Name: 肿瘤细胞球体的高通量图像分析:一个用户友好的软件应用来测量球体的大小自动准确 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解高通量图像分析软件如何自动测量三维肿瘤球体大小。该程序采用主动轮廓算法进行边界检测，集成质量控制流程，显著缩短分析时间并提高准确性，为药物筛选提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢雷蒙德和贝弗利·萨克勒基金会对我们研究工作的支持。

1. 三维肿瘤球体的形成、药物处理及图像采集均按照我们之前发表的论文中所述方法进行15。
2. 软件安装
<ol>
	<li>在用于图像分析的计算机上安装已获得许可的 MATLAB&#160;软件。还需安装以下 MATLAB&#160;工具箱：信号处理工具箱（Signal Processing Toolbox）、图像处理工具箱（Image Processing Toolbox）和并行计算工具箱（Parallel Computing Toolbox）*（*仅在使用并行计算模式时需要）。 
	注意：许多大学会统一购买并维护团体许可证，以便所属科研人员免费下载和使用该软件。</li>
	<li>从 SpheroidSizer.zip 文件中安装 SpheroidSizer 程序（请参见补充文件）：
	<ol>
		<li>将压缩文件保存到本地文件系统中。</li>
		<li>解压 SpheroidSizer 文件。</li>
		<li>将文件保存至指定的目录/文件夹中，该目录在后续步骤中将被称为“安装目录”。 
		注意：SpheroidSizer 已在 Windows 7 操作系统上进行了充分测试。在其他操作系统上应也可运行，仅需少量调整（未经过测试）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 SpheroidSizer 进行图像分析的准备工作
<ol>
	<li>确定成像系统的图像尺度/分辨率（图像的绝对尺度，单位为微米/像素（μm/pix））。 
	注意：如果已知相机芯片上每个像素的尺寸，则图像尺度可计算为 物镜放大倍数 × 像素尺寸（μm/pix）。该值可从显微镜配备的成像软件中作为嵌入式元数据获取，或通过成像系统供应商协助获得。此数值将在步骤 4.6 中使用。</li>
	<li>将所有专有图像文件格式转换为可接受的文件格式——TIFF、JPEG 及其他常见图像文件格式。</li>
	<li>命名图像文件并整理目录结构（图 5A）。 
	注意：该软件依赖于正确的目录结构和文件名布局，以将结果重新格式化为孔板格式：
	<ol>
		<li>按以下格式命名图像文件：[孔板名称]_[行][列].[扩展名] 或 [孔板名称][空格][行][列].[扩展名]。其中 [行] 按字母顺序排列，[列] 按数字顺序排列。&#160; 
		注意：用户可使用免费的自动批量重命名软件来辅助完成此步骤。</li>
		<li>根据实验安排目录/文件夹结构，方式如下：每个实验应有一个独立目录；在每个实验目录下，应设有各个时间点的子目录；在每个时间点子目录下，应包含来自所有孔板的全部图像。 
		注意：为使分析结果在格式化输出中能够最优排序，建议对每个标识符使用相同位数的数字表示，左侧补零，例如，时间点命名为 000H、072H 和 144H。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 利用 SpheroidSizer 进行类球体的图像分析
<ol>
	<li>打开 MATLAB，然后打开“命令窗口”，输入 cd ‘[安装目录]’，并按 [RETURN] 键。</li>
	<li>在“命令窗口”中输入“SpheroidSizer1_0”，然后按 [RETURN] 键以启动 SpheroidSizer 程序。</li>
	<li>在 SpheroidSizer1.0 窗口中点击“浏览”按钮，选择包含所有图像的实验目录。</li>
	<li>在“文件夹”文本框下方选择“包含子文件夹”开关，以处理指定目录下多个嵌套的图像文件夹。 
	注意：如果未选择“包含子文件夹”开关，则仅处理该目录下的直接图像，所有子文件夹将被忽略。</li>
	<li>选择“实时显示”选项，以便在计算执行过程中将每个分割后的图像叠加显示在其原始图像上方，用于质量控制。 
	注意：如果不选择“实时显示”选项，计算速度会更快。</li>
	<li>在输入框中指定被分析图像的“分辨率”（图像尺度/分辨率为 μm/pix），以便程序正确地将类球体的测量值从像素转换为 μm。 
	注意：同一文件夹中或一起分析的所有图像应使用相同显微镜和相同物镜拍摄，以确保每个实验的图像尺度/分辨率保持恒定。</li>
	<li>（可选）用户可按照第 5 步进行高级用户自定义设置。</li>
	<li>点击“计算”按钮以开始计算。 
	注意：程序在开始计算前会自动检查文件名。如果弹出对话框提示“文件名存在错误”，请单击“退出并显示错误列表”，然后修正所列文件名中的错误（参见第 3.3 步）。之后再次点击“计算”按钮重新开始计算。</li>
	<li>点击“暂停”按钮可暂停计算；再次点击该按钮（此时显示为“继续”）可恢复计算。 
	注意：“结果表格”将显示所有已分析类球体的“文件夹”、“文件”、“体积”（单位为 mm3）、“长度”（单位为 μm）、“宽度”（单位为 μm）以及“有效”（复选框）（图 5C）。体积根据测得的长轴（长度）和短轴（宽度）计算得出（V=0.5 × 长度 × 宽度2）。“有效”复选框供用户在质量控制后判断图像分析结果是否有效，参见第 6 步。</li>
</ol>
5. 高级用户自定义设置
<ol>
	<li>在 SpheroidSizer1.0 窗口中点击“Advanced”按钮，打开“Advanced Configurations”窗口，以调整用户自定义设置（图 5B）。</li>
	<li>在“Advanced Configurations”窗口的“Input”部分，于“Format Output”和“List Output”框中输入感兴趣的文件名。</li>
	<li>在“Reduce”框中输入一个介于“2-10”之间的数值。该数值是软件用于在计算过程中缩小图像尺寸的系数，以提高计算速度。数值越大，计算速度越快。默认的“Reduce”值为 10。</li>
	<li>在“Include type”框中输入待处理图像文件的扩展名。</li>
	<li>在“Exclude type”框中输入程序不处理的图像文件扩展名或后缀，例如：“_crude.jpg”。</li>
	<li>选择“None”作为“Special Color”选项，以正确处理 8 位和 16 位彩色图像；选择“12 bit”作为“Special Color”选项，以正确处理 12 位彩色图像。</li>
	<li>如果用于图像分析的计算机配备有多个 CPU 和/或多核 CPU，请勾选“Use Parallel Computing”。若满足条件，则继续执行步骤 5.7.1；否则跳过步骤 5.7.1 和 5.7.2。 
	注意：若所用计算机不支持所选配置，将出现错误。
	<ol>
		<li>在“Advanced Configurations”窗口中勾选“Use Parallel Computing”选项。 
		注意：仅当计算机拥有 4 个或更多核心时，才应使用并行计算模式。</li>
		<li>在“#Workers”（计算核心）框中输入一个介于 4-12 之间的数值。 
		注意：该数值必须等于或小于用户计算机的计算核心数量。MATLAB&#160;并行计算工具箱最多支持 12 个核心。当执行并行计算时，会弹出一个小对话框提示用户等待并行计算完成；在此期间计算无法暂停，且“On-the-fly display”功能在并行计算模式下不会执行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 质量控制
<ol>
	<li>点击“结果表”中的相应单元格，以确认分析图像中类球体的准确边界轮廓。 
	注意：原始图像和质量控制图像将显示在右侧供查看。用户可使用键盘上的向下箭头依次检查所有图像。</li>
	<li>如有需要，使用以下两个工具对所选图像上的类球体边界进行优化：
	<ol>
		<li>点击“手动初始化”按钮以显示原始图像。然后在类球体外侧单击鼠标右键并按住，拖动椭圆工具覆盖原始图像上的类球体。 
		注意：主动轮廓算法将基于用户提交的轮廓启动，并运行以收敛到目标类球体的轮廓。新的结果将自动更新至“结果表”。“手动初始化”工具允许用户为主动轮廓算法手动提供初始轮廓。</li>
		<li>点击“手绘”按钮以显示原始图像。然后使用鼠标或支持触控的屏幕精确绘制类球体的边界。 
		注意：该轮廓将直接用于测量并生成长轴和短轴数据，并在“结果表”中更新。“手绘”工具仅在“手动初始化”工具无法收敛到目标类球体边界时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当检查发现某图像中不包含任何有效类球体时，请取消勾选“结果表”中对应行“有效”列的复选框。此时，质量控制图像的左上角将显示“无效”标签。若“有效”复选框未被勾选，则该类球体在导出的格式化结果文件和输出结果文件中的所有测量值均为空。 
	注意：“结果表”中可使用以下键盘快捷键：“向下箭头”切换至下一张图像；“v”切换有效/无效状态；“m”启用“手动初始化”工具；“h”启用“手绘”工具。</li>
</ol>
7. 保存和导出数据
<ol>
	<li>如果用户需要在完成项目前退出软件，请点击 SpheroidSizer1.0 窗口中的“导出研究”按钮，以导出分析的中间状态。请指定要保存的文件名称和目录。</li>
	<li>点击“导入研究”按钮，可重新载入上一步“导出研究”所保存的中间状态结果，并继续进行操作。 
	注意：中间状态文件采用原生 MATLAB&#160;格式（.mat），无法被其他软件程序直接读取。软件内置了一项安全功能，当程序意外退出时，会自动导出当前打开的项目。如有需要，用户可在[安装目录]中查找以“~tmp”开头并包含相应时间戳的文件。</li>
	<li>在 SpheroidSizer1.0 窗口中点击“格式化结果”以保存结果。 
	注意：实验结果将以两种形式保存在实验目录中。导出的文件名可在高级配置窗口中进行设置（参见方案步骤 5.2）。格式化输出文件为制表符分隔的表格，将每个时间点的体积值按升序排列的孔板编号重新组织为原始孔板格式（图 5D）；所有时间点也按升序排列。列表输出文件为制表符分隔的表格，以有序列表的形式包含所有测量数据（图 5E）。</li>
</ol>

<ol><li>Hamilton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+as+an+in+vitro+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids as an in vitro tumor model.</a> Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).</li>
<li>Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).</li>
<li>Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+nodular+carcinomas+in+rodents+compared+with+multi-cell+spheroids+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%22%5BJournal%5D)">Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture.</a> Growth. 34, 271-282 (1970).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).</li>
<li>Ayers, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+of+preclinical+xenograft+tumors+is+more+accurately+assessed+by+ultrasound+imaging+than+manual+caliper+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrasound+Med%22%5BJournal%5D)">Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements.</a> J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
<li>Monazzam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+fast+and+semi-automated+size+determination+method+%28SASDM%29+for+studying+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Chan, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).</li>
<li>Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variational+B-spline+level-set%3A+a+linear+filtering+approach+for+fast+deformable+model+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution.</a> IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%3A+Active+contour+models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Snakes: Active contour models.</a> International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).</li>
<li>Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroendocrine+tumor+cell+lines+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+neuroendocrine+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本研究介绍了一种快速、灵活、高效且自动化的程序——SpheroidSizer，可用于精确测定三维肿瘤类器官的大小。SpheroidSizer 操作简便，所需用户输入极少。为确保 SpheroidSizer 准确、顺利且成功运行，最关键的步骤包括：类器官应位于成像视野中心，且不接触孔板边缘；所有需作为同一项目一起分析的文件应在同一显微镜下使用相同物镜进行成像；所有待分析文件应按照方案中说明正确命名并排列；以及在计算前输入正确的用户自定义设置。
SpheroidSizer 的优势在于其能够耐受图像中逐渐变化的背景，并利用主动轮廓算法生成与类球体总体球形形状相对应的平滑轮廓。主动轮廓算法的性能在两种情况下可能受到影响：初始化效果不佳，或存在其他局部边缘干扰了目标轮廓的提取。具体而言，在我们测试的案例中，当较大类球体的坏死核心吸引主动轮廓时，有时会出现第二种情况，导致报告的轮廓偏小。值得注意的是，其他基于自动阈值的方法在此类情况下同样表现不佳，除非手动特别设定阈值。因此，该软件致力于提供简便的质量控制功能，以帮助用户检测并纠正分割异常。若因初始化不佳导致分割错误，用户可使用“手动初始化”工具来替代自动初始化。当图像质量过差而无法适用主动轮廓算法时，用户可直接使用“手绘”功能绘制轮廓，并用于后续定量分析。现有的软件（如 CellProfiler）也可通过半自动化方式适配此类应用，但当面对大量成像条件各异的图像，或部分图像需要较多人工干预才能准确测量时，其工作流程可能较为繁琐。SpheroidSizer 提供了一体化的计算与质量控制套件，可有效管理高通量图像分析的工作流程。
SpheroidSizer 目前仅限于每张图像检测一个类球体，并且仅测量类球体的轴向长度。该程序可进一步扩展，以支持研究人员所需的更多定量分析功能，例如对具有坏死核心的类球体进行定量、在单张图像中检测多个类球体，或监测类球体的形态变化。此外，该程序还可修改用于检测和测量来自动物或人体的切除肿瘤的大小，这无疑将对研究人员在开展相关研究时提供帮助 体内 临床前或临床研究。还可对检测到的类球体进行后续处理分析，旨在减少质量控制所需的人工投入，并进一步提高通量。SpheroidSizer 是一种通用的三维肿瘤类球体图像分析应用程序，适用于由任何细胞类型生成的类球体，因此可被广泛的癌症研究领域使用。

三维（3D）肿瘤球状体是“肿瘤细胞形成的具有球对称性的聚集体，类似于组织，无须人工基质即可实现细胞附着”1-3肿瘤球的细胞学和形态学特征更接近于 体内 相较于单层二维（2D）细胞，肿瘤组织具有更为复杂的结构和微环境。三维（3D）肿瘤球已成为一种实用的模型 体外 用于高通量筛选抗癌治疗药物或在临床前评估候选药物疗效的模型 体内 动物或临床试验4在临床上，任何抗癌药物治疗的疗效均依据肿瘤生长的抑制程度进行评估。类似地，类球体体积可作为评估疗效的指标 体外 抗癌药物研究。类球体体积（V = 0.5 * 长度 * 宽度）2根据类球体的主要轴长和次要轴长（通常称作长度和宽度）来确定6,7大多数研究人员不得不手动在每个球状体上绘制其长度和宽度，通常使用显微镜公司随成像仪器配套提供的软件。当进行高通量药物筛选并产生数百张以上图像时，该方法会变得效率低下。一些近期研究报道了使用开源图像分析软件工具包（如CellProfiler）的方法8-10 和 ImageJ11 开发了基本的分割程序/宏，涉及光照校正和简单的阈值处理。这些程序通常需要根据不同批次图像的光照条件和图像对比度变化进行重新调整；因此，这些软件包无法满足高通量图像分析对鲁棒性的要求。Friedrich 及其合作者（2009）使用专有软件对类球体体积进行半自动测量5Monazzam 及其同事论文中所述的方法10 是一种仅适用于少量图像的类器官大小半自动测量方法。因此，目前迫切需要针对三维肿瘤类器官开发出稳健、灵活、自动化且即用型的图像分析工具。
在本研究中，我们介绍了 SpheroidSizer——一款基于 MATLAB 的开源软件应用程序，可自动且准确地测量肿瘤类球体的大小。SpheroidSizer 被设计用于在同一会话中处理大量不同的三维类球体图像批次。该软件采用主动轮廓算法12-14，能够适应图像对比度的变化，有效忽略背景光照的渐变，并准确识别图像中的类球体。此外，SpheroidSizer 还能耐受多种常见伪影，e.g. 来源于样本的碎片。其工作流程设计允许用户在计算过程中或完成后进行质量控制。分析结果可随时进行手动修正。通过利用并行计算工具箱，该软件可协调用户计算机上的多个计算核心同时进行运算，从而进一步提升分析速度。此外，SpheroidSizer 以两种不同格式输出结果，便于与下游分析工具无缝对接。

<table><tbody><tr><td>Axiovert 200M 倒置显微镜</td><td>卡尔蔡司显微镜有限责任公司</td><td></td><td>用于成像的显微镜</td></tr><tr><td>Vostro 1720</td><td>Dell Inc.</td><td></td><td>单核常规笔记本电脑</td></tr><tr><td>HP Z820</td><td>惠普公司</td><td></td><td>多核性能工作站</td></tr><tr><td>MATLAB 和 Simulink R2013a</td><td>Mathworks, Inc, Natick, MA</td><td></td><td>MATLAB 软件</td></tr></tbody></table>

高通量肿瘤球体图像分析：一种用户友好的软件应用程序，可自动、准确地测量球体大小

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

三维（3D）肿瘤球体作为 体外 用于药物发现的模型需要在药物筛选的每个步骤中适应大规模筛选格式，包括大规模图像分析。目前尚无现成可用且免费的图像分析软件能够满足这种大规模格式的需求。大多数现有方法需要手动绘制所成像的三维肿瘤球体的长径和短径，这一过程繁琐且耗时。本研究介绍了一款高通量图像分析软件应用——SpheroidSizer，该软件可自动且准确地测量成像的三维肿瘤球体的长轴与短轴长度，计算每个独立三维肿瘤球体的体积，并以两种不同形式将结果输出至电子表格中，便于后续数据分析处理。该软件的主要优势在于其强大的图像分析功能，专为处理大量图像而设计，提供高通量计算与质量控制工作流程。处理1,000张图像的预计时间约为15分钟&#160;在最低配置的笔记本电脑上，或大约1分钟&#160;在多核性能工作站上运行。该图形用户界面（GUI）还设计用于便捷的质量控制，用户可手动修正计算机的分析结果。本软件所采用的核心方法源自主动轮廓算法（active contour algorithm），又称“Snakes”算法，特别适用于光照不均和背景噪声较大的图像，这类问题在高通量筛选的自动图像处理中尤为常见。配套的“手动初始化”和“手绘”工具赋予SpheroidSizer处理多种类型类球体及不同质量图像的灵活性。该高通量图像分析软件显著降低了人工工作量并加快了分析流程。该软件的应用有助于将三维肿瘤类球体发展为常规检测手段 体外 用于工业界和学术界药物筛选的模型。

SpheroidSizer 旨在实现对大量三维球状体图像的自动检测、轮廓界定和测量，显著减少人工操作并大幅提升处理效率。 图1A 展示了 SpheroidSizer 的工作流程。核心计算步骤包括自动初始化、主动轮廓算法和轮廓量化。在自动计算完成后，质量控制功能结合使用“手动初始化”和“手绘”工具，以挽救任何分割不完美的结果。 图1B 展示了详细的自动化主动轮廓算法。初始化步骤（第0次迭代）利用基本的图像处理步骤，估算类球体的近似大小和位置，并生成具有估计尺寸的球形初始轮廓。该初始轮廓作为主动轮廓算法的输入，随后通过迭代，根据局部图像梯度和形状曲率进行调整。当轮廓趋于稳定（收敛）时，主动轮廓算法结束。 即 此图像共进行了 477 次迭代，或直至执行预设的最大迭代次数。本示例中有意放大初始轮廓，以更好地展示算法效果。实际上，初始轮廓通常非常接近真实边界，算法收敛所需的迭代次数要少得多。随后，算法对检测到的类球体边界进行形态测量。类球体的长轴和短轴通过 MATLAB 图像处理工具箱进行测量（图1C）。长轴定义为轮廓上距离最远的一对点之间的线段，记为长度（L）；短轴定义为垂直于长轴的最长线段，记为宽度（W）。在此情况下，由于类球体接近球形，L 与 W 的数值非常接近。类球体的体积计算公式为 V = 0.5 × L × W。2.
SpheroidSizer 的特点之一是其能够利用主动轮廓算法自动检测类球体的边界，即使在背景不均匀或噪声较多的图像上也能实现（图2B-D）。明场图像的计算处理常常受到背景不均的困扰，这会导致基于自适应阈值的方法产生不理想的分割结果。当使用多孔板时，这一问题尤为明显，因为孔壁可能在图像上产生阴影效应。然而，由于主动轮廓算法对背景中渐变的明暗变化不敏感，因此只要进行适当的初始化，它就能在这些明场图像中准确识别类球体的分割边界。图2展示了几种具有不均匀或噪声背景的图像示例，例如照明不均（图2B）、碎片（图2C）或坏死核心（图2D）。通过自动化的主动轮廓算法，SpheroidSizer 在每幅图下层面板中以红色轮廓准确地勾勒出这些类球体的边界。
SpheroidSizer 的质量控制功能对于高通量工作流程至关重要。“手动初始化”和“手绘”工具是该应用中重要的辅助工具。在数百或数千张图像中，难免会出现自动化算法无法正确识别某些图像中类球体的情况。如图所示 图3A当由于初始化步骤导致类球体检测不当时， 即 图像中起始轮廓的尺寸或位置不当（上图），此时“手动初始化”工具可通过允许用户手动正确定义类球体的位置和大小来解决问题（下图）。该工具将触发活动轮廓算法，以手动定义的轮廓为初始条件，迭代收敛至目标轮廓。对于此类困难图像，例如原始图像中的情况 图3B，类球体位于干扰性强且嘈杂的背景中。在此情况下，SpheroidSizer 无法通过自动方法（上图）或正确初始化后的“手动初始化”工具（中图）准确识别类球体。此时可使用“手绘”工具，如图下图所示，手动绘制类球体的轮廓。程序将依据用户定义的边界测量类球体的长轴与短轴，并计算其体积。所有校正后的结果将立即纳入“结果表”中，并可相应导出。
为了评估 SpheroidSizer 在较大数据集中的性能，我们首先通过分析同一组 288 张图像来比较操作时间：1）使用显微镜厂商提供的软件进行手动测量；2）使用单核普通笔记本电脑运行 SpheroidSizer；3）使用多核并行计算性能工作站运行 SpheroidSizer。手动测量遵循我们在开发该软件之前常用的实验流程：由人工在图像上绘制每个类球体的长度和宽度，并使用厂商软件进行测量（如 图 4A 上层面板中的红线所示）；然后用户手动记录测量数值。SpheroidSizer 则通过自动生成类球体边界（如 图 4A 下层面板中的红色轮廓所示），测量其长轴和短轴长度，并将结果导出至电子表格中，从而处理每张图像。如 表 1 所示，基于对 288 张图像的统计，手动测量每张图像中的一个类球体平均耗时 31.67 秒；而使用单核普通笔记本电脑运行 SpheroidSizer 时，耗时不到 2 秒；在 12 核性能工作站上运行时，耗时不到 1 秒。因此，使用 SpheroidSizer 进行图像分析的速度比手动测量快 18 倍以上。当分析数千张图像时，可显著减少人力投入。接下来，我们比较了手动测量与 SpheroidSizer 对 图 4A 中所示 24 个类球体的测量变异性。两种方法均对这 24 个类球体各测量三次，并计算每个类球体的标准差。如 图 4B 所示，SpheroidSizer 的标准差（绿色线条和圆点）接近于零，仅在质量控制步骤中被校正的三个类球体略有升高，但其标准差仍低于手动测量方法的结果。以上结果表明，SpheroidSizer 在图像分析中具有更高的效率和准确性。
我们利用人源BON-1三维肿瘤球体进行药物筛选，以确定哪些化合物与hsp90抑制剂联用可作为潜在候选药物，用于测试其抗肿瘤效果 在体人源BON-1三维肿瘤球体在琼脂糖包被的96孔板中培养，方法如先前文献所述。15八种不同化合物，每种进行六次连续稀释，并设置培养基和溶剂对照，分别以10 nM和20 nM的hsp90抑制剂处理，重复两次，筛选其单独及联合用药效应。每种化合物或联合化合物的每个浓度均使用两个类球体。共使用四块96孔板，总计384个类球体。所有类球体在0、72、144、168和192小时进行成像，本实验共生成1,920张图像。SpheroidSizer仅用30分钟完成全部1,920张图像的计算分析，另需50分钟进行质量控制与数据导出。SpheroidSizer极大加快了图像分析流程。 图5A 展示了本实验的文件夹结构和文件名安排的截图，作为第3.3步实验方案的示例。 图5B-E 展示了使用 SpheroidSizer 进行图像分析时弹出窗口及结果的截图，作为实验步骤 4、5 和 7 的示例。根据从 SpheroidSizer 导出的格式化结果表格中获取的三维类球体体积数据，我们绘制了图表——显示化合物处理下三维肿瘤类球体的生长情况随处理时间的变化。本实验中两个具有代表性的图表如图所示 图5F 和 5G图5F显示，Hsp90抑制剂与克拉屈滨联合处理（绿色线条）对3D球状体生长的抑制作用强于单独使用Hsp90抑制剂（紫色线条）或克拉屈滨（橙色线条）的处理，提示Hsp90抑制剂与克拉屈滨联合处理可能具有抗肿瘤效应 体内. 图 5G 结果显示，HSP90抑制剂与阿霉素联合处理（绿色线）对三维球状体生长的抑制作用并未强于阿霉素单独处理（橙色线）或HSP90抑制剂单独处理（紫色线），提示HSP90抑制剂与阿霉素的联合处理可能不具有增强的抗肿瘤效应 体内该实验有助于我们更好地筛选化合物以测试其抗肿瘤效果 在体 而SpheroidSizer是快速进行实验数据分析的关键。
<img alt="图像分析方法比较图表；手动分析与SpheroidSizer的时间效率分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51639/51639table1.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表1. 对相同一组288张图像进行分析时，手动测量与SpheroidSizer在图像分析操作时间上的比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51639/51639table1.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>
<img alt="主动轮廓算法流程图；迭代图像分割、计算步骤、数据结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. SpheroidSizer——一种用于测量球形体尺寸的开源软件应用。 A) 应用程序的核心工作流程。B) 主动轮廓算法在不同迭代阶段的示意图。请注意，初始轮廓（第0次迭代）被有意放大，以便展示算法过程。C) SpheroidSizer 对长轴和短轴长度的测量及其体积计算。L —— 长轴：连接轮廓上距离最远的一对点的线段（称为长度）；W —— 短轴：垂直于长轴的最长线段（称为宽度）。
<img alt="细胞球体形成实验，显微镜图像，A-D组，研究肿瘤生长模式。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. SpheroidSizer自动分割的代表性结果，显示其在不同图像条件下的稳健性。 A) 典型的高质量图像。 B) 具有不同亮度和对比度的图像。 C) 含有干扰性碎片的图像。 D) 具有坏死核心的球体图像。每幅图的上层面板为原始图像；下层面板为质量控制图像；红色轮廓为自动计算绘制的球体分割结果。
<img alt="类球体分割过程；自动、手动初始化、手绘；分析步骤示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. “手动初始化”和“手绘”工具示意图。 A) 当自动初始化后类球体分割不准确时，“手动初始化”工具可用于在类球体上绘制一个匹配的椭圆形状以进行初始化。B) 当自动和手动初始化均导致类球体分割不准确时，“手绘”工具可用于精确地手动绘制类球体边界。类球体周围的蓝色线条表示初始化轮廓；红色轮廓为识别出的类球体边界。请注意，A) 中“手动初始化”和 B) 中“手绘”的类球体已特意放大，以便更好地展示这些工具。
<img alt="类球体测量比较：手动测量与 SpheroidSizer 的变异性图分析。

" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. SpheroidSizer 与手动测量在分析同一组 24 张图像时图像分析性能的比较。A) 典型类球体示例，展示手动测量和 SpheroidSizer 如何确定类球体的长度和宽度。上方 24 张图像显示使用手动测量法以红色线条手工绘制的每个类球体的长度/宽度；下方 24 张图像（相同的 24 张图像）显示使用 SpheroidSizer 以红色轮廓由计算机绘制的类球体边界。B) 对每个单独类球体进行三次测量所得长度或宽度的标准差。
<img alt="使用软件配置和3D球状体生长图进行药物筛选数据处理的设置。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. SpheroidSizer在药物筛选中的应用示例——对使用BON-1 3D肿瘤球状体进行药物筛选所采集的球状体图像进行图像分析。 A) 本项目的文件夹结构和文件名截图。B) SpheroidSizer中高级配置窗口的截图。C) 显示结果表格的SpheroidSizer1.0窗口截图。D) 从SpheroidSizer导出的格式化输出文件截图。E) 从SpheroidSizer导出的列表输出文件截图。F) 使用hsp90抑制剂和克拉屈滨处理后3D肿瘤球状体的生长情况。G) 使用hsp90抑制剂和阿霉素处理后3D肿瘤球状体的生长情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51639/51639fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件：SpheroidSizer 软件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51639/SpheroidSizerJOVE.zip" target="_blank">请点击此处下载这些文件。</a>

我们介绍一种高通量图像分析软件，用于测量明场显微镜下成像的三维肿瘤球状体的大小。该软件为快速有效地检测治疗药物对球状体的影响提供了有效手段，对于希望在药物筛选中使用球状体的研究人员具有重要意义。

三维（3D）肿瘤类球体作为体外药物筛选模型的应用日益增多，这要求对其加以改进以适应……

以下实验的总体目标是利用高通量图像分析软件，通过明场显微镜成像测量三维肿瘤类球体的大小。该目标首先通过将所有包含三维肿瘤类球体的图像按照类球体大小分析程序所要求的目录结构和文件名进行整理来实现。第二步，该类球体分析程序基于主动轮廓算法自动计算类球体的边界，并测量其大小。接下来，进行精心设计的质量控制扫描，以确保每幅图像都能获得最佳结果。在对数据进行分析后，可阐明实验处理条件下三维类固醇的生长情况。该计算机程序的主要优势在于，它集成了强大的自动化图像分析算法和质量控制工作流程，可支持高通量的图像分析。该软件可耐受不均匀或带有噪声的图像背景，显著降低了人工操作量，并加快了分析过程。在工业界和学术界将3D肿瘤类固醇作为药物筛选的常规体外模型时，应用该软件具有显著优势。Sphe sizer 需要安装有信号处理和图像处理工具箱的 MATLAB。可选的工具箱为并行处理工具箱。从罗格斯大学服务器下载 OID sizer，并将其解压至一个安装目录，后续步骤中将需要该目录。现在请准备您的图像。首先，确定成像系统的图像分辨率以及图像的绝对尺度（微米/像素）。最终，实验中每幅图像的尺度必须保持一致。务必将任何专有的图像文件格式转换为可接受的文件格式，例如 TIFF 或 jpeg。现在，使用软件所要求的特定文件名和目录结构来保存文件：文件名必须根据培养板、行和列命名；目录结构必须按每次实验单独存放于一个目录中，实验中的每个时间点需设立一个单独的子目录。在每个时间点上，来自每块培养板的所有图像应共用一个子目录。首先打开 MATLAB，在命令窗口中导航至 sphe sizer 的安装目录。然后输入 Sphe sizer one zero，按回车键启动该 OID sizer 程序。现在在新窗口中点击浏览按钮，选择包含实验中所有图像的目录。接着在文件夹文本框下方，选中包含子文件夹的切换选项以进行质量控制。选择实时显示选项。下一步是设定图像的分辨率，此步骤必须完成，以便程序能够正确地将像素转换为毫米。此时，用户可进入高级菜单，在此特殊颜色框中访问更多设置。对于8位或16位图像，请保持为“无”。如果图像是以12位捕获的，则选择12位。在完成所有配置后，单击“compute”开始计算，系统将对整组图像进行计算。计算完成后，软件会实时显示各个分割结果，结果表格中会显示文件夹、文件、体积、长度、宽度以及所有已分析球体的有效切换选项。有效切换选项用于质量控制。当用户点击结果表格中的任意单元格时，原始图像和质量控制图像将显示在右侧以供查看。使用键盘上的向下箭头依次检查所有图像。当发现可疑的类球体边界时，通过在原始图像上点击“手动初始化”来优化边界。拖动椭圆工具，更准确地覆盖类球体。结果表格将相应更新测量值。如果手动初始化未能找到目标甾体的最佳边界，则使用手绘按钮显示原始图像，并勾勒出甾体的边界。如果图像中不包含有效的甾体，则只需取消勾选该图像的有效切换按钮。完成质量控制后，单击格式化结果框以保存结果。导出的文件名可在高级选项窗口中进行配置。列表输出文件为制表符分隔的表格，可包含所有测量数据。输出文件格式为制表符分隔的表格，将体积值按原始孔板格式进行组织，便于直观观察和后续数据分析。Sphe sizer 能够在各种不利的图像条件下，稳健地检测图像中球体的边界。偶尔会出现该 OID 检测不准确的情况，此时可使用手动初始化工具，允许用户手动准确定义该类固醇的位置和大小。在极端情况下，程序可能无法自动或通过手动初始化工具正确地将类固醇从干扰性强且噪声较多的背景中分割出来。在此类情况下，程序允许用户手动绘制类固醇的边界，以生成准确的纵向和体积测量结果。软件的效率通过对手动分析与单核及多核计算机分析同一组 288 张图像的结果进行对比验证。使用类固醇分析工具（steroid sizer）进行图像分析，每张图像的处理速度比手动测量快18倍以上，从而证明了该软件的可重复性。采用两种方法分别对一组24种类固醇样本各分析三次。结果显示，以绿色表示的类固醇分析工具在测量中表现出比手动分析更小的标准差。在一项借助类固醇尺寸测定技术使肿瘤生长观察成为可能的实验中，研究者使用HSP 90抑制剂和克拉屈滨治疗对类固醇进行了测试。结果显示，联合治疗在体内可能具有抗肿瘤作用。本研究提供了一种快速、灵活且高效的方法，可用于准确测定三维肿瘤类固醇的大小。甾体大小分析程序易于使用，且所需用户输入极少。进行此操作时，需注意甾体应成像于视野中央，不得接触器皿边缘。所有图像应在同一物镜下采集，且所有文件应按方案中所示正确命名并排列。

high-throughput-image-analysis-tumor-spheroids-user-friendly-software

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肿瘤细胞球体的高通量图像分析：一个用户友好的软件应用来测量球体的大小自动准确

类球体是一种三维细胞培养模型，与二维细胞培养单层模型相比，能够更准确地模拟细胞的生存环境。在本示例实验方案中，我们将看到科研人员利用结直肠癌细胞系生成类球体，并通过活细胞成像技术追踪类球体的生长过程。...

从细胞系生成球状体：一种三维（3D）细胞培养方法

来源： Huang, Y. et. al., 利用光学相干断层扫描对三维肿瘤类器官进行纵向形态学与生理学监测。J. Vis. Exp.

利用光学相干断层扫描技术对肿瘤类球体进行形态学与生理学监测

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本方案旨在实时评估免疫治疗性重定向T细胞（CAR...

CAR T细胞介导的类球体杀伤实验

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外...

乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。...

一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。...

用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

我们介绍了一种用于培养高可重复性类球体并通过图像采集和蛋白质组学进行表型表征的实验方案。...

功能性三维球状体细胞培养的半自动化表型分析

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

了解高通量图像分析软件如何自动测量三维肿瘤球体大小。该程序采用主动轮廓算法进行边界检测，集成质量控制流程，显著缩短分析时间并提高准确性，为药物筛选提供可靠工具。

高通量肿瘤球体图像分析：一种用户友好的软件应用程序，可自动、准确地测量球体大小

探索更多视频