Name: 单工程的RNA转录物的活细胞实时成像采用比例式双分子信标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学习使用比例式双分子信标（RBMB）对活细胞中的单工程RNA转录物进行实时成像。该方法通过荧光显微镜观察RNA动态，为研究RNA在活细胞中的行为提供了强大工具。

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本研究工作得到了美国国家科学基金会职业奖（0953583）以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所/R21-CA116102、国家癌症研究所/R21-CA125088、国家生物医学影像与生物工程研究所/R01-EB012065、国家癌症研究所/R01-CA157766 的资助。

在本实验方案中，一条寡核苷酸（RBMB1）在其5’端用CF640R荧光报告染料进行标记，其序列为：5’-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3’。其中加粗部分为自互补区域，可驱动发夹结构的形成。第二条寡核苷酸（RBMB2）在其3’端用Iowa Black RQ-Sp淬灭剂标记，其序列为：5’-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3’。
1. RBMBs 的制备
<ol>
	<li>短暂离心含有 RBMB1 和 RBMB2 寡核苷酸的离心管，确保干燥的寡核苷酸位于管底，然后用无 DNase 和 RNase 的水重悬，终浓度为 100 μM。例如，10 nmol 的寡核苷酸样品应重悬于 100 μl 水中。</li>
	<li>通过紫外-可见光谱法测定 RBMB1 和 RBMB2 储存液样品的精确浓度。
	<ol>
		<li>在微量离心管中，将 3 μl RBMB 样品与 117 μl DPBS（不含钙和镁）混合。</li>
		<li>以 DPBS 作为空白对照，测定 200–800 nm 范围内的吸光度。注意：应在 260 nm 和 650 nm 处观察到明显的吸收峰。</li>
		<li>根据 260 nm 处（或 RBMB1 在 650 nm 处）的吸光度，使用以下公式计算 RBMB 样品的储存液浓度： 
		储存液浓度 (M) = A260 × 稀释倍数 / 消光系数，其中 A260 为 260 nm 处的吸光度，稀释倍数为 40。 
		注意：RBMB 的消光系数可在寡核苷酸供应商提供的规格表中查得。CF640R 在 650 nm 处的消光系数为 103,000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 20 μl 100 μM RBMB1、30 μl 100 μM RBMB2、6 μl 10x&#160;磷酸盐缓冲液（10x&#160;磷酸盐缓冲液：480 mM K2HPO4、45 mM KH2PO4、140 mM NaH2PO4，pH 7.2）以及 4 μl 无 DNase 和 RNase 的水混合。室温孵育 30 分钟。注意：该混合液体积通常适用于约 50 次实验。</li>
	<li>使用 75 mg 制备级 Superdex 填料制备液相色谱柱，以去除未杂交的 RBMB2 寡核苷酸。采用 8 mL（0.7 × 20 cm）液相色谱柱，装填约 4 ml 床体积，用于纯化少量混合探针。</li>
	<li>使用流速为 0.6 ml/min 的注射泵，以约 50 ml 1x&#160;磷酸盐缓冲液洗涤并平衡 Superdex 柱。在所有液体完全进入床体积之前，停止注射泵，将其断开，让剩余液体依靠重力流过色谱柱。</li>
	<li>将 RBMB 混合液（60 μl）上样至色谱柱。
	<ol>
		<li>待 RBMB 样品完全进入柱床后，缓慢向柱顶加入另外 250 μl 1x&#160;磷酸盐缓冲液，以确保整个样品完全进入柱内。</li>
		<li>用 1x&#160;磷酸盐缓冲液将柱体加至边缘。封闭柱顶，启动注射泵——注射器中应装有约 50 ml 1x&#160;PBS，并以 0.6 ml/min 的流速运行。</li>
		<li>当 RBMB 接近柱底时——由于探针中染料的颜色，RBMB 样品通常可直接肉眼观察——以每管两滴的速度收集流出液至微量离心管（1.5 ml）。当微量离心管中的颜色变为无色时，停止收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合并含有有色 RBMB 样品的离心管——通常为 5–6 管——并将混合液转移至离心过滤装置（截留分子量 10,000）。在 10,000 RCF 条件下离心 20 分钟或直至达到所需体积。注意：此转速和时间通常可获得约 30 μl 的终体积。</li>
	<li>通过紫外-可见光谱法测定纯化后 RBMB 样品的精确浓度。
	<ol>
		<li>取 3 μl 浓缩后的 RBMB 样品，与 117 μl DPBS 在微量离心管中混合。</li>
		<li>以 DPBS 作为空白对照，测定 200–800 nm 范围内的吸光度。注意：应在 260 nm 和 650 nm 处观察到明显的吸收峰。</li>
		<li>根据 650 nm 处的吸光度，使用以下公式计算杂交后 RBMB 的储存液浓度： 
		储存液浓度 (M) = A650 × 稀释倍数 / 消光系数，其中 A650 为 650 nm 处的吸光度，稀释倍数为 40。 
		注意：CF640R 在 650 nm 处的消光系数为 103,000，Iowa Black RQ 的消光系数约为 20,000。消光系数具有加和性，且不受杂交影响。因此，RBMB 储存液在 650 nm 处的总消光系数约为 123,000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在管壁上正确标记样品名称和浓度，并于 -20 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
2. 多聚-D-赖氨酸包被的8孔腔室盖玻片的制备
<ol>
	<li>在无菌环境中，将5 mg聚-D-赖氨酸（冻干粉末，γ射线灭菌）溶解于25 ml无菌水中，配制成0.2 mg/ml的溶液。</li>
	<li>在无菌条件下，向8孔板腔式盖玻片的每孔中加入200 μl 0.2 mg/ml的聚-D-赖氨酸溶液。</li>
	<li>在细胞培养超净台中室温孵育16–18小时。</li>
	<li>吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水洗涤各孔3次。注意：包被好的腔室载玻片可在4 °C保存。</li>
</ol>
3. 探针递送
注意：所使用的细胞体系应包含一个整合的基因构建体，该构建体表达的RNA在3’非翻译区（UTR）中含有至少4个连续的RBMB结合位点。靶序列应与RBMB的环状区域互补。建议使用相同的细胞系构建一个不含串联重复序列的相同基因构建体作为阴性对照。在本实验方案中，采用人纤维肉瘤细胞系HT1080，经基因工程改造后表达在3’-UTR中含有96个RBMB靶序列串联重复的gfp RNA；对照细胞系则经改造后表达野生型gfp RNA。
<ol>
	<li>实验前一天，将细胞以40-50%汇合度接种于T25培养瓶中。使用添加1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>次日，打开微孔电穿孔仪，设置微孔电穿孔参数为950 V、2次脉冲、每次25毫秒。注意：这些参数已针对HT1080细胞优化，但不同细胞类型的参数可能不同，可根据制造商说明书进行调整。</li>
	<li>向微孔电穿孔管中加入4 ml电解缓冲液，并将其放置在微孔电穿孔装置上。</li>
	<li>取出纯化的RBMB储备液并解冻。取数微升用1×&#160;磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为12 μM。每次微孔电穿孔需使用1 μl。</li>
	<li>用移液器将1 ml含FBS但不含抗生素的培养基加入微量离心管中。注意：此培养基用于微孔电穿孔后立即重悬细胞，可暂时放置在微孔电穿孔设备附近。培养基中若含有抗生素会降低微孔电穿孔后的细胞活力。</li>
	<li>移除工程化HT1080细胞（60-80%汇合度）的培养基，用1 ml不含Ca2+和Mg2+的DPBS洗涤细胞一次，然后加入1 ml胰蛋白酶孵育1-2分钟。</li>
	<li>加入1 ml不含抗生素和酚红、但含10%胎牛血清的DMEM培养基以终止消化反应，将细胞转移至两个1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在微量离心管中以200 × g离心5分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬并合并于终体积为1 ml的DPBS中。</li>
	<li>从充分混匀的细胞悬液中取10 μl进行细胞计数。</li>
	<li>反复吹打数次以确保细胞充分分散，将300,000个细胞连同DPBS转移至新的1.5 ml微量离心管中，以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。用11 μl重悬缓冲液重悬沉淀，并反复吹打数次以确保细胞充分分散。务必避免产生气泡。注意：气泡会在微孔电穿孔过程中引发火花，导致RBMB递送效率降低及细胞死亡。</li>
	<li>加入1 μl稀释后的RBMB（12 μM），通过反复吹打充分混匀。再次注意避免产生气泡。</li>
	<li>使用微孔电穿孔移液器吸取10 μl RBMB-细胞混合物，插入微孔电穿孔管中，按下启动按钮开始电穿孔。注意：移液头中不应有可见气泡。</li>
	<li>当微孔电穿孔仪屏幕显示程序完成后，将移液器从装置中取出，将10 μl混合物排入预先准备好的含1 ml含FBS但不含抗生素的培养基的微量离心管中。通过左右轻摇数次轻轻混匀。</li>
	<li>以200 × g离心5分钟，再用1 ml不含酚红但含FBS、不含抗生素的培养基洗涤细胞两次，以去除未进入细胞的RBMB。最后用400 μl不含酚红但含FBS、不含抗生素的培养基重悬细胞。</li>
	<li>将电穿孔处理后的细胞接种至多聚-D-赖氨酸包被的8孔腔室载玻片中，每孔200 μl，或按所需汇合度接种。</li>
	<li>可选步骤：如需对细胞核成像，可加入Hoescht 33342，终浓度为0.01 mg/ml。</li>
	<li>将腔室载玻片放入细胞培养孵箱中，在成像前孵育1-2小时，使细胞有足够时间贴附于载玻片表面。注意：最早可在微孔电穿孔后30分钟开始成像。</li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
	<li>打开活细胞倒置显微镜培养系统，并使其平衡至37 °C、5% CO2 和75%湿度。</li>
	<li>开启显微镜和荧光光源，并启动Metamorph软件。注意：也可使用其他类似的显微镜控制与图像采集软件。</li>
	<li>在物镜上滴加Immersol镜油。</li>
	<li>将带有微穿孔细胞的腔室盖玻片转移至活细胞倒置显微镜培养系统中。孵育该系统，直至温度和CO2水平稳定。</li>
	<li>在Metamorph软件中打开“采集”选项卡，点击“显示实时图像”按钮以定位视野，在白光下调节焦距，然后点击“停止实时图像”按钮。</li>
	<li>在“采集”选项卡下，点击并打开“流式采集”弹出窗口，设置所需的视频采集参数。使用Cy5/CF640R滤光片采集150帧图像，并将图像保存至硬盘。</li>
</ol>

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<li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li>
<li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li>
<li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly%28phenylene+ethynylene%29+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li>
<li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100(2009).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
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Mark Behlke 博士和 Ling Huang 博士受雇于 IDT，该公司提供与本文稿中描述的某些化合物类似的寡核苷酸产品。然而，IDT 并非上市公司，他们个人不持有 IDT 的任何股份或权益。

使用常规宽场显微镜对活细胞中单个工程化RNA转录本进行成像，需要每个RNA转录本均携带明亮且光稳定的荧光信号，同时未结合的荧光探针产生的背景荧光应尽可能低。本方法通过杂交多个（最多96个）基于寡核苷酸的荧光探针，实现明亮的荧光信号。 即 RBMB蛋白结合到每条RNA转录本上。然而，仅需四个结合位点就已足够16集体信号形成一个明亮的荧光点，可在实时条件下进行追踪。&#160; 多种探针的存在还允许更长的成像时间，因为在整体信号丢失之前必须有相当一部分荧光染料发生光漂白。预计该技术将为RNA生物学提供独特的见解，并可用于研究多种RNA行为，包括测量RNA运输对外部刺激的响应、观察靶标RNA独特的亚细胞定位模式、研究RNA的命运与寿命，以及揭示RNA调控机制。此外，还可能用于追踪变化（即 RNA表达的上调和下调）进行定量。尽管该能力尚未得到验证，但我们此前已证明，RNA拷贝数可在长达24小时内被较为准确地定量&#160;在活细胞中22此外，RBMBs 似乎不会影响基因表达水平。&#160; 综合来看，这些结果提供了初步证据，表明在此时间段内基因表达的变化在单细胞水...

RNA转录本的表达与调控是一个复杂且动态的过程，在很大程度上负责控制细胞的行为与命运。&#160; 尽管RNA在决定细胞功能方面的重要性已被认识多年，但由于大多数RNA分析工具缺乏捕捉关键调控事件（如转录爆发、RNA转运和局部RNA加工）所需的空间和时间分辨率，因此在两者之间建立明确联系往往十分困难。这促使了多种技术的发展，使得能够在活细胞中实时可视化单个RNA转录本1。其中最突出的技术之一是利用GFP-MS2融合蛋白来靶向那些被改造后在其3’-非翻译区（3’-UTR）含有多个MS2结合位点串联重复序列的RNA2,3。通过将多个GFP分子聚集到邻近位置，单个RNA转录本可在荧光显微镜下呈现为明亮的荧光斑点。GFP-MS2系统为研究RNA行为提供了前所未有的洞察力，包括对转录爆发的直接可视化与定量测量4,5、对独特亚细胞定位和加工过程的检测6-9，以及RNA运输的实时成像10。然而，尽管GFP-MS2系统具有巨大潜力，未结合的GFP-MS2融合蛋白可能产生较高的背景荧光信号，从而限制了该技术的适用性和动态范围。&#160; 为降低这一背景信号，已发展出多种策略，包括将未结合的GFP-MS2进行亚细胞区室化10、蛋白质片段互补11，以及使用其他RNA结合蛋白和靶标系统12。&#160; 然而，所有这些方法仍然对RNA靶标与GFP-MS2融合蛋白的相对表达量和总表达量敏感。

作为GFP-MS2系统的替代方案，分子信标也被用于检测在3’-非翻译区（3’-UTR）中含有多串联重复互补结合位点的工程化RNA转录本13,14。分子信标是一类可形成发夹结构的寡核苷酸探针，其一端标记有荧光淬灭基团，另一端标记有荧光报告基团。当未与靶RNA结合时，荧光报告基团与淬灭基团保持紧密相邻，从而处于低荧光状态。一旦发生杂交，荧光报告基团与淬灭基团被迫分离，荧光得以恢复。与GFP-MS2系统类似，多个分子信标结合到单个RNA转录本上会形成明亮的荧光斑点，可通过荧光显微镜识别；然而，由于未结合的分子信标处于淬灭构型，其背景荧光预期要低得多。遗憾的是，尽管分子信标的设计中包含了巧妙的激活机制，但目前越来越多的证据表明，当分子信标被引入活细胞后，未杂交状态下的探针并不能始终保持发夹构象。&#160; 因此，它们会产生假阳性信号，显著降低信噪比。为克服这一缺陷，我们近期开发了一种用于在活细胞中成像RNA的新型合成探针——比率型双分子信标（RBMBs；图1A）15,16。RBMBs由两条2’-O-甲基修饰的寡核苷酸链组成，形成一种兼具短发夹RNA（shRNA）和分子信标特征的杂合结构。&#160; 其环状结构及荧光激活机制类似于分子信标，而具有3’-UU突出端的长双链区域则更接近于shRNA的特征。&#160; 这些shRNA特征旨在促进核输出，我们发现这可使探针在细胞内的半衰期延长至&#62;24小时，且几乎无明显降解，并能防止环状结构非特异性地打开。因此，RBMBs相较于传统分子信标具有显著更高的信噪比。

需要注意的是，不能使用DNA寡核苷酸来制备RBMBs，因为基于DNA的探针不具备基于RNA探针相同的核输出能力。在结构上，RBMB环通常设计为15至21个碱基长度，以在RNA杂交时实现特异性和选择性之间的平衡。&#160; 由两个自互补区域形成的短茎通常设计为4个碱基。&#160; 如果选择更长的茎结构，RBMB环与靶RNA之间的杂交速率将显著减慢17,18。相反，当选择较短的茎序列时，其熔解温度通常过低，无法在37 °C下维持茎环结构，从而导致背景信号升高。随着茎长度的缩短，RBMB的特异性也会降低。由于RBMB茎环序列本身也可能影响RBMB的性能，因此必须谨慎选择19。特别是，理想的环序列应具有最少的二级结构，与具有最少二级结构的RNA序列杂交，避开蛋白质结合位点，并避免脱靶结合。RBMB和RNA二级结构的预测可通过如mfold等软件实现20。可使用核苷酸基本局部比对搜索工具（BLAST）识别互补的脱靶位点。&#160; 然而，由于模型预测存在不一致性以及识别蛋白结合位点的困难，所有RBMB的特异性最终都必须通过实验加以验证。

如有需要，可向 RBMB15 中添加一种对杂交状态不敏感的未淬灭参考染料。&#160; 添加参考染料可作为探针递送的标记物，并可用于比率成像，以实现对细胞总荧光更精确的测量。&#160; 参考染料可使测量结果根据细胞间递送差异所导致的背景差异进行校正。&#160; 然而，在对单个 RNA 转录本进行成像时，无需使用参考染料。需注意的是，某些参考染料可能会干扰 RBMB 从细胞核的输出，从而导致细胞核内背景信号略有升高。

如果目标RNA被设计为包含至少四个RBMB结合位点（图1B）16，则合理设计的RBMB可用于在单个活细胞中对单个RNA转录本进行成像。RBMB可通过微穿孔法高效递送至多种类型的细胞中，且对细胞活力几乎没有影响21，并在30分钟内获得基因表达的定量测量结果。&#160; 此外，由于未结合RBMB的荧光能够被有效淬灭，该方法对RBMB浓度和目标RNA水平的敏感性较低。本文提供了RBMB制备与纯化的详细方法描述，以及通过微穿孔法将RBMB递送至活细胞并实时成像单个RNA转录本的一般操作流程。

<table><tbody><tr><td>无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>未经DEPC处理</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>层析柱</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 制备级</td><td>GE healthcare</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml，鲁尔锁头</td></tr><tr><td>离心过滤单元</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>分子量截留值 10,000</td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>冻干粉末，γ射线灭菌</td></tr><tr><td>8孔腔室载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>工作体积 0.2–0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>人纤维肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td>高糖</td></tr><tr><td>不含酚红的DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td>高糖</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Life Technologies</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>显微镜控制软件</td></tr><tr><td>Immersol 油 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化rna转录本进行实时成像

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

人们日益认识到，基因表达在时间和空间上的调控均可能对细胞功能产生重要影响，这推动了多种技术的发展，以实现在单个活细胞中对单个RNA转录本进行可视化观察。最近报道的一种有前景的技术利用了一种基于寡核苷酸的光学探针——比值型双分子信标（ratiometric bimolecular beacon, RBMB），用于检测经基因工程改造、在其3’非翻译区包含至少四个RBMB靶序列串联重复的RNA转录本。RBMB被特别设计为在与互补RNA杂交时发出强烈的荧光信号，而在未结合状态下则保持淬灭状态。该方法采用合成探针，使得可用于成像的有机荧光染料具有光稳定性好、发射波长红移且荧光强度高的特点。当多个RBMB结合到经改造的RNA转录本上后，在宽场荧光显微镜下可观察到离散的荧光斑点。因此，通过连续采集荧光图像的时间序列，即可实时直观地观察单个RNA转录本的运动过程。本文详细描述了RBMB的制备与纯化方法、通过微孔穿孔法将探针递送至细胞以及对单个RNA转录本进行活细胞成像的技术流程。

在存在RBMBs的情况下对HT1080细胞进行微孔电穿孔后，通过宽场荧光显微镜成像，那些在其3’-UTR中被设计包含多个RBMB结合位点的单个RNA转录本会呈现为明亮的荧光点（图2）。尽管在活细胞中仅含有四个RBMB结合位点的单个RNA转录本即可被成像，但3’-UTR中的RBMB结合位点越多，荧光信号越强。此外，每个转录本上结合的RBMB分子越多，在因光漂白导致信号丢失之前，RNA的可视化时间就越长。在本实验方案中，RNA被设计在其3’-UTR中包含96个串联重复的RBMB靶序列。通过连续图像采集，可实现实时成像单个RNA转录本（视频1）。可以清晰地观察到单个RNA转录本在细胞质和细胞核内的运动。虽然大多数荧光点表现为布朗运动或亚扩散运动，但在极少数情况下可观察到RNA发生定向运输（视频2）。这些RNA转录本通常沿直线路径快速移动（图3）；然而，部分RNA也会沿弯曲路径运动或发生方向的突然改变。这些运动与本质为随机、在较短时间尺度内（即 ＜1分钟）总体位移较小的布朗运动形成鲜明对比。R...

比率型双分子信标（RBMBs）可用于在活细胞中对单个工程化RNA转录本进行成像。本文中，我们描述了RBMBs的制备与纯化方法，通过微孔电穿孔将RBMBs递送至细胞，以及实时荧光成像单个RNA转录本的过程。

活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

人们对基因表达在时间和空间上的调控均可能对细胞功能产生重要影响的认识日益加深，已促使……

本实验的总体目标是实时成像活细胞中的单个RNA转录本。首先，将设计好的两个寡核苷酸杂交，形成一种称为比率型分子信标的发夹结构探针。第二步是通过尺寸排阻色谱法纯比率型分子信标。接下来，通过微穿孔技术将分子信标的比例检测指标导入表达工程化RNA靶标的细胞中。最后一步是将细胞接种至适用于活细胞显微成像的微孔板中。最终，利用荧光显微镜监测单个细胞内呈明亮荧光斑点的单个RNA转录本的动态行为。该技术的主要优势在于使用了亮度高、光稳定性好且信噪比较高的合成探针，从而为成像任意内源性RNA提供了可能。开始配制比例度量分子信标（RBM BS）时，需在试管中混合以下试剂：20微升Rbm B1、30微升Rbm B2、6微升10×磷酸盐缓冲液以及4微升无DNA和RNA的水。该混合液通常足以进行约50次实验。将混合物在室温下孵育30分钟。在此期间，准备一根液相色谱柱，用于去除任何未杂交的UN RBM B二核苷酸。使用75根预装级super decks，装入一个8毫升的液相色谱柱中，床体积约为4毫升，采用注射泵以每分钟0.6毫升的流速进行操作。在所有液体进入柱床体积之前，用约50毫升的1×磷酸盐缓冲液洗涤并平衡SUEx。停止注射泵，将其卸下，让剩余液体依靠重力流过层析柱。接着，将RBMB混合物上样到层析柱中。待 RBMB 样本完全进入层析柱后，缓慢向柱床上方加入另外 250 µL 的 1× 磷酸盐缓冲液，以确保整个样本完全进入柱中。用 1× 磷酸盐缓冲液将柱体加至边缘。封闭柱顶，并启动注射泵。注射器中装入约50毫升的1×PBS，以0.6毫升/分钟的流速运行。通常情况下，由于探针中掺入了染料，RBMB样品可被清晰观察到。当RBMB接近层析柱底部时，每两滴收集至一个微量离心管中。停止收集样品。当微量离心管中的样品颜色变为澄清后，将含有有色 RBMB 样品的管子（通常为五到六管）合并，并转移至离心过滤装置中。在 10,000 RCF 条件下离心 20 分钟，或直至达到所需体积。此速度和时间通常会产生约30微升的终体积。在本实验方案中，将人纤维肉瘤细胞系进行基因改造，使其在3'非翻译区（UTR）表达含有96个串联重复RBMB靶序列的Q-F-P-R-N-A；对照细胞系则在探针递送前一天，于T25培养瓶中以40%至50%汇合度培养时，被改造为表达野生型Q-F-P-R-N-A。细胞使用添加了1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下培养至次日。开启微孔仪，并设置适用于 HT1080 细胞的微孔处理参数。将四毫升电泳缓冲液加入微孔处理管中，并将其放置于微孔制备工作站上。解冻一份纯化的 RBMB 储存样品，取数微升用一倍磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为 12 微摩尔。每个微穿孔反应需要一微升。每个微穿孔反应中，用移液器吸取一毫升含FBS但不含抗生素的培养基至微量离心管中，并将其放置在微穿孔装置附近备用。稍后将在显微操作制备后立即用于悬浮细胞。不使用抗生素，因为它们会降低显微操作制备后细胞的存活率。前一天接种的转染HT 10 80细胞现在应达到60%至80%的融合度。吸除细胞培养基，用一毫升不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞一次，加入一毫升胰蛋白酶孵育一至两分钟。加入一毫升含 10% 胎牛血清（不含抗生素和酚红）的 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶反应，并将细胞转移至两支 1.5 毫升微量离心管中。在微量离心机中以 200 × g 离心五分钟，沉淀细胞。吸去上清液，重悬细胞沉淀，并用终体积为1毫升的DPBS合并细胞沉淀。从充分混匀的细胞悬液中取出10微升用于细胞计数，用移液器将细胞反复吹打数次以确保细胞充分分散，然后将300,000个细胞用DPBS转移至新的1.5毫升微量离心管中。在200 × g下离心5分钟。移除上清液时需小心，避免扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于11 µL重悬缓冲液中，并用移液器反复吹打数次，以确保细胞充分分散。注意避免产生气泡。加入一微升稀释后的 RBMB，并通过反复吹打数次充分混匀。再次注意，切勿产生任何气泡。避免将气泡引入 RBMB 悬浮液至关重要，因为气泡会在显微操作过程中引发火花，导致 RBMB 递送效果不佳及细胞死亡。使用微量移液器吸取10微升RBMB细胞混合物，并将移液器插入微制备管中。按下启动按钮以开始微制备过程。当微孔仪屏幕显示完成时，枪头中应无可见气泡。从移液工作站上取下移液器，将10 µL混合物排入先前准备好的微量离心管中，该离心管内含有1 mL添加了FBS但不含抗生素的培养基，通过左右轻轻摇动管子数次使其充分混匀。以200 ×g离心5分钟。用1 mL不含酚红、含有FBS但不含抗生素的培养基洗涤细胞两次，以去除未进入细胞的rbm BS。第二次洗涤后，将细胞重悬于400微升不含抗生素但含FBS的酚红-free培养基中。按每孔200微升或根据所需汇合度，将微量化后的细胞接种至预先制备的多聚赖氨酸包被的八孔腔室盖玻片中。将带小室的盖玻片放入细胞培养孵育箱中。微制备后30分钟即可开始成像。开始此操作前，需打开活细胞载物台顶部孵育系统，并使其平衡至37摄氏度、5%二氧化碳和75%湿度。打开显微镜和荧光光源，启动Metamorph图像采集软件。在物镜上滴加浸油。将带有微孔细胞的腔室盖玻片转移至活细胞载物台。顶部培养系统。将载物台培养系统孵育至温度和二氧化碳水平稳定。在 MetaMorph 软件中打开采集选项卡。单击“显示实时”按钮以找到视野。在白光下调节焦距，然后在“采集”选项卡下点击“停止实时”按钮。单击并打开流式采集弹出按钮，设置所需的视频采集参数。使用SCI five CF six 40 R滤光片采集150帧图像。将图像保存至硬盘。图中显示的是稳定表达含有96个串联重复序列或3'非翻译区（UTR）中四个串联重复的RBMB结合位点RNA的HT 1080细胞的代表性图像。在将mbs导入细胞内后，由于存在96个串联重复序列，单个RNA转录本可呈现为明亮的荧光点。相比之下，仅包含四个串联重复序列的RNA表现为非常微弱的荧光点，通常只能在背景信号极低的区域检测到。连续成像的获取使得单个RNA转录本能够被实时观察。在细胞质和细胞核内，可以清晰地观察到单个RNA转录本进行布朗运动或亚扩散运动。 在极少数情况下，可观察到正在进行定向转运的 RNA，如此处所示。正在进行定向转运的 RNA 转录本通常沿直线快速移动。在此图像拼合图中，RNA 转录本的运动轨迹叠加显示于时间序列的单帧图像之上。定向的RNA移动与RNA沿微管和微丝的运输一致。观看本视频后，您应充分了解如何利用分子信标制备和纯化racial metric。通过显微注射将分子信标介导的racial metric递送至细胞，并利用荧光显微镜对单个RNA转录本进行成像。

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活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

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