Name: 重组弹性蛋白样多肽及其融合物与从肽和蛋白质非色谱纯化大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习利用逆相变循环技术从大肠杆菌中纯化重组弹性蛋白样多肽的方法。该技术通过热冷离心循环实现高效分离，适用于药物递送和组织工程等生物医学应用。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）研究三角材料研究中心（MRSEC）（项目编号：DMR-1121107）资助。

1. ELP 表达
<ol>
	<li>取3 ml无菌TB培养基，接种含有目标ELP编码质粒（受T7-lac启动子调控）的DMSO保存菌种或琼脂平板单菌落E. coli。加入相应抗生素，于37 °C、200 rpm持续振荡条件下过夜（O/N）培养。</li>
	<li>将1 ml过夜（O/N）&#160;培养物转接至4-L锥形瓶中含1 L无菌TB培养基的培养液中。加入相应抗生素，于37 °C、200 rpm持续振荡条件下培养24小时。注意：T7-lac启动子存在“渗漏性”基础表达，若培养时间达24小时，已足以实现多数ELP的高水平表达。但也可采用更常规的方法，即当培养物光密度达到0.6时，加入0.2–1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进一步诱导蛋白表达。</li>
	<li>将培养物从4-L锥形瓶转移至1-L离心瓶中，于4 °C、2,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液。注意：若培养体积超过1 L，可通过向菌体沉淀中加入另一升培养物并重复步骤1.3进行浓缩。最多可将2 L培养物浓缩为一个菌体沉淀。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）、水或其他所需缓冲液重悬菌体沉淀，总体积调至45 ml，转移至50&#160;ml离心管中。</li>
</ol>
2. ELP 纯化：初步步骤与第一轮逆相变循环
<ol>
	<li>将重悬的细胞沉淀在冰上进行超声处理，总时长为9分钟，采用10秒“开启”和20秒“关闭”的循环模式，输出功率为85 W。超声过程中保持样品在冰上。短暂冰上冷却后，再重复一次9分钟的超声循环。注意：如果预期ELP的相变温度（Tt）非常低，可将“关闭”间隔延长至最多40秒，以避免溶液温度超过Tt。</li>
	<li>将裂解液转移至50 ml圆底离心管中。</li>
	<li>每升培养物加入2 ml 10%（w/v）聚乙烯亚胺（PEI），并振荡混匀。注意：PEI是一种带正电荷的聚合物，有助于凝聚带负电荷的遗传污染物。如果ELP本身带负电荷，则不要进行此步骤，因为PEI可能也会凝聚并去除ELP产物。</li>
	<li>在4 °C、16,000 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的50&#160;ml圆底离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>可选“热处理”步骤：将样品在60 °C孵育10分钟以变性蛋白污染物，然后转移至4 °C或冰上，直至ELP完全重新溶解。在4 °C、16,000 × g条件下离心10分钟。将上清液转移至洁净的50&#160;ml圆底离心管中，弃去沉淀。注意：如果ELP融合了肽或蛋白，且预期在高温条件下会变性，则不要进行此步骤。这可能导致ELP的相变变为不可逆，或破坏融合部分的活性。</li>
	<li>通过加入结晶NaCl（终浓度不超过3 M）诱导ELP相变。或者，对于具有较高Tt或低产率的ELP，可使用柠檬酸钠（终浓度不超过0.3 M）。注意： 盐完全溶解后，溶液应变得浑浊，表明ELP已从溶液中发生相分离。对于Tt较高且亲水性较强的ELP，在初步诱导相变时，可能需要结合加热和加盐共同作用才能实现相分离。</li>
	<li>在室温（RT）下以16,000 × g离心10分钟（热离心）。注意：应可见ELP沉淀，其大小取决于ELP的表达产量。该ELP沉淀最初可能呈不透明状，但冷却后会变为&#160;半透明，颜色可能呈棕色。随着纯化过程的进行和杂质的去除，ELP沉淀将逐渐变得无色。</li>
	<li>弃去上清液，向沉淀中加入1–5 ml所需缓冲液。通过移液或在4 °C旋转孵育使沉淀重悬。 注意：所需缓冲液体积取决于ELP沉淀的大小，即ELP的表达产量，应加入足够体积的缓冲液以确保ELP沉淀完全重新溶解。富含半胱氨酸的ELP建议在pH 7、含10 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）的水中进行纯化，以消除与污染蛋白之间的二硫键相互作用。高电荷含量的ELP建议在调节至中性pH的缓冲液中纯化，以中和其电荷并减少与污染蛋白的静电相互作用。</li>
	<li>将重悬的ELP溶液按每份1 ml分装至洁净的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C、16,000 × g条件下离心10分钟（冷离心）。&#160;应可见少量不溶性杂质沉淀。&#160;</li>
	<li>将上清液转移至洁净离心管中，弃去沉淀。</li>
</ol>
3. ELP 纯化：反向相变循环的后续轮次
<ol>
	<li>通过加热和/或添加 NaCl 诱导 ELP 相变。可将样品置于高于 Tt 的金属浴或水浴中孵育 15 分钟。然而，如果 ELP 与蛋白质融合（无法使用加热），或 ELP 的 Tt 过高而仅靠加热无法达到，则可逐滴加入 5 M NaCl 溶液以诱导 ELP 相变。注意：溶液应变得浑浊，表明 ELP 从溶液中发生相分离。</li>
	<li>在 16,000 × g 条件下离心 10 分钟（热离心）。如果步骤 3.1 中使用了加热，则此离心步骤应在高于诱导 ELP 相变所需温度的条件下进行。如果步骤 3.1 中仅使用 NaCl，则此离心步骤应在室温下进行。注意：应观察到 ELP 沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入 500–750 μl 所需缓冲液，通过移液或在 4 °C 下旋转试管重新悬浮沉淀。</li>
	<li>在 4 °C、16,000 × g 条件下离心 10 分钟（冷离心）。应观察到少量不溶性杂质沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至洁净试管中，并弃去沉淀。</li>
	<li>重复步骤 3.1 至 3.5，直至步骤 3.4 中不再观察到杂质沉淀。</li>
</ol>
4. 纯化后处理（可选）
<ol>
	<li>如有需要，将样品在适当的缓冲液中透析，以从纯化的ELP溶液中去除过量盐分。注意：需要冻干的ELP应在4 °C下用ddH2O透析过夜。</li>
	<li>如有需要，将ELP溶液在-80 °C冷冻30分钟，随后冻干过夜，以实现长期保存。注意：带有融合蛋白的ELP不应采用冻干法。</li>
	<li>如有需要，可通过去除ELP标签，从肽或蛋白-ELP融合物中回收游离肽或蛋白：
	<ol>
		<li>使用生物素化蛋白酶（按照蛋白酶供应商的建议）或使用与肽或蛋白和ELP之间基因设计的蛋白酶切割位点相对应的蛋白酶-ELP融合物，消化肽或蛋白-ELP融合物。</li>
		<li>如适用，使用链霉亲和素修饰的磁珠去除生物素化蛋白酶（按照蛋白酶供应商的建议）。</li>
		<li>通过逐滴加入5 M NaCl溶液，诱导切割后的ELP和/或蛋白酶-ELP融合物发生相变。</li>
		<li>在室温下以16,000 × g离心10分钟。注意：应观察到ELP沉淀。</li>
		<li>收集上清液并弃去ELP沉淀。将上清液在目标缓冲液中透析，或使用离心滤膜进行缓冲液置换，以去除纯化肽或蛋白溶液中的高盐浓度。</li>
		<li>通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认肽或蛋白与ELP标签的完全切割。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 表征：SDS-PAGE
<ol>
	<li>通过将10 μl溶于水的ELP与10 μl含有2-巯基乙醇的上样缓冲液混合，制备用于SDS-PAGE的ELP样品。注意：通常40 μg的ELP已足以评估ELP产物的大小和纯度。</li>
	<li>将样品在100 °C孵育2分钟，然后与适当分子量的蛋白质ladder一同上样至聚丙烯酰胺凝胶中。</li>
	<li>以180 V电压电泳，直至染料迁移至凝胶底部附近（约45分钟）。</li>
	<li>在摇动条件下，用0.5 M CuCl2溶液染色5分钟。注意： ELP通常无法通过考马斯亮蓝染色观察到，因为某些ELP序列不与该染料发生相互作用。考马斯亮蓝主要与精氨酸残基结合，对其他碱性残基（组氨酸和赖氨酸）以及芳香族残基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）的结合较弱26。因此，只有当ELP或肽/蛋白-ELP融合物的一级序列中含有足够数量的上述特定残基时，才可用考马斯亮蓝进行染色。</li>
	<li>确认ELP条带的分子量与ELP基因预测的理论分子量相符，并确认无额外杂质条带存在。注意：某些ELP的表观分子量可能比预期分子量高出最多20%9,27。</li>
</ol>
6. 表征：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）
<ol>
	<li>配制含有0.1%三氟乙酸的50%水相乙腈溶液，将ELP溶解其中，使ELP浓度约为25 μM。注意：该溶液应无盐，因此ELP在纯化后需用H2O透析。</li>
	<li>配制含有0.1%三氟乙酸的50%水相乙腈饱和芥子酸基质溶液。</li>
	<li>将1 μl ELP溶液加入9 μl基质溶液中，使ELP终浓度约为2.5 pmol/μl。注意：可进一步用基质溶液稀释该混合液，以优化MALDI-TOF信号。</li>
	<li>取1–2 μl ELP-基质混合液点样至金属MALDI靶板上，待其完全干燥。</li>
	<li>使用MALDI-TOF采集5–10张谱图，测定ELP的质荷比（m/z），并推算其测定分子量（MW）。</li>
</ol>
7. 表征：程序控温浊度法与动态光散射
<ol>
	<li>测定 Tt 通过程序控温浊度法测定ELP的相变温度：
	<ol>
		<li>制备一系列稀释液（例如，从5-100 μM浓度范围的ELP溶液中，使用所需缓冲液配制。</li>
		<li>使用控温型紫外-可见分光光度计，在一系列温度下测量350 nm处的光密度（O.D.）例如，20-80 °C）下以1 °C/min的升温速率进行。注意：若未观察到光密度（O.D.）上升，则Tt 可能超过仪器的最高温度限制。表观 Tt 可通过添加 NaCl 降低。从 1 M NaCl 开始，以 0.5 M 为增量逐步提高，直至在可测温度范围内检测到 ELP 相变。</li>
		<li>通过以1 °C/min的冷却速率在相同温度范围内测量光密度（O.D.）的下降，验证ELP相变的可逆性。</li>
		<li>测定 Tt 通过识别浊度曲线（光密度值对温度作图）的拐点来确定同聚物ELP的相变温度。注：该温度可从光密度曲线的导数中便捷确定，导数最大值所对应的温度即定义为Tt更复杂的ELP结构将表现出更复杂的浊度曲线，应按照第7.2节所述进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>具有更复杂热学特性的 ELP 的附加表征（例如通过动态光散射（DLS）表征ELP嵌段共聚物自组装形成的球形胶束：
	<ol>
		<li>在所需缓冲液中配制 ELP 溶液，并将样品通过孔径为 20–450 nm 的滤膜过滤。 
注意：滤膜孔径的选择取决于溶液中 ELP 组装体的存在情况、尺寸及其稳定性。应优先选用尽可能小的滤膜孔径，以去除灰尘等污染物，避免影响动态光散射（DLS）测量的质量。当 ELP 溶液通过较小孔径滤膜时遇到明显阻力，则应使用较大孔径的滤膜。</li>
		<li>测量流体动力学半径（RH) 在浊度曲线中确定的关注区域内对应的温度范围内。注：ELP单体通常具有一个RH&#60;10 nm，纳米颗粒组装体具有 RH~20-100 nm，聚集体具有RH&#62;500 nm。R 每增加一次H 应表现为紫外-可见分光光度法在350 nm处测得的吸光度随温度的变化而增加，该变化与颗粒尺寸成正比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li>
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<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
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<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li>
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</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

ELP 利用其对刺激响应的相变行为，提供了一种低成本且无需层析的纯化方法。该方法利用 ELP 及其与多肽或蛋白质融合后的低临界溶解温度（LCST）行为，在大肠杆菌（E. coli）中表达基因编码的 ELP 后，可有效去除可溶性和不溶性杂质。这种简便的纯化方式可用于制备适用于多种用途的 ELP，也可用于纯化重组多肽或蛋白质，其中 ELP 可作为纯化标签，并在纯化后通过后续处理将其切除。
ELP 纯化过程包括初步步骤：裂解 E. coli，并从粗制培养裂解液中去除基因组物质及不溶性细胞碎片（图1），随后通过逆向温度循环（ITC）去除残留的可溶性和不溶性杂质（图2）。通过加热或加盐诱导 ELP 发生相变后进行离心，使 ELP 与上清液中的可溶性杂质分离，该步骤称为热离心（hot spin）。将 ELP 重新溶解后，再在低于其相变温度（Tt）的条件下进行离心，以去除不溶性杂质沉淀，该步骤称为冷离心（cold spin）。交替进行热离心和冷离心可逐轮提高 ELP 溶液的纯度，但会略微降低回收率。ELP 的纯化得率因 ELP 的 Tt、长度以及融合的肽或蛋白而异。通常情况下，每升 E. coli 培养液可获得约 100 mg 的纯化 ELP，但在某些情况下得率可达 500 mg/L。最终 ELP 产物的纯度通过 SDS-PAGE 进行确认（图3）。纯化后 ELP 的分子量（MW）应与 ELP 基因编码的理论分子量接近。然而，某些 ELP 在 SDS-PAGE 中的表观分子量可能比预期分子量高出最多 20%9,27。更精确的 ELP 分子量分析可通过 MALDI-TOF-MS 实现，该方法结合高效液相色谱（HPLC）等正交分析技术，还可进一步提供 ELP 产物纯度的信息。
纯化完成后，通过程序升温浊度法测定ELP的相变温度（Tt）。该技术在升温过程中监测ELP溶液的光密度（O.D.）。由于Tt具有浓度依赖性，建议对与ELP预期应用相关的浓度系列进行表征。对于ELP均聚物，浊度曲线呈现单一 sharp 升高，对应ELP从单体向微米级聚集体的转变（图4A）。Tt定义为浊度曲线拐点所对应的温度，精确确定为光密度对温度的一阶导数的最大值。当温度降至Tt以下时，光密度恢复至基线水平，表明ELP相变具有可逆性（图4B）。由于ELP凝聚相的沉降以及ELP再溶解过程中的滞后效应差异，升温与降温过程中的浊度曲线在幅度和动力学上会有所不同。肽段或蛋白-ELP融合物也表现出类似的低临界溶解温度（LCST）行为，其中融合的肽段或蛋白会影响ELP的Tt。对于蛋白-ELP融合物，当温度低于蛋白的熔解温度时，相变是可逆的。尽管程序升温浊度法是ELP产物初步热学表征的优良方法，也可采用其他技术（如差示扫描量热法（DSC））测定ELP的Tt。
具有更复杂结构的 ELP 表现出更为复杂的热行为，这些行为也可通过程序控温浊度测定法进行表征。例如，ELP 二嵌段共聚物在达到临界胶束化温度时，会因温度触发而自组装形成球形胶束，并呈现出特征性的浊度曲线。对于此类 ELP 二嵌段共聚物，光密度（O.D.）通常首先较基线升高 0.1–0.5 个单位，表明从单分子链（unimer）向胶束的转变；随后在较高温度下，O.D. 出现急剧上升（较基线最高可达 2.0 个单位），表明形成了微米级聚集体（图 5A）。通过动态光散射（DLS）可进一步获取关于温度触发自组装 ELP 结构的信息，该技术用于测量溶液中 ELP 组装体的流体力学半径（RH）。RH 的变化与浊度法测得的 O.D. 变化高度一致（图 5B）。ELP 单分子链通常表现出 RH&#60;10 nm，而纳米粒子组装体的 RH 约为 20–100 nm，聚集体的 RH&#62;500 nm。关于自组装 ELP 纳米粒子的其他信息，如聚集数和形貌，可通过静态光散射或低温透射电子显微镜技术获得17,23,29。
由于ELP热学性质的可调性，可实现一系列Tts 通过不同的 ELP 设计获得。需要牢记的是，固有的 Tt 将影响每种ELP纯化方案的优化，其中极低或极高的Tts 需要对该标准方案进行最大程度的修改。具有极高相变温度的弹性蛋白样多肽（ELP）可能不适用于本方法进行纯化。如果新型 ELP 或肽段/蛋白-ELP 融合物的设计可能影响 ELP 的热响应特性，可考虑添加简单的组氨酸标签，以便通过固定化金属亲和层析进行替代纯化。此外，若 ELP 序列中的客体残基带有电荷，则可能需要对该方案进行相应调整。可通过调节缓冲液 pH 作为改变 ELP 整体电荷的方法，以期消除&#160;与污染物的静电相互作用17此外，当采取适当措施以确保纯化过程不会影响融合肽或融合蛋白活性时，本方案也适用于ELP与肽段或蛋白质融合的特殊情况。方案中关于此类修改的注释旨在指导纯化过程中可能面临这些挑战的ELP的处理，以确保其功能完整性。t、电荷或融合问题。
利用 ELP 的低临界溶解温度（LCST）行为对其进行纯化，是一种简单且无需层析的纯化方法，适用于大多数在 E. coli 中表达的 ELP 及其肽段或蛋白质融合物。本文总结的方案可在一天内完成 ELP 的纯化，仅需使用大多数生物学实验室常见的设备。我们希望，ELP 及其融合物易于纯化的特点，将促进在材料科学、生物技术和医学领域中不断涌现出更多样化的 ELP 设计。

弹性蛋白样多肽（ELPs）是由重复的五肽单元VPGXG组成的生物聚合物，其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸，称为客体残基。ELPs表现出下临界溶液温度（LCST）相变行为，即当均匀的ELP溶液被加热至其LCST时，会分离成两相，这一温度在ELP文献中通常被称为逆相变温度（Tt）1。这两相分别为ELP含量极低的球状相和富含ELP的沉淀相。富含ELP的沉淀相是在ELP链迅速聚集形成微米级颗粒并进一步融合后短时间内形成的。该相变过程发生在数摄氏度的温度范围内，通常具有可逆性，当温度降至Tt以下时，溶液可恢复为均匀状态。
ELP 通常通过将人工基因连接到表达质粒中，在Escherichia coli（E. coli）内合成。随后将该质粒转化至适合蛋白表达的E. coli菌株中。我们一直采用 T7-lac pET 载体系统在E. coli中表达多种 ELP，尽管其他研究者也已使用酵母2-4、真菌5和植物6-8中的其他表达系统。目前存在多种构建重复序列 ELP 基因的分子生物学方法，包括递归定向连接（RDL）9、质粒重建介导的递归定向连接（PRe-RDL）10以及重叠延伸滚环扩增（OERCA）11。在基因层面设计 ELP 的能力，使得研究人员可利用重组 DNA 技术构建具有多种结构（例如，&#160;单嵌段、双嵌段、三嵌段等）的 ELP，并可进一步融合功能性多肽或蛋白质。在基因水平上的精确控制还可确保每种 ELP 均以其质粒模板所规定的精确长度和组分进行表达，从而获得完全单分散的生物大分子产物。
每种ELP的热学性质取决于其内在的生物聚合物参数，如分子量（MW）和序列，以及外在因素，如其在溶液中的浓度和其他共溶质（如盐类）的存在。ELP的长度12 及其客体残基组成1,13,14 是ELP设计中两个正交参数，可用于调控Tt，其中疏水性客体残基和更长的链长度会导致更低的 Tts，而亲水性客体残基和较短的链长则导致更高的Tts. &#160;ELP 浓度与 T 呈负相关t，其中浓度较高的 ELP 溶液具有较低的 Tts12盐的种类和浓度也会影响ELP的Tt，其中盐的影响遵循霍夫梅斯特序列15. 促水化阴离子（Cl⁻）- 且在霍夫迈斯特序列中位置更高的) 会降低 ELP 的相变温度 Tt 增加盐浓度可增强这一效应。通过调节这些内在和外在参数，可获得特定应用所需的特定温度范围内的热响应行为，从而适用于特定用途的弹性蛋白样多肽（ELP）。
ELP 的刺激响应行为在多种应用中具有重要价值，包括生物传感16,17、组织工程18以及药物递送19,20。此外，当 ELP 在基因水平上与肽或蛋白质融合时，ELP 可作为简单的纯化标签，提供一种无需层析的低成本批量纯化方法，用于重组肽或蛋白质的分离21。通过优化纯化工艺，可确保与 ELP 融合的肽或蛋白质的活性得以保持。对于需要保留 ELP 标签的应用，可直接纯化肽或蛋白质-ELP 融合产物22,23；而若需要获得游离的肽或蛋白质，则可在肽或蛋白质与 ELP 之间插入一个蛋白酶识别位点。随后通过游离蛋白酶或蛋白酶-ELP 融合体进行消化，即可去除 ELP 标签；其中后者更具操作便利性，因为最终可通过一轮 ELP 纯化步骤，将 ELP 标签和蛋白酶-ELP 融合体与目标肽或蛋白质一次性分离24,25。以下方案描述了利用 ELP 及其肽或蛋白质融合体的热响应特性进行纯化的方法，并介绍了表征 ELP 产物热响应行为的基本技术。

<table><tbody><tr><td>pET-24a(+)&lt;br/&gt; pET-25b(+)</td><td>Novagen</td><td>69749-3&lt;br/&gt; 69753-3</td><td>含卡那霉素抗性（pET-24）或氨苄青霉素抗性（pET-25）的 T7-&lt;em&gt;lac&lt;/em&gt; 表达载体。</td></tr><tr><td>Ultra BL21 (DE3) 感受态细胞</td><td>Edge BioSystems</td><td>45363</td><td>用于重组蛋白表达的 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 感受态细胞。</td></tr><tr><td>优异肉汤（TB）干粉培养基</td><td>MO BIO Laboratories</td><td>12105</td><td>培养基用去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 重悬后，经高压灭菌方可使用。</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>IPTG 用去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 溶解，经无菌过滤后加入培养物中以诱导蛋白高效表达。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td>每片 PBS 片剂溶于 1 L 去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 后，可形成 10 mM 磷酸盐缓冲液，含 140 mM NaCl 和 3 mM KCl，25 &amp;deg;C 时 pH 为 7.4。</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）溶液（~50% w/v）</td><td>MP Biomedicals</td><td>195444</td><td>PEI 以去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制成 10%（w/v）溶液。</td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge 高速离心管，50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0050</td><td>此类圆底离心管可耐受 30–50 ml 样品的高速离心。</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td>TCEP-HCl 储存液以去离子 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制为 100 mM，调节 pH 至 7.0。对于富含半胱氨酸的弹性蛋白样多肽（ELP），将该还原剂储存液加入 ELP 沉淀中，使其在 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中终浓度达到 10 mM。</td></tr><tr><td>Ready Gel Tris-HCl 凝胶，4–20% 线性梯度聚丙烯酰胺凝胶，10 孔，30 &amp;mu;l</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-1105</td><td>此类线性梯度凝胶适用于不同分子量 ELP 的良好可视化。</td></tr><tr><td>二水合氯化铜（CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C454-500</td><td>制备过滤后的 0.5 M 溶液，用于 Tris-HCl 聚丙烯酰胺凝胶的负染色。</td></tr><tr><td>Anotop 10 注射器滤器：&lt;br/&gt; 0.02 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 0.1 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 0.2 &amp;mu;m</td><td>Whatman</td><td>6809-1002&lt;br/&gt; 6809-1012&lt;br/&gt; 6809-1022</td><td>此类直径为 10 mm 的注射器滤器可用于制备用于动态光散射（DLS）测量的小体积样品。</td></tr><tr><td>Millex-HV 滤器：&lt;br/&gt; 0.45 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHVX13NK</td><td>此类直径为 13 mm 的注射器滤器可用于制备含大尺寸纳米颗粒聚集体的溶液，以进行动态光散射（DLS）测量。</td></tr></tbody></table>

非色谱法纯化重组弹性蛋白样多肽及其与肽和蛋白质的融合产物，源自大肠杆菌（escherichia coli）

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

弹性蛋白样多肽是一类具有重复序列的生物聚合物，表现出低临界溶解温度相变行为：在特征相变温度以下以可溶性单体形式存在，而在相变温度以上则聚集形成微米级的共聚物相分离液滴。通过基因水平设计弹性蛋白样多肽，可精确调控其氨基酸序列与长度，从而决定其热学特性。弹性蛋白样多肽已被广泛应用于生物传感、组织工程和药物递送等领域，在这些应用中可通过调节ELP的相变温度和聚合物结构以满足特定需求。此外，弹性蛋白样多肽的低临界溶解温度相变行为使其可通过热响应性实现纯化，即利用其选择性的共聚物相分离与再溶解过程，在异源表达后有效去除可溶性及不可溶性杂质。 大肠杆菌该方法可用于弹性蛋白样多肽的纯化，也可作为肽或蛋白融合物的纯化工具，在该技术中，通过基因融合连接至弹性蛋白样多肽标签的重组肽或蛋白无需色谱法即可实现纯化。本方案描述了弹性蛋白样多肽及其肽或蛋白融合物的纯化步骤，并讨论了用于评估纯化后弹性蛋白样多肽产物热行为的基本表征技术。

本文描述了ELP均聚物和ELP二嵌段共聚物纯化与表征的代表性结果。在E. coli中表达24小时后，通过离心收集细胞，并经超声处理裂解。通常，超声处理后颜色会发生轻微变化，表明细胞裂解充分（图1A）。加入PEI后，通过离心收集基因组组分和细胞碎片，从而将不溶性杂质形成的大沉淀与上清液中可溶性ELP分离（图1B）。ELP进一步通过反向相变循环（ITC）进行纯化，该方法利用ELP的低临界溶解温度（LCST）特性，将其与可溶性和不溶性杂质分离（图2）28。ELP的相变可通过加热和/或添加盐来触发。离心后，ELP与部分不溶性杂质在离心管底部形成沉淀（图1C）。此步骤称为“热离心”，弃去上清液中的可溶性杂质，保留ELP沉淀并将其重悬于冷缓冲液中。将重新溶解的ELP在4 °C下再次离心。此步骤称为“冷离心”，弃去不溶性杂质沉淀，保留含有可溶性ELP的上清液。重复交替进行热离心和冷离心循环可提高ELP纯度，但每轮ITC过程中在离心管和移液器吸头上的残留会导致ELP得率略有下降。
ELP 及多肽或蛋白质与 ELP 融合物的纯化是否成功，可通过 SDS-PAGE 确认。在纯化过程的各个阶段取少量样品，可显示 ELP 从 E. coli 裂解液中逐步纯化的效果。ELP 在粗制 E. coli 裂解液中过量表达，经过连续多轮反向温度循环（ITC）后，杂质逐渐减少（图 3）。纯化后的 ELP 在凝胶上呈现为一条接近其理论分子量（MW）的单一条带。
ELP 的相变温度 Tt 通过程序控温浊度法进行表征。ELP 均聚物的浊度曲线在 350 nm 处表现出单一且急剧的吸光度（O.D.）上升（当 ELP 浓度为 25 μM 时，O.D. 值较基线升高约 2.0 个单位）（图 4A）。降温过程中的浊度扫描证实了 ELP 相变的可逆性，当温度降至 Tt 以下时，O.D. 恢复至基线水平（图 4B）。与均聚物 ELP 相比，ELP 二嵌段共聚物表现出更为复杂的浊度曲线特征：O.D. 通常首先升高至较基线高 0.1–0.5 个单位，随后急剧上升至较基线高 2.0 个单位（图 5A）。动态光散射（DLS）测量提供了水力学半径 RH 随温度变化的信息，进一步验证了浊度曲线所获得的结果（图 5B）。
<img alt="超声处理过程示意图；离心过程中显示蛋白质沉淀形成的试管。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. ELP 的初步纯化。 表达 24 小时后，通过离心收集 E. coli 细胞，并重悬于 PBS 中。A) 通过超声处理裂解细胞，此过程伴随颜色的轻微变化，裂解液在超声后颜色变深。B) 加入 PEI 以浓缩 DNA 污染物后，对裂解液进行离心，不溶性杂质形成大量沉淀，而上清液中则含有可溶性 ELP。C) 通过加热和/或添加盐诱导 ELP 相变，离心后形成半透明的 ELP 沉淀。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ITC纯化示意图；ELP共聚集过程及离心步骤；逐步操作方法" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 逆相变循环（Inverse transition cycling）。利用ELP的低临界溶解温度（LCST）特性，可将其与可溶性及不溶性杂质分离，实现纯化。从富含ELP的裂解液开始（1），通过加热和/或添加盐诱导ELP发生相变，随后经离心（热离心）将其分离（2）。保留含有ELP的沉淀（3a），弃去含有可溶性杂质的上清液（3b）。将ELP沉淀重悬于冷缓冲液中（4），并在4 °C下再次离心（冷离心）（5）。弃去含有不溶性杂质的沉淀（6a），保留含有可溶性ELP的上清液（6b）。重复进行热离心与冷离心的交替循环，直至通过SDS-PAGE检测达到所需纯度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示蛋白质分离的SDS-PAGE凝胶，泳道标记为1-10，展示蛋白质纯化过程结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. ELP纯化产物的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE可确认ELP的纯化成功。在超声处理后的粗制大肠杆菌（E. coli）裂解液中可见过表达的ELP（2）。加入PEI并离心后，可溶性ELP主要保留在上清液中（3），尽管部分ELP随不溶性杂质沉淀被弃去（4）。第一次热离心后的上清液仍含有较高水平的可溶性杂质（5）。第一次冷离心后的上清液显示ELP与不溶性杂质实现了良好分离（6）。通过额外的热离心（7）和冷离心（8）循环，可分别去除残留的可溶性和不溶性杂质，直至最终热离心（9）和冷离心（10）后的上清液中无任何额外杂质条带，表明ELP产物纯度达到理想水平。该ELP同聚物的序列为SKGPG-(VGVPG)80-Y，理论分子量为33.37 kDa。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="热变性曲线，光密度与温度、浓度和加热效应的关系图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 通过程序控温浊度法表征 ELP 均聚物。 通过以 1 °C/min 的速率升高温度并监测 350 nm 处的光密度（O.D.），确定 ELP 的相变温度（Tt）。A) ELP 均聚物在给定浓度下表现出单一且急剧的光密度上升，由此定义其 Tt。B) 通过监测 25 μM 溶液在降温过程中 350 nm 处的光密度变化，验证 ELP 相变的可逆性，光密度恢复至基线水平表明该过程可逆。该 ELP 均聚物的序列为 SKGPG-(VGVPG)80-Y。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同浓度下流体动力学半径随温度变化的光密度曲线图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 通过程序控温浊度法和动态光散射表征 ELP 二嵌段共聚物。 能够发生纳米级自组装的弹性蛋白样多肽（ELP），例如可自组装形成球形胶束的 ELP 二嵌段共聚物，其浊度曲线更为复杂。A) 光密度（O.D.）的适度上升表明从单分子状态（unimers）向胶束的转变，随后光密度迅速上升，表明 ELP 已完全聚集为微米级聚集体。B) 动态光散射（DLS）测量通过提供流体动力学半径（RH）随温度变化的信息，验证了在 25 μM 浓度下由浊度曲线推断出的行为。此处，ELP 单分子的 RH 约为 8 nm，胶束的 RH 约为 25 nm。该 ELP 二嵌段共聚物的序列为 GCGWPG-(VGVPG)60-(AGVPGGGVPG)30-PGGS。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

类弹性蛋白多肽是一类对刺激响应的生物聚合物，其应用范围从重组蛋白纯化到药物递送。本方案描述了利用类弹性蛋白多肽及其肽段或蛋白融合物在大肠杆菌（Escherichia coli）中的低温临界溶解温度相变行为，作为色谱法的简单替代方法进行纯化与表征。

非色谱法纯化重组弹性蛋白样多肽及其与肽和蛋白质的融合产物，源自大肠杆菌（Escherichia coli）

弹性蛋白样多肽是一类具有重复序列的生物大分子，表现出低临界溶解温度相变行为，在低温下可溶于水……

本实验的总体目标是通过反向相变循环法从大肠杆菌中纯化重组弹性蛋白样多肽。首先收集表达重组弹性蛋白样多肽的大肠杆菌细胞裂解液，并通过离心去除不溶性细胞碎片。第二步是通过添加盐或加热诱导弹性蛋白样多肽发生相变，从而去除可溶性杂质。然后通过离心收集类弹性蛋白多肽包被物，并弃去上清液。此步骤称为热离心。接下来，将重悬的类弹性蛋白多肽溶液再次离心，以去除不溶性污染物。将上清液中可溶性的类弹性蛋白多肽保留，弃去沉淀。此步骤称为冷离心，重复进行热离心和冷离心循环，直至获得满意的类弹性蛋白多肽纯度。最终，通过反向相变循环可得到高纯度的类弹性蛋白多肽产物，可用于多种生物医学应用的表征与研究。通过该技术纯化的弹性蛋白样多肽具有多种有用的应用，包括生物传感、组织工程和药物递送，在这些应用中可针对特定用途精确调控弹性蛋白样多肽的相变温度和生物聚合物结构。首先，按照随附文本方案中描述的条件，在大肠杆菌（e coli）中表达所需的编码ELP的质粒。在37摄氏度下将一升培养物于摇床中振荡培养24小时后，将培养物转移至一个一升的离心管中，然后在4摄氏度下以2000 ×g离心15分钟。随后，弃去上清液并重悬沉淀。将沉淀悬浮于 PBS 水溶液或其他所需缓冲液中，总体积为 45 毫升。然后将细胞悬液转移至 50 毫升锥形管中。将细胞悬液置于冰上冷却，然后以85瓦的输出功率进行超声处理，总时长为9分钟，超声程序设置为工作10秒、间歇20秒循环进行。第一轮超声处理后，将样品在冰上冷却约10分钟，然后重复进行一次9分钟的超声处理循环。将裂解液转移至一个50毫升的圆底离心管中。然后按每升培养物加入2毫升10%（重量/体积）的聚乙烯吡咯烷酮，混匀后，在4°C下以16,000 ×g离心10分钟。随后将上清液转移至一个新的洁净50毫升圆底离心管中，弃去沉淀。向样品中加入结晶氯化钠以诱导 ELP 转变。待盐完全溶解后，溶液将变得浑浊，表明 ELP 从溶液中发生相分离。随后在 16,000 ×g 条件下离心 10 分钟，使 ELP 沉淀成团。在室温下，ELP沉淀物最初可能呈不透明状，弃去上清液，冷却后加入一至五毫升所需缓冲液。ELP沉淀物可能呈半透明状且颜色为棕色。在4°C下通过移液或旋转试管重悬沉淀物。接下来，将重悬的ELP溶液以每份1毫升分装至洁净的1.5毫升微量离心管中。在4摄氏度条件下，以16,000 ×g离心10分钟。然后将上清液转移至新的洁净离心管中，并弃去沉淀物。通过添加氯化钠诱导ELP相变。如果ELP的相变温度较高，仅靠盐无法诱导相变，则将样品置于加热块上孵育15分钟，温度需高于ELP的相变温度。随后，在高于ELP相变步骤所用温度的条件下，以16,000 ×g离心10分钟。弃去上清液，并通过移液或在 4 °C 下旋转试管，将 ELP 沉淀重悬于 500 至 750 µL 所需缓冲液中，直至沉淀完全重新溶解。接着，在 4 °C 下以 16,000 ×g 离心 10 分钟，使不溶性杂质沉淀。然后将上清液转移至洁净离心管中，弃去沉淀。重复反向相变循环，直至观察不到杂质沉淀为止。这通常需要两到五个循环。在 PBS 或其他所需缓冲液中配制 ELP 溶液的系列稀释液。然后使用温度可控的紫外-可见分光光度计，在以每分钟 1 °C 的速率加热样品的同时，测量样品在 350 纳米处的光密度随温度变化的情况。如果未观察到光密度增加，则相变温度可能超过上限温度。接下来，在相同的温度范围内，以每分钟1°C的冷却速率测量光密度的降低。为了验证ELP相变的可逆性，绘制光密度随温度变化的曲线，然后确定该同源聚合物ELP的相变温度。通过识别该浊度曲线上的拐点，并结合此处所示的SDS-PAGE结果，可确认LPs纯化成功。与经过一轮逆向相变循环后的样品相比，初始大肠杆菌裂解液中的污染物数量要多得多。ELP的相变温度可通过温度程序控制的浊度法对ELP同聚物进行表征。浊度曲线在给定浓度下表现出光密度的单次急剧上升，由此确定相变温度。通过降温浊度扫描可证实ELP相变的可逆性。ELP二嵌段共聚物的浊度曲线比均聚物ELP更为复杂。随后可进行动态光散射测量，以验证从浊度谱图文件中推断出的这些类弹性蛋白多肽的行为。观看本视频后，您应能充分理解如何利用反向相变循环技术从大肠杆菌中纯化重组类弹性蛋白多肽。不，不，不，不，不。

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生物学

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