高产净化恶性疟原虫裂殖子适用于Opsonizing抗体检测

测量抗体功能的关键是了解免疫力恶性疟原虫疟疾。这个方法描述了可行的裂殖子的纯化和调理作用的依赖性吞噬作用通过流式细胞术测量。

该程序的总体目标是高产率生成纯恶性疟原虫，用于定量人类抗体的调理素作用。这是通过首先用 E 64 抑制 S schon 破裂以产生膜封闭的 maite 结构来实现的。在第二步中，收获游离的 maites，然后用 AUM 溴化物染色以进行定量，在最后一步中，将 maites 与各种人血浆样品和 THP one 人单核细胞一起孵育。

最终，可以通过流式细胞术区分不同人血浆样品对浆液的调理素作用。与现有的疟疾 meite 功能性免疫测定相比，该技术的优势在于使用完整的 MES，并且吞噬反应是稳健且可量化的。这种方法可以帮助回答疟疾免疫学领域的关键问题，例如氧化抗体和吞噬作用对疫苗或自然暴露个体对疟疾免疫的重要性是什么？

该技术的可视化至关重要，因为 E 64 的时间对于确保中速的形成至关重要。由于中胚层制备和计数在技术上要求很高，因此在磁分离晚期恶性疟原虫后，滋养体通过将寄生虫薄涂片固定在 100% 甲醇中 10 秒并在吉萨染色 3 分钟来评估寄生虫成熟度。在显微镜下检查染色玻片，以确保寄生虫几乎充满红细胞，并且似乎处于早期禅宗阶段。

如果寄生虫没有达到适当的成熟阶段，请继续孵化它们，直到适当发育。适当成熟后，用 10 微摩尔 E 64 处理分离的 schon，再孵育 6 到 10 小时。与 E 64 孵育后，准备处理过的寄生虫的涂片。

将载玻片固定在 100% 甲醇中，并用 Giza 染色，以确认至少 50% 的寄生虫已形成膜。封闭的基质在室温下以 1900 Gs 的离心力将剩余的 E 64 处理的 schon 沉淀 8 分钟。然后在 50 毫升室温下洗涤寄生虫。

洗涤培养基以去除任何残留的人血清。弃去上清液后，将寄生虫沉淀重悬于 2 毫升洗涤培养基中，然后通过 1.2 微米注射器过滤器过滤细胞悬液，将寄生虫和苍白晶体收集在 10 毫升试管中。接下来，将一个小磁柱连接到磁铁上，并用 500 微升 THP one 培养基平衡它。

将滤液通过磁柱 3 次，每次收集流经的液流中的物质。然后用 2 mL 室温冲洗色谱柱。THP 一个媒体以收集任何剩余的 maites。

去除血红素是净化 maites 的关键步骤。如果 maite 没有与血红素分离，则会形成 maite 血红素簇，导致流式细胞术的 maite 计数不准确。THP 一个细胞吞噬下摆血红素，因此 meite 血红素簇也可以是 ceto。

因此，如果不去除血红素，则被测血浆的调理素潜力也会被高估。在室温下避光，用每毫升 10 微克 ahy 溴化物对收集的玉米物进行染色。30 分钟后，旋转 maites，将上清液丢弃到适当的废液容器中，并在 4 毫升 THP one培养基沉淀 maites 中洗涤 maite 沉淀。

然后复苏，将细胞悬浮在 15 毫升 TP one 培养基中，避光保存。通过流式细胞术定量 maites。以 100 分之一、1 分 50 分和 1 分 25 分的稀释度数浆。

首先，将 940、930 和 910 微升 PBS 加 BSA 分配到三个不同的传真管中，并分别向每个管中加入 10、20 和 40 微升纯化的麦芽。接下来，在室温下涡旋计数微珠 30 秒，然后将 50 微升微珠添加到每个装有稀释微珠的传真管中。在配备 488 纳米激光器的流式细胞仪上运行三个稀释的 maite 样品，基于粥样块状物为 maites 设置严格的门，并且 GFP 双荧光门将微珠设门在单独的通道中并采集事件，直到收集到 2000 个微珠。

为了量化每次稀释时的 maite 数量，平均 3 个 maite 浓度测量值。然后，在 THP one 培养基中以 8 乘以 10 比 6 的比例将 maites 悬浮在 THP one 培养基中，以确保最终比率为每 THP one 细胞 4 个 maites，以测量 maites 的吞噬作用。首先沉淀足够的 THP one 细胞进行测定，然后以每毫升 10 至 5 个细胞的 6.7 倍悬浮在 THP one 培养基中。

接下来，在 150 微升 THP 中，每个孔一个细胞，每个条件一式三份，以 FCS 封闭的 96 孔 U 底板测试，最后达到每孔 10 至第五个细胞浓度。将板放入培养箱中，直到需要添加 maites。然后将 150 微升分离的混合物以 8 倍 10 至 6 毫升/孔浓度加入单独的 FCS 封闭 96 孔 U 底板中，每个条件在一个孔中待测。

向 Maites 的每个孔中加入 10 μL 制备的稀释血浆样品，充分混合以确保溶液均匀。然后将 50 微升 maite 血浆溶液添加到 THP 的每个孔中，对于每个被测血浆样品，一式三份。将样品充分混合，然后在 37 摄氏度的加湿培养箱中用 5% 二氧化碳孵育覆盖的共培养物。

40 分钟后，在预冷的离心机中离心样品以阻止吞噬作用。然后在第二次洗涤后，在冰冷的传真缓冲液中洗涤细胞两次。将细胞固定在 90 微升传真固定剂中，并将它们放在冰上。

采集前避光保护。E 64 处理前寄生虫的成熟阶段对于产生膜封闭的 maites 至关重要。寄生虫应该很大，几乎充满红细胞，并显示斑驳的宝石染色。

在此阶段添加 E 64 将在孵育 6 至 10 小时后产生膜封闭的基质。如果 E 64 更早地添加到滋养体阶段寄生虫，则不会产生膜封闭的寄生体。如果稍后将 E 64 添加到 schon 中，则 schon 破裂不受抑制。

需要高水平的寄生虫同步性。否则，在通过溴化奥姆荧光测量 E 64 治疗吞噬作用后，将看到所描述的所有三种结果的范围，从而能够比单独的 GFP 荧光更好地分辨寄生虫吞噬作用。增加 maites 与 TP one 细胞的比例会导致 maites 对 THP one 细胞的粘附性增加。

在没有 MAITE 特异性抗体的情况下，使用巴布亚新几内亚血浆样品以 4：1 的 MAITE 与 THP 单细胞比率观察到 MAITE 与 THP 的吞噬作用增加，还导致吞噬作用增加，在 0 到 78% 之间。这些数据显示了来自四个代表性巴布亚新几内亚个体的 PHA 酸性反应的四个四分位数的示例。使用该测定法测量的调理抗体已被证明与对疟疾的临床免疫力相关。在尝试该程序时。

确保 PE 细胞增多成功的关键点是具有高度同步的寄生虫以获得完全成熟和完整的 meite，并适当维持 t HB one 细胞培养物。本程序中概述的 meite 纯化技术可适用于任何需要高质量疟疾 maites 的应用，例如海洋区、侵袭、检测、蛋白质组学或血清学。看完这个视频，你应该对如何使用 E 64 方法纯化 maites 和通过测量 THP one 细胞的吞噬作用来研究调理素抗体有一个很好的了解。