单工程的RNA转录物的活细胞实时成像采用比例式双分子信标
2014年8月6日
比例式双分子信标（RBMBs）可用于将图像的单个设计RNA转录活细胞中。在这里，我们描述RBMBs，交货RBMBs到细胞通过微穿孔和的单个RNA转录物中的实时荧光成像的制备和纯化。
该程序的总体目标是对活细胞中的单个 RNA 转录本进行实时成像。这是通过首先杂交两个寡核苷酸来实现的，这两个寡核苷酸被设计成一个发夹形成探针，称为分子信标的比率度量。第二步是通过尺寸排阻色谱法通过分子信标纯化比率度量。
接下来，通过分子信标的比率度量被引入通过微孔表达工程 RNA 靶标的细胞中。最后一步是将细胞观察到适合活细胞显微镜检查的微孔板中。最终，荧光显微镜用于监测单个 RNA 转录本的运动，这些转录本在单细胞内可视化为明亮的荧光点。
该技术的主要优点是它利用了具有明亮光稳定性的合成探针，并且表现出高信噪比，这为任何内源性 RNA 成像提供了可能性 通过将以下试剂混合在试管中，开始通过分子信标或 RBM BS 制备比率度量。20 微升 Rbm B，一个 30 微升 Rbm B，两个 6 微升 10 x 磷酸盐缓冲液， 以及 4 微升不含 DNA 和 RNA 的水。这通常足以进行大约 50 项研究。
将混合物在室温下孵育 30 分钟。同时，准备液相色谱柱以去除任何 UN 杂交的 RBM B 两个寡核苷酸。使用流速为 0.6 mL/min 的注射泵，在柱床体积约为 4 mL的 8 mL 液相色谱柱中使用 75 个制备级超级平台。
在所有液体进入柱床体积之前，用约 50 毫升 1 x 磷酸盐缓冲液洗涤和平衡 SUEx。停止注射泵，将其拆下，让剩余的液体在重力作用下通过色谱柱。接下来，将 RBMB 混合物加载到色谱柱上。
RBMB 样品完全进入柱床后，在柱床顶部缓慢添加另外 250 μL 的 1 x 磷酸盐缓冲液，以确保整个样品完全进入色谱柱。用 1 x 磷酸盐缓冲液将色谱柱填充到边缘。关闭顶部并启动注射泵。
注射器中装满约 50 毫升的 1 XPBS，以每分钟 0.6 毫升的流速运行。通常，由于探针中掺入的染料的颜色，RBMB 样品可以很容易地可视化。一旦 RBMB 接近柱底，以每个微量离心管 2 滴的速度收集流出。
停止采集样本。一旦微量离心管内样品的颜色变得清晰，将含有彩色 RBMB 样品的试管（通常为 5 到 6 个试管）合并，然后加载到离心过滤装置中。将样品在 10， 000 RCF 下离心 20 分钟或直至所需体积。
这个速度和时间通常会产生大约 30 微升的最终体积。在该方案中，人纤维肉瘤细胞系被设计为在三个引物 UTR 中表达具有 RBMB 靶序列的 96 个串联重复的 Q-F-P-R-N-A，对照细胞系被设计为在 T 25 培养瓶中探针递送板细胞前 1 天以 40% 至 50% co fluly 培养物表达野生型 Q-F-P-R-N-A。含有补充 1% pen 链球菌和 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基的细胞，并在第二天在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。
打开 micro por 并设置针对 HT 10 80 细胞优化的 micro portration 参数。用 4 毫升电解缓冲液填充微孔管，并将其放在微量制备站上。解冻纯化的 RBMB 储备样品，并用 1 x 磷酸盐缓冲液稀释数 μL 至终浓度为 12 μmol。
每个微孔需要 1 微升。对于每个微量孔隙反应，将 1 毫升含 FBS 但不含抗生素的培养基移液到微量离心管中。将其放在微孔装置附近。
稍后将用于在微量制备后立即悬浮细胞。不使用抗生素，因为它们会在微量制备后降低细胞活力。前一天铺板的工程化 HT 10 80 细胞现在应达到 60% 至 80% 的汇合度。
取出细胞培养基，用 1 毫升不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞一次，与 1 毫升胰蛋白酶孵育 1 至 2 分钟。加入 1 毫升补充有 10% 胎牛血清（不含抗生素和酚红）的 DMEM 培养基，终止胰蛋白酶，并将细胞转移到两个 1.5 mL 微量离心管中。将微量离心管中的细胞以 200 倍 G 离心 5 分钟。
去除上清液，重悬并混合终体积为 1 mL DPBS 的细胞沉淀。从充分混合的细胞悬液中取出 10 微升以计数细胞，上下移液细胞数次以确保它们充分分散，并将 300， 000 个含有 DPBS 的细胞转移到新的 1.5 毫升微量离心管中。以 200 倍 G 的速度旋转 5 分钟。
去除上清液，小心不要干扰细胞沉淀。将沉淀重悬于 11 微升 Resus 悬浮液中，缓冲并上下移液数次，以确保细胞充分分散。确保不要产生任何气泡。
加入 1 微升稀释的 RBMB，上下吹打数次充分混合。同样，小心不要产生任何气泡。避免在 RBMB 暂停销售中引入任何气泡至关重要，因为气泡会在微作过程中产生火花，并导致 RBMB 输送不良和细胞死亡。
使用微量制备移液器吸出 10 微升 RBMB 细胞混合物，并将移液器插入微量制备管中。按下启动按钮以启动微型公司。当 micro por 的屏幕显示完成时，尖端中不应有可见的气泡。
从工作站中取出移液管，将 10 微升混合物排出到先前制备的微量离心管中，该离心管中含有 1 毫升含 FBS 的培养基，但通过左右摇动管数次来轻轻混合不含抗生素。将细胞以 200 倍 G 离心 5 分钟。在含 FBS 的 1 mL 不含酚红的培养基中洗涤细胞两次，但不使用抗生素，以去除任何未递送到细胞中的 rbm BS。
第二次洗涤后。Resus 将细胞悬浮在 400 μL 含 FBS 的无酚红培养基中，但不使用抗生素。将微量按比例分配的细胞以每孔 200 μL 或所需的共通度接种到先前制备的 poly de 赖氨酸涂层的 8 个腔室盖玻片中。
将带腔室的盖玻片放入细胞培养箱中。显微制备后 30 分钟即可进行成像。要开始此过程，请打开活细胞载物台顶部培养系统并平衡它，直到它达到 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 75% 湿度。
打开显微镜和荧光光源，打开 metamorph 图像采集软件。将浸油涂抹在物镜上。将带有微孔细胞的腔室盖玻片转移到活细胞载物台。
顶级孵化系统。孵育载物台顶部系统，直到温度和二氧化碳水平稳定。在 metamorph 软件中打开 acquire 选项卡。
单击 show live 按钮以查找字段。在白光下调整焦距，然后单击 停止直播 按钮。在 acquire 选项卡下。
单击并打开流采集弹出按钮并设置所需的电影采集参数。使用 SCI 5 CF six 40 R 滤镜采集 150 帧。将图像保存到硬盘驱动器。
此处显示的是 HT 10 80 细胞稳定表达具有 96 个串联重复序列的 RNA，或三个引物 UTR 中 RBMB 结合位点的 4 个串联重复序列的代表性图像。在 mbs 的细胞内递送之后。96 个串联重复序列的存在使单个 RNA 转录本显示为明亮的荧光点。
相比之下，仅包含四个串联重复序列的 RNA 表现为非常暗淡的荧光点，通常只能在背景极低的区域检测到。采集流式图像可以对单个 RNA 转录本进行实时成像。在经历棕色或亚扩散运动的细胞的细胞质和细胞核中可以很容易地看到单个 RNA 转录本。
在极少数情况下，将观察到经过定向转运的 RNA，如下所示。经历定向运输的 RNA 转录本通常沿着直线路径快速移动。在这个蒙太奇中，RNA 转录本的轨迹叠加在时间序列的单个帧上。
定向 RNA 运动与 RNA 沿微管和微丝的转运一致。看完这个视频，你应该对如何通过分子信标来制备和纯化种族度量有了很好的了解。通过分子信标通过微比子将种族度量递送到细胞中，并通过荧光显微镜对单 RNA 转录本进行成像。
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概述
本文介绍了使用比率双分子信标（RBMBs）来成像活细胞中单个工程化RNA转录物的方法。该程序包括杂交寡核苷酸形成发夹探针、纯化RBMBs，并将其递送到细胞中进行实时荧光成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- RBMBs被设计用于可视化RNA转录物。
- 实时成像允许观察RNA动态。
- 该方法增强了对活细胞中RNA行为的理解。
- 荧光显微镜提供高分辨率成像能力。
研究目的
- 开发一种在活细胞中成像单个RNA转录物的方法。
- 改善工程化RNA靶标的递送和可视化。
- 实现RNA运动的实时监测。
使用的方法
- 寡核苷酸的杂交形成RBMBs。
- 通过尺寸排阻色谱法纯化RBMBs。
- 通过微孔递送RBMBs进入细胞。
- 使用荧光显微镜成像RNA转录物。
主要结果
- 成功在活细胞中成像单个RNA转录物。
- 实时可视化RNA运动，以明亮的荧光点显示。
- 证明了RBMBs在细胞环境中的有效性。
- 对工程化RNA在活体系统中的动态提供了见解。
结论
- RBMBs是研究活细胞中RNA动态的强大工具。
- 该方法提供了一种可视化RNA行为的新方法。
- 未来的应用可能包括研究RNA相互作用和功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time imaging of single RNA transcripts enables direct observation of gene expression dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ratiometric bimolecular beacon approach provides quantitative, spatially resolved data on RNA behavior, enhancing predictive confidence in preclinical models. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses by clarifying RNA localization, transport, and stability in living systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing RNA transcript localization and movement in live cells.
- Operational Value: Provides functional validation of engineered RNA targets through direct fluorescence readout.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing RNA stability and subcellular distribution under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete fluorescent spots that serve as quantifiable readouts for RNA expression and localization.
- Reproducibility: Utilizes purified, photostable probes to ensure consistent signal across experiments and time.
- Scalability: Compatible with microporation delivery and standard wide-field fluorescence microscopy for broader application.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling real-time monitoring of RNA dynamics in disease-relevant cellular models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies RNA transport mechanisms (e.g., microtubule-associated movement) to inform target mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing empirical data on RNA behavior in living systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a direct readout of RNA behavior that informs lead identification and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of RNA transcript dynamics in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of RNA expression levels and localization patterns.
- Analytics: Generates time-series imaging data that facilitate quantitative analysis of RNA movement, diffusion, and transport kinetics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing observation of RNA behavior in living cells under near-physiological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple RNA targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in RNA localization, stability, and function.
- Operational Value: Ensures standardization through probe purification and standardized delivery via microporation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of RNA-targeted therapeutic approaches.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization through direct visualization of RNA dynamics in relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide probe design, purification, and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to microporation equipment and compatible cell culture systems.
- Necessitates standardization of probe concentration and delivery parameters across teams.
- Requires adaptation for different RNA targets and cellular backgrounds to avoid overexpression artifacts.
- Limited by the need to engineer RNA transcripts with tandem repeat sequences for effective beacon binding.
