重组弹性蛋白样多肽及其融合物与从肽和蛋白质非色谱纯化大肠杆菌

本实验的总体目标是通过反向相变循环法从大肠杆菌中纯化重组弹性蛋白样多肽。首先收集表达重组弹性蛋白样多肽的大肠杆菌细胞裂解液，并通过离心去除不溶性细胞碎片。第二步是通过添加盐或加热诱导弹性蛋白样多肽发生相变，从而去除可溶性杂质。

然后通过离心收集类弹性蛋白多肽包被物，并弃去上清液。此步骤称为热离心。接下来，将重悬的类弹性蛋白多肽溶液再次离心，以去除不溶性污染物。

将上清液中可溶性的类弹性蛋白多肽保留，弃去沉淀。此步骤称为冷离心，重复进行热离心和冷离心循环，直至获得满意的类弹性蛋白多肽纯度。最终，通过反向相变循环可得到纯化的类弹性蛋白多肽产物，可用于多种生物医学应用，并可对其进行表征分析。

通过该技术纯化的类弹性蛋白多肽具有多种有用的应用，包括生物传感、组织工程和药物递送，在这些应用中，类弹性蛋白多肽的相变温度和生物聚合物结构可针对具体用途进行精确调控。首先，按照随附文本方案中所述条件，在大肠杆菌中表达所需的编码ELP的质粒。在37°C培养箱中振荡培养一升菌液24小时后，将菌液转移至一升离心管中，然后在4°C条件下以2000 ×g离心15分钟。

接下来，弃去上清液并重悬沉淀。将沉淀悬浮于 PBS 水或其他所需缓冲液中，总体积为 45 毫升。然后将细胞悬液转移至 50 毫升锥形管中。

将细胞悬液置于冰上冷却，然后以每次超声10秒、间歇20秒的循环模式，总共超声处理9分钟，输出功率为85瓦。第一轮超声处理后，将样品在冰上冷却约10分钟，然后重复进行一次9分钟的超声处理循环。

将裂解液转移至一个50毫升的圆底离心管中。然后每升培养物加入2毫升10%（重量/体积）的聚乙烯吡咯烷酮，混匀后在4°C、16,000 ×g条件下离心10分钟。随后将上清液转移至一个新的洁净50毫升圆底离心管中，弃去沉淀。

向样品中加入结晶氯化钠以诱导ELP相变。待盐溶解后，溶液将变浑浊，表明ELP从溶液中发生相分离。随后在16,000 ×g 条件下离心10分钟，使ELP沉淀成团。

在室温下，ELP沉淀物最初可能呈不透明状，弃去上清液，冷却后加入一至五毫升所需缓冲液。ELP沉淀物可能呈半透明状且颜色为棕色。在4°C下通过移液或旋转试管重悬沉淀物。

接下来，将重悬的ELP溶液以1毫升等分试样加入洁净的1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以16,000 ×g离心10分钟。然后将上清液转移至新的洁净离心管中，并弃去沉淀物。

通过添加氯化钠诱导ELP相变。如果ELP的相变温度较高，仅靠盐无法诱导相变，则将样品置于加热块上孵育15分钟，温度需高于ELP的相变温度。随后，在高于ELP相变步骤所用温度的条件下，以16,000 ×g离心10分钟。

弃去上清液，加入500至750微升所需缓冲液，通过移液或在4°C下旋转试管，重悬ELP沉淀，直至沉淀完全重新溶解。接着，在4°C下以16,000 ×g离心10分钟，使不溶性杂质形成沉淀。然后将上清液转移至洁净试管中，弃去沉淀。重复反向相变循环，直至观察不到杂质沉淀为止。

这通常需要进行两到五个循环。在 PBS 或其他所需的缓冲液中配制 ELP 溶液的系列稀释液。然后使用温度可控的紫外-可见分光光度计，在以每分钟1摄氏度的速率加热样品的同时，测量样品在350纳米处随温度变化的光密度。

如果未观察到光密度增加，则相变温度可能超过上限温度。接下来，在相同的温度范围内，以每分钟1摄氏度的冷却速率测量光密度的下降情况。为验证ELP相变的可逆性，绘制光密度随温度变化的曲线，然后确定该同源聚合物ELP的相变温度。

通过识别该浊度曲线上的拐点，可确认 LPs 的成功纯化，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图所示。与经过一轮反向温度循环后的样品相比，初始大肠杆菌裂解液中的污染物数量明显更多。ELP 的相变温度通过温度程序化浊度法对 ELP 均聚物进行表征。

浊度曲线在给定浓度下表现出光学密度的单一 sharp 增加，由此确定相变温度。通过降温浊度扫描可证实 ELP 相变的可逆性。ELP 共聚物的浊度曲线比均聚物 LPs 更为复杂。

随后可以进行动态光散射测量，以验证从浊度分布文件中推断出的这些类弹性蛋白多肽（LPs）的行为。观看本视频后，您应能充分理解如何利用反向相变循环技术从大肠杆菌中纯化重组类弹性蛋白多肽。不，不，不，不，不。