食中的一种饮食下喂养20天后肝脏中CE的脂肪酸组成。

采用双因素Innova进行统计分析，揭示了饮食和妊娠对多种脂肪酸比例的显著影响，以及饮食与妊娠之间的显著交互作用。例如，饮食对妊娠大鼠肝脏胆固醇酯中芥酸含量的影响大于对未妊娠雌性大鼠的影响。若操作正确，该技术每天可完成从开始到结束的20个样本分析。

一旦掌握，样本批量处理可提高通量，使每周处理的样本数量增加一倍。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用固相萃取和气相色谱法分析单个脂类组分的脂肪酸组成。请注意，使用有机溶剂具有极高危险性，在执行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。