Name: 从金属支架表面使用的腺病毒载体栓通过水解的交联剂血管基因转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 了解利用水解交联剂从金属支架表面释放腺病毒载体进行血管基因转移的技术。该方法通过在大鼠颈总动脉植入基因洗脱支架，结合生物发光成像评估转基因表达，为血管基因治疗提供新策略。

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作者无须披露相互竞争的财务利益。

1. 释放实验用Cy3标记腺病毒的制备
<ol>
	<li>将 2 × 1012 个 Adempty 颗粒（约 2&#160;× 1011 感染单位）悬浮于 650 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（CBB；pH 9.3）中。</li>
	<li>将 1 小瓶（0.2 mg）胺反应性荧光染料（Cy3(NHS)2）溶于 1 ml CBB 中，终浓度为 0.2 mg/ml。</li>
	<li>向病毒悬液中加入 100 µl 染料溶液，涡旋 5 秒，于 28 °C 振荡孵育 1 小时（100–200 rpm）。</li>
	<li>用 PBS 平衡 20&#160;ml Sepharose 6B 柱，将 750 µl Cy3 标记的 Ad 悬液逐滴加至凝胶床中心。</li>
	<li>待病毒悬液完全渗入树脂后，加入 5 ml PBS，弃去流出液。</li>
	<li>加入 0.5 ml PBS，并用标记的玻璃容器收集流出液。重复此步骤 10 次&#160;，共收集 10 份 0.5 ml 的组分。</li>
	<li>通过分光光度法（260 和 280 nm）检测所收集组分中的病毒 DNA 含量。</li>
	<li>合并在 260 nm 处光密度（OD）总和（F1 至 F10 之和）超过 10% 的组分。注：通常合并并混合 F3、F4、F5 和 F6 组分。</li>
	<li>再次通过分光光度法（260 和 280 nm）检测混合后的合并组分，并通过荧光光度法（550ex/570em nm）分别检测病毒 DNA 含量和 Cy3 标记的衣壳蛋白。注：在同一块检测板上制备并进行荧光检测一条覆盖 10-9–10-13 mol/L 范围的&#160;Cy3(NHS)2 标准曲线。</li>
	<li>计算标记病毒的产量和标记密度。假设 1.19 × 1012 病毒颗粒/ml 对应于 1 cm 光程下的 1 OD 单位29。使用公式：产量 = [(OD260nm/1.19) × 1012 × V / 输入 Ad 量] × 100，其中 OD260nm 为合并制剂在 260 nm 处的光密度，V 为合并制剂的体积（ml），用于计算 Ad 回收率（%）。使用公式：标记密度 = C × 6.02 × 1023 / (OD260nm/1.19) × 1012，其中 C 为合并制剂中 Cy3 的浓度（mol/ml），OD260nm 为合并制剂在 260 nm 处的光密度，用于计算平均 Cy3 标记密度。注：典型的标记病毒回收率&#160;为输入剂量的&#62;70%。每单个病毒颗粒的标记密度为 600–800 个荧光分子。</li>
	<li>将 Cy3 标记的 Adempty 分装为较小体积（通常为每份 5 × 1011 颗粒），适用于单独的释放实验。注：当前方案仅在释放实验中使用 Cy3 标记的 Ad。所有转导研究均使用未标记的载体。</li>
</ol>
2. 金属样品的活化
<ol>
	<li>将不锈钢网片或不锈钢支架依次在异丙醇中（5 分钟 × 2 次）和氯仿中（5 分钟 × 2 次）于 55 °C 条件下振荡清洗（100 rpm），然后去除溶剂。</li>
	<li>将样品在 200 °C 下加热 30 分钟。</li>
	<li>将带有潜伏性巯基的聚烯丙胺双膦酸盐（PABT27,28,30）溶于水（1–2% w/v），在 72 °C 下振荡（100 rpm）溶解，并用 KHCO3 调节 pH 至 4.5–5.0。</li>
	<li>将金属样品置于 PABT 溶液中，在 72 °C 下振荡（100–200 rpm）孵育 2–4 小时。注意：此步骤可暂停，样品在 4 °C 下可稳定保存 3 天。</li>
	<li>用双蒸水（DDW）清洗样品三次。</li>
	<li>将样品在三(2-羧乙基)膦（TCEP；15 mg/ml 溶于 0.1 M 醋酸缓冲液）中于 28 °C 振荡（100–200 rpm）处理 15 分钟。</li>
	<li>在脱气的双蒸水中清洗 5 次&#160;。</li>
	<li>在氩气氛围下，将样品置于含吡啶二硫基团的 2% 聚乙烯亚胺（PEIPDT27,28,30）脱气双蒸水溶液中，在 28 °C 下振荡（100–200 rpm）反应 2 小时。注意：此步骤可暂停，样品在 4 °C 下可稳定保存 2 周。</li>
	<li>用双蒸水清洗样品三次。</li>
	<li>将样品暴露于 10 mg/ml 二硫苏糖醇（DTT）/双蒸水溶液中，以将吡啶二硫基团转化为巯基。</li>
	<li>再次在脱气的双蒸水中清洗 5 次&#160;。</li>
</ol>
3. 腺病毒激活及金属表面固定化
<ol>
	<li>将5 × 10⁶细胞重悬于11 腺相关病毒颗粒eGFP 或 Ad卢克 （约 5 x 1010 感染单位）溶于 487.5–495 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（CBB；pH 9.3）中。注意：释放研究中使用 5 × 1011 Cy3标记的Ad空 颗粒（用CBB将体积调至487.5–495 µl）。</li>
	<li>溶解具有不同水解速率的HC28 （迅速（t1/2 = 5 天），中期（t1/2 = 12 d）且缓慢（t1/2 = 50 d) HC, 即 RHC、IHC 或 SHC； 图&#160;1] 或非水解型交联剂（NHC），即在 CBB 中含有 20 mM 的 sulfo-LC-SPDP。</li>
	<li>立即向病毒悬液中加入 5–12.5 µl 交联剂溶液，总体积为 500 µl（交联剂终浓度为 200–500 µM），涡旋混匀，在 28 °C 下振荡孵育 1 小时（100–200 rpm）。</li>
	<li>平衡20&#160;用脱气的5 mM EDTA/PBS（EPBS）平衡ml Sepharose 6B柱。将500 µl交联剂修饰的Ad悬液逐滴加入树脂床中心。</li>
	<li>加入5 ml脱气的EPBS。弃去洗脱液。</li>
	<li>加入0.5 ml脱气EPBS，并将洗脱液收集至已标记的玻璃容器中。重复此步骤10次，共收集十份0.5 ml的洗脱液组分。</li>
	<li>使用分光光度法在 260 和 280 nm 处测定所收集组分的 OD 值，并将 OD 值转换为病毒滴度（1.19 x 1012/ml 对应于 1 OD29.</li>
	<li>合并含有目标组分的馏分 &#62;洗脱病毒的10%（注：通常为F3-F6组分）。对合并后的悬液重复进行分光光度法滴度测定。</li>
	<li>将病毒悬液转移至含有活化金属样品的样品瓶中（参照步骤2.11）。在28 °C下，于氩气环境中振荡孵育1小时（100–200 rpm）。注意：本步骤获得的Ad锚定金属样品将用于后续第5–7节所述的释放与转导实验。</li>
</ol>
4. 通过 PCR 定量表面相关腺病毒载体
<ol>
	<li>按照第2和第3节所述方法，制备表面固定AdeGFP的网片，分别通过NHC、SHC、IHC和RHC连接（每种类型n=3）。</li>
	<li>使用QIAamp DNA Micro试剂盒提取病毒DNA。将各网片分别放入含有200 µl混合液（含180 µl ATL缓冲液和20 µl蛋白酶K，均来自试剂盒）的1.5 ml塑料管中。向另外含有相同混合液的试管中加入已知数量的AdeGFP颗粒（作为标准曲线的校准标准）。在56 °C下孵育过夜，不振荡。</li>
	<li>加入200 µl AL缓冲液（来自试剂盒），涡旋混匀，再加入200 µl 100%乙醇，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将每根试管中的混合物转移至各自的MinElite离心柱（来自试剂盒）中，在8,000 rpm下离心1分钟。用180 µl新鲜ALT缓冲液冲洗含有网片的试管，将冲洗液加入相应的离心柱中，在8,000 rpm下离心1分钟。弃去流出液。</li>
	<li>向离心柱中加入500 µl AW1缓冲液（来自试剂盒），在8,000 rpm下离心1分钟。弃去流出液。</li>
	<li>向离心柱中加入500 µl AW2缓冲液（来自试剂盒），在8,000 rpm下离心1分钟。</li>
	<li>弃去流出液。</li>
	<li>在14,000 rpm下再离心3分钟，直至离心柱完全干燥。弃去流出液。</li>
	<li>向离心柱中加入50 µl MilliQ级水，在14,000 rpm下离心5分钟。将每个离心柱的50 µl洗脱液分别收集至各自的收集管（来自试剂盒）中。</li>
	<li>通过组合以下组分制备PCR主混合液（每份反应：12.5 µl Power Sybr Green PCR主混合液，0.63 µl 10 µM eGFP正向引物[5’- ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3’]，0.63 µl 10 µM eGFP反向引物[5’- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3’]，6.3 µl MilliQ级水）。将上述体积乘以计划进行的反应数（包括“无DNA”对照）。</li>
	<li>将5 µl AdeGFP DNA（来自步骤4.8）和20 µl PCR主混合液加入MicroAmp光学96孔反应板的三个重复孔中。用MicroAmp光学粘性封膜密封反应板，在1,000 rpm下离心1分钟以去除气泡。</li>
	<li>将反应板放入7500实时荧光定量PCR仪的样品槽中。在7500系统SDS软件（v1.4或更高版本）主菜单中选择“创建新实验”，点击“下一步”。在“新建实验向导”界面中，从下拉菜单中选择Sybr Green，点击“添加”，再点击“下一步”以生成反应板布局。选中所有待分析的孔，选择Sybr Green。依次选中“无DNA”对照孔、AdeGFP DNA标准品孔和未知样品孔，并使用下拉菜单中的相应标识进行标记。</li>
	<li>切换到仪器选项卡。选择“添加解离阶段”，将孔体积从默认的50 µl更改为25 µl。点击“开始”。</li>
	<li>检查质控摘要中是否存在异常值或其他异常情况后，分析PCR结果。</li>
</ol>
5. 可水解交联剂连接的载体颗粒从模型钢网中的释放动力学
<ol>
	<li>将通过RHC、IHC、SHC和NHC方法（按3.9步骤）用Cy3标记的Ad衍生化的网片样品在1% BSA/PBS中洗涤（1小时×3次），同时振荡（100-200 rpm）。</li>
	<li>使用无菌精细镊子将网片分别放入已预先加入200 µl洗脱缓冲液（0.1% BSA/0.1% Tween-20/PBS）的96孔板的各个孔中。</li>
	<li>对每片网片的中央区域拍摄荧光图像，并记录显微镜和CCD相机用于图像采集的参数设置。</li>
	<li>以最大信号衰减模式在荧光酶标仪上对板进行荧光检测（550ex/570em），采用孔扫描模式。以未衍生化的网片所在的孔作为空白对照。</li>
	<li>将96孔板在37 °C下振荡孵育（50 rpm）。</li>
	<li>在预定时间点（1-30天范围内），吸除洗脱缓冲液而不扰动网片，加入200 µl新鲜洗脱缓冲液。更换缓冲液后，重复步骤4.3-4.5。</li>
</ol>
6. 利用网格固定化腺病毒载体转导培养细胞
<ol>
	<li>用无菌 PBS 洗涤 AdeGFP- 或 AdLuc-修饰的膜片，每次 5 分钟，共洗涤三次，期间轻轻振荡（100 rpm）。</li>
	<li>使用无菌精细镊子逐个取出膜片，并分别放入含有处于对数生长期的目标细胞类型的 96 孔板的孔中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 24 小时。</li>
	<li>采用相应的非终末终点检测方法（荧光显微镜、eGFP 的荧光测定法或荧光素酶的生物发光成像）来确定各孔中基因表达的程度和空间分布。</li>
	<li>若预期 eGFP 表达水平较低，可选择将培养基替换为 PBS，以提高荧光测定法（485/535 nm）的灵敏度。注意：若荧光计具备微孔扫描功能，应以微孔扫描模式读取数据，以评估各孔中 eGFP 表达细胞的空间分布。完成荧光测定后，将 PBS 换回培养基。</li>
	<li>使用 FITC 滤光片组对 AdeGFP-释放膜片周围的转导细胞（包括膜片下方及周围区域）进行成像，选取 40–200 倍放大倍数拍摄代表性图像。记录荧光显微镜和 CCD 相机用于图像采集时的精确参数设置。</li>
	<li>向含有 AdLuc-释放膜片的孔中直接加入 5 µl PBS 配制的荧光素原液（10 mg/ml），使终浓度达到 500 µg/ml，在生物发光成像前于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。成像后吸除培养基，并更换为不含荧光素的培养基。</li>
	<li>在预定时间点（最长至 2 周）重复终点检测，以研究载体介导基因转导后报告基因表达的动力学过程。</li>
</ol>
7. 延迟时间点保存转导能力的验证
<ol>
	<li>使用 RHC、IHC、SHC 和 NHC 方法制备经 AdeGFP 修饰的网片用于载体固定（参照步骤 2.1–2.11 和 3.1–3.9），并将各网片分别放入含有 60–80% 汇合度的牛主动脉内皮细胞（BAEC）的 96 孔板孔中。</li>
	<li>在放置网片后第 1 天和第 2 天，通过荧光显微镜和荧光测定法分析 BAEC 对固定于网片上的 AdeGFP 的转导情况（参照步骤 6.4–6.5）。</li>
	<li>转导开始后 48 小时，用 PBS 洗涤含网片的孔两次。</li>
	<li>向每孔加入 200 µl 含 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 的溶液，在 37 °C 振荡（100 rpm）孵育 15 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>使用荧光显微镜和荧光测定法确认与网片相关的所有 eGFP 阳性细胞已被完全去除。</li>
	<li>将新传代的 BAEC 以 60–80% 的初始接种密度（每孔 2–2.7 × 104 个细胞）接种至含有部分释放网片的孔中。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育预定时间（1–10 天），随后通过荧光显微镜和荧光测定法评估“新”转导事件。</li>
</ol>
8. 大鼠颈动脉支架成形术模型中载药支架的植入
<ol>
	<li>本方案中描述的所有动物操作均符合联邦关于实验动物使用的法规，并已获得费城儿童医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。&#160;为维持无菌手术条件，所有器械均经高压灭菌。为确保器械在连续用于最多五只动物之间的持续无菌状态，使用玻璃珠灭菌器进行间歇灭菌。</li>
	<li>按照步骤2.1–2.11和3.1–3.9制备AdLuc洗脱支架。将病毒修饰的支架置于无菌PBS中，4 °C保存，使用前存放时间不得超过24小时。</li>
	<li>通过腹腔注射给予雄性Sprague-Dawley大鼠（400–450 g）氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）进行麻醉。通过足部夹捏反应和肌肉张力判断麻醉深度。涂抹眼科兽用软膏以防止角膜和巩膜干燥。注意：&#160;可采用吸入麻醉（诱导使用4%，维持使用2%异氟烷，流速1 L/min），但该方法会妨碍对动物颈部区域的操作，因此不推荐经验不足的操作者使用。</li>
	<li>通过脚趾夹捏再次评估麻醉深度。&#160;剃除颈部及上胸部毛发，并进行无菌准备。给予抗生素（头孢唑啉；20 mg/kg；肌内注射）、镇痛药（美洛昔康；0.5 mg/kg；皮下注射）和生理盐水（10 ml/kg；皮下注射）。通过尾静脉插入24 G导管，并静脉注射肝素（200 IU/kg）。注意：可使用恩诺沙星（Baytril；10 mg/kg，肌内注射）替代头孢唑啉。避免使用对革兰氏阳性菌无显著活性的抗生素。可使用卡洛芬（Rimadyl；10–15 mg/kg）替代美洛昔康作为预先镇痛药。应避免使用具有呼吸抑制作用的阿片类镇痛药（例如，吗啡、布托啡诺）。</li>
	<li>沿中线切开皮肤和颈部筋膜。采用钝性分离技术游离左侧颈外动脉。在可及的最远端结扎颈外动脉。在颈内动脉起始处放置可滑动的临时结扎线。</li>
	<li>在左侧颈外动脉上做一2 mm的动脉切口。</li>
	<li>通过颈外动脉切口将2F Fogarty导管插入颈总动脉。用生理盐水充盈导管头端，并从主动脉弓向颈动脉分叉处推送3次&#160;，以剥脱血管内皮。</li>
	<li>将一段套管（外径1.04 mm，内径0.99 mm）套在Fogarty导管上并送入颈总动脉。撤出Fogarty导管。</li>
	<li>将AdLuc修饰的支架安装在直径为1.5 mm的血管成形术导管球囊上并压握固定。将支架经聚四氟乙烯套管送入颈总动脉中段。避免支架与套管或血管壁发生摩擦。</li>
	<li>在12 atm压力下释放支架，持续30秒，随后撤出血管成形术导管。</li>
	<li>在动脉切口近端结扎颈外动脉，并松开颈内动脉上的临时结扎线。</li>
	<li>使用连续缝合的4.0 Vicryl缝线逐层关闭手术切口，并用皮肤钉闭合皮肤。</li>
	<li>将动物置于加热垫上直至恢复自主活动，然后放回独立笼具中。&#160;术后动物通常在手术后前12小时内无明显疼痛或不适表现&#160;，但可考虑将美洛昔康&#160;治疗（0.5 mg/kg，皮下注射，每日一次）延长至72小时。</li>
</ol>
9. 动脉基因表达的生物发光成像
<ol>
	<li>在颈总动脉植入基因洗脱支架后的预定时间点（1天至3周范围内），使用异氟烷吸入麻醉（氧气中含2-4%异氟烷）麻醉大鼠。</li>
	<li>拆除外科缝合钉，无菌处理手术部位并重新打开手术切口。通过钝性分离，重新暴露左侧颈总动脉，并将其与迷走神经及周围结缔组织分离。</li>
	<li>配制含50 mg/ml荧光素的PBS溶液与含25% Pluronic F-127的PBS溶液的混合液（体积比1:4），并将混合液置于冰上保存。注意：该制剂在4 °C时呈黏稠溶液，一旦接触37 °C组织即迅速转变为凝胶状态。</li>
	<li>将200 µl预冷的荧光素/Pluronic混合液直接涂抹于暴露的颈总动脉节段，并确认凝胶已固化。</li>
	<li>将动物仰卧位置于IVIS-Spectrum成像仪的成像室中，并通过面罩持续维持异氟烷麻醉。</li>
	<li>在采集控制面板窗口（Living Image软件，版本4.2或更高）中，分别从名为“视场”和“binning”的下拉菜单中选择位置“B”（相机与物体距离6.6 cm）和binning因子“medium”。在“动物高度”框中输入“2.5 cm”。在“曝光时间”框中选择时间单位为“min”，并输入数值“2”。</li>
	<li>在荧光素/Pluronic凝胶涂抹后3分钟，点击屏幕上的“Acquire”按钮开始图像采集。注意：图像采集时间可根据预期信号强度在1至6分钟之间调整。</li>
	<li>图像采集完成后，用生理盐水冲洗去除凝胶，并用无菌纱布和棉签轻轻擦拭动脉周围区域。</li>
	<li>使用Vicryl缝线缝合切口，并用缝合钉闭合皮肤。</li>
	<li>将动物复苏后放回笼中。在后续时间点重复成像，以研究支架固定Ad载体所诱导的动脉基因表达随时间的变化过程。</li>
	<li>或者，可在全身给予荧光素后进行成像。按照步骤9.1–9.2进行麻醉和术前准备。使用24 G导管对尾静脉进行插管，并用外科胶带固定导管。</li>
	<li>配制PBS中的荧光素溶液（50 mg/ml），并在10秒内通过导管注射1 ml该溶液。注射后1分钟，按照步骤9.7–9.8开始图像采集。注意：&#160;注射速度过快（&#60;10秒）可能引发癫痫样活动及呼吸骤停。&#160;若在成像过程中出现癫痫或呼吸骤停，必须对动物实施安乐死。</li>
	<li>执行步骤9.10。</li>
</ol>

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</ol>

本论文中所述的方案开发与研究工作部分得到了美国心脏协会科学家发展基金（I.F. 0735110N 和 M.C. 10SDG4020003）、美国国家心肺血液研究所基金 HL 72108（R.J.L.）以及美国国家心肺血液研究所 T32 007915（S.P.F.）的支持。血管成形术导管由 NuMED 公司（纽约州霍普金顿）慷慨捐赠。作者谨此感谢 Susan Kerns 女士提供的秘书协助。

本方案描述了一种通过腺病毒载体可逆性地结合无涂层不锈钢表面，实现基质介导基因递送的操作方法。该技术虽最初为支架介导的血管再狭窄基因治疗而开发，但在生物材料、生物医学植入物及基因治疗等领域具有更广泛的应用前景。
尽管已发表的研究仅使用不锈钢作为典型的金属基底，但PABT对其他金属合金（如钴/铬和镍钛诺）也具有相当的结合亲和力（未发表）。PABT与金属的非特异性相互作用显著拓展了该技术在生物医学领域的潜在应用范围31。此外，尽管需要通过其他方法在材料表面引入巯基，但使用HC连接的基因载体在其他类型的生物材料上也是可行的。
尽管腺病毒基因载体在多种人体细胞类型和组织中能够实现高效的转导，但其临床应用受到腺病毒科（Adenoviridae）所引发的强烈炎症和免疫反应的限制4。为此，近期研究显示（尚未发表），采用HC修饰的表达荧光素酶的腺相关病毒载体所制备的基因洗脱支架，可实现长达4个月的动脉内基因表达。
该方法具有较强...

基因治疗作为一种治疗手段，其有效性受到基因治疗载体靶向能力差的限制1,2。缺乏适当的靶向性会导致目标部位的转基因表达水平低于治疗所需，同时导致载体广泛扩散至非靶器官3，包括那些能够对载体本身及所编码治疗产物产生免疫应答的器官4,5。一种可能克服转导非特异性并促进靶向性的策略，是将基因载体以阻止其通过血液和淋巴系统自由扩散的形式递送至目标部位。通常，这类方法依赖于可局部注射的递送系统，该系统由病毒或非病毒载体与纤维蛋白、胶原蛋白或透明质酸水凝胶基质混合组成6-10，通过将基因载体物理性包埋于聚合物网络中，从而在注射部位实现载体的短暂滞留。
另一种被广泛接受的局部基因治疗范式是将基因载体固定在植入性假体装置的表面11,12。每年有数千万患者使用永久性医疗植入物（如血管内、支气管、泌尿系统和胃肠道支架、起搏器、人工关节、外科及妇科补片等&#160;etc）13。尽管这些装置总体上有效，但其相关并发症目前仍难以通过现有医疗手段充分控制14-17。可植入假体装置为实现局部基因治疗提供了一个独特的代理平台。从药代动力学角度来看，在医疗植入物表面进行修饰，仅需相对较低剂量的基因载体，即可在植入物与组织界面处实现基因载体的高局部浓度，并延缓其从此部位的清除速度。由于载体在局部滞留时间延长且靶向细胞群体对其摄取增强，固定化显著减少了基因载体的扩散，从而降低了非靶组织意外暴露的风险。
将基因载体固定于可植入生物材料表面（亦称基质介导的基因递送或固相基因递送）已在细胞培养和动物实验中应用，包括特异性（抗原-抗体）18-20，亲和素-生物素21,22）和非特异性23-26 （电荷、范德华力）相互作用。此前认为，将载体共价连接至植入装置表面是无功能的，因为与表面形成的过强化学键会阻碍靶细胞对载体的内化。最近研究表明，通过使用可自发水解的交联剂作为支架金属修饰表面与腺病毒载体衣壳蛋白之间的连接臂，可克服这一限制。27,28此外，载体释放速率和外源基因表达的时间过程 体外 和 体内 可利用具有不同水解动力学的可水解交联剂进行调控28.
本文提供了一种将腺病毒载体可逆共价结合至活化金属表面的详细实验方案，并介绍了一种用于研究后续转导事件的实用实验装置。 体外 在培养的平滑肌细胞和内皮细胞中 体内 在大鼠颈动脉支架成形术模型中。

<table><tbody><tr><td>316不锈钢网片</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>E200-SS</td><td></td></tr><tr><td>通用304级不锈钢支架</td><td>Laserage</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;eGFP&lt;/sub&gt;</td><td>宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室</td><td>AD-5-PV0504</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;Luc&lt;/sub&gt;</td><td>宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室</td><td>AD-5-PV1028</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;EMPTY&lt;/sub&gt;</td><td>宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室</td><td>A858</td><td></td></tr><tr><td>Cy3(NHS)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23000</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>UV 96孔板</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>荧光测定用96孔板</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用96孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20290</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-LC-SPDP</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>21650</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床培养箱</td><td>VWR</td><td>1575R</td><td></td></tr><tr><td>水平气流烘箱</td><td>Shel Lab</td><td>1350 FM</td><td></td></tr><tr><td>Centra-CL2离心机&amp;nbsp;</td><td>International Equipment Company</td><td>426</td><td></td></tr><tr><td>数字涡旋混合器</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE300荧光显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>DC 500 CCD相机</td><td>Leica</td><td>DC-500</td><td></td></tr><tr><td>7500实时PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum生物发光成像系统</td><td>Perkins-Elmer</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA dipotassium salt）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>A10细胞系&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1476</td><td></td></tr><tr><td>牛主动脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>BW-6002</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1Ge</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>11540-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>Corning cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green PCR主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学96孔反应板</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学粘性封膜</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林&amp;nbsp;</td><td>Apotex</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>Loxicom（美洛昔康）</td><td>Norbrook</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>Ketavet（氯胺酮）</td><td>VEDCO</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>Anased（赛拉嗪）&amp;nbsp;</td><td>Lloid</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>Forane（异氟烷）&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>弯头Moria虹膜镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>弯头超细Graefe镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>薇乔缝线（5-0）</td><td>Ethicon</td><td>J385</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（4/0丝线）&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Michel缝线夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>伤口扩张器（Lancaster眼睑撑开器）</td><td>KLS Martin</td><td>34-149-07</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Michel缝线夹施加器</td><td>Fine Science Tools</td><td>112028-12</td><td></td></tr><tr><td>Insyte Autoguard 24G静脉导管</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>2F Fogarty导管</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙管</td><td>Vention</td><td>041100BST</td><td></td></tr><tr><td>PTA导管</td><td>NuMed</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Kendall Healthcare</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Solon Manufacturing</td><td>WOD1003</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter</td><td>281321</td><td></td></tr><tr><td>10 ml注射器（鲁尔锁）</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml注射器（鲁尔锁）</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>配备#40刀头的剃毛器</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>78005-314</td><td></td></tr><tr><td>Transpore外科胶带</td><td>3M</td><td>MM 15271</td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet眼膏</td><td>Pharmaderm</td><td>无</td><td></td></tr></tbody></table>

利用通过可水解交联剂连接的腺病毒载体从金属支架表面进行血管基因转导

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

支架内再狭窄是目前广泛用于恢复冠状动脉和外周动脉严重狭窄节段血流的支架血管重建术的主要并发症。能够可控释放具有抗再狭窄活性基因的血管内支架，可能为当前使用的药物洗脱支架提供一种替代策略。为了实现临床转化，基因洗脱支架必须表现出可预测的支架固定基因载体释放动力学，并实现血管壁的靶向转导，同时避免因聚合物涂层物理包埋载体所常引发的过度炎症反应。本文详细描述了一种无需涂层即可将腺病毒基因载体锚定于支架的实验方法，该方法基于腺病毒颗粒通过可水解交联剂（HC）可逆地结合于经聚烯丙胺双膦酸盐（PABT）修饰的不锈钢表面。本文介绍了一系列双功能（胺基和巯基反应性）HC试剂，其平均分子量为1/2 使用了水解时间在5至50天之间的链内酯键水解来将载体与支架连接。载体固定过程通常在9小时内完成。&#160;包括多个步骤：1）将金属样品在PABT水溶液中孵育（4小时）；2）使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）脱除PABT中引入的巯基保护基团（20分钟）；3）通过将样品与含吡啶二硫基（PDT）修饰的聚乙烯亚胺（PEI）反应，扩增金属表面的巯基反应能力（2小时）；4）用二硫苏糖醇（DTT）将PDT基团转化为巯基（10分钟）；5）用HC修饰腺病毒（1小时）；6）通过尺寸排阻柱色谱法纯化修饰后的腺病毒颗粒（15分钟）；7）将具有巯基反应活性的腺病毒颗粒固定于巯基化钢表面（1小时）。该技术具有广泛的潜在应用前景，不仅限于支架，还可通过基底介导的基因递送至与植入异物材料接触的细胞，促进生物假体装置的表面工程，从而提高其生物相容性。

载体释放实验
将腺病毒载体固定在植入物表面（包括血管内支架等介入装置）可使载体更接近疾病部位，部分弥补了载体缺乏物理靶向性的不足。然而，为了通过转导靶组织实现治疗效果，载体必须从表面释放（图 2）。研究假设使用可水解交联剂可实现：1）将载体有效连接至经聚双膦酸盐修饰并引入巯基的金属植入物表面；2）通过交联剂的水解实现载体的持续释放。
通过使用针对 eGFP 的特异性引物对病毒 DNA 进行 PCR 检测，可确定在衍生化过程结束时与网状圆片结合的 AdeGFP 载体的基因组拷贝数（图 3）。根据所使用的特定交联剂，结合的 Ad 载体数量应在每片网状圆片 3.5 × 109 至 5.7 × 109 个颗粒之间。该数值与单个网状圆片（总面积为 0.25 cm2）以单层排列方式容纳 100 nm Ad 颗粒的理论最大容量（2.5 × 10...

这些研究报道了腺病毒基因载体可逆性地附着于支架及模型网状圆盘的无涂层金属表面。通过水解用于固定载体的交联剂，实现具有转导活性的病毒颗粒的持续释放，从而在血管细胞和置入支架的动脉中产生持久的位点特异性转基因表达。

支架内再狭窄是支架介导的血运重建手术中常见的主要并发症，该手术广泛用于恢复严重狭窄血管中的血流……

本实验的总体目标是在实验大鼠的颈总动脉内植入一种基因洗脱支架，并随时间推移确定后续转基因表达的程度和位置。为此，需在颈外动脉分支处进行动脉切开，以获得进入颈总动脉的血管通路。将一根充气的2法式Fogarty导管经颈总动脉通过，以去除血管内皮并损伤中膜层。随后将一种载有卢克（Luke）药物的洗脱支架安装在血管成形术导管上，插入球囊损伤的颈总动脉中段并展开，以测定动脉中荧光素酶的表达水平。将与奥尼克凝胶（onic gel）配制的荧光素酶施用于血管周围区域，并进行生物发光成像。最终可获得结果，用于比较不同基因洗脱支架制剂在血管组织转导程度和持续时间方面的差异。利用基因治疗预防即刻再狭窄和支架内血栓形成的优势在于，这是监测来自病毒载体和支架植入动脉中外源基因表达的最直接方法。尽管我们将腺病毒载体固定于支架的策略完全可被理解，且大鼠支架植入手术步骤的文字描述清晰明了，但在实际操作中仍需参照随附书面文件所述方法，直观地进行准备并添加Luke抗排斥支架。将病毒衍生支架存放在4°C的无菌PBS中，使用前存放时间不得超过24小时。对雄性Sprague Dawley大鼠进行麻醉后，通过足垫夹捏反应判断麻醉深度，并剃除颈部和胸部上部的毛发。涂抹眼用软膏以防止巩膜干燥，并给予抗生素、镇痛剂和生理盐水。接下来，使用24号导管对尾静脉进行插管，并无菌注射肝素。用聚维酮碘和乙醇对颈部和上胸部区域进行消毒。然后将动物仰卧放置，头部朝向操作者。然后使用手术刀放置无菌手术巾。沿中线切开皮肤和颈部筋膜。采用钝性分离技术游离左侧颈外动脉。该操作最关键的步骤是为我们的动脉切除术做好血管准备。为此，需分离颈外动脉并清除其周围所有组织。在可及的最远端位置结扎颈外动脉。然后用一根四号丝线在颈内动脉起始处施加一个滑动的临时结扎线。接着，使用弹簧剪刀，通过切口在左侧颈外动脉上做一个2毫米的动脉切口。将一根2法式 Fogarty 导管插入颈总动脉。用生理盐水充盈导管尖端。随后为去除内皮细胞，将充盈的球囊从主动脉弓向颈动脉分叉处反复推送三次。将一段导管套在 Fogarty 导管上，并插入颈总动脉。撤出 Fogarty 导管组件，压紧并在直径为 1.5 毫米的血管成形术导管球囊上安装 Luke Derivate 支架。通过聚四氟乙烯导管插入支架，并将其推进至颈总动脉的中段。避免支架与导管管壁或血管壁发生摩擦。为放置支架，将血管成形术导管连接至压力泵的压力表，施加12个大气压的压力并维持30秒。随后撤出血管成形术导管。接下来，在动脉切开部位近端结扎颈外动脉，并松开颈内动脉上的临时结扎线。使用连续的4-0 Vicryl缝线逐层缝合手术伤口，并用钉皮器闭合皮肤。将动物置于加热垫上恢复，直至其能够自主活动，然后将其放回隔离笼中。尽管动物在术后通常不会表现出疼痛或不适，超过手术后前12小时的情况除外，但仍可考虑将美洛昔康治疗

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

从金属支架表面使用的腺病毒载体栓通过水解的交联剂血管基因转移

本文描述了一种利用猪心肌梗死模型进行缺血性心力衰竭基因治疗的基因转移方法。我们这一简单且可重复的方法能够便捷地以一种极为简便和可重复的方式评估多种基因转移的有效性。...

缺血性心力衰竭的基因转导在临床前模型中的研究

我们描述了一种利用可生物降解的聚合物纳米颗粒使干细胞过表达促血管生成治疗因子的方法。所述过程包括聚合物合成及转染脂肪来源的干细胞...

利用可生物降解的聚合物纳米颗粒编程干细胞以实现治疗性血管生成

本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。...

用于糖尿病性角膜病变的腺病毒基因治疗：对人器官培养角膜和角膜缘上皮细胞伤口愈合及干细胞标志物表达的影响

该方法用于将外源基因导入兔颈动脉内皮。外源基因的导入使得能够在正常动脉或疾病模型中评估该外源基因产物的生物学功能。该方法也可用于检测DNA调控序列的活性。...

体内 基因转导至兔颈总动脉内皮

本方法描述了在兔子体内植入间置静脉移植物、对移植物进行转导以及实现持久的外源基因表达。该技术可用于研究外源基因及其蛋白产物在移植静脉中的生理与病理作用，并可用于静脉移植物疾病基因治疗的测试。...

颈静脉至颈总动脉移植血管中持久外源基因表达的兔模型

本方案旨在描述猪肝细胞的分离方法 离体...

慢病毒载体介导的肝细胞基因治疗 离体 用于猪的自体移植

本文所述方案使研究人员能够通过简单的化学方法在特定位置特异性修饰腺病毒衣壳。可由此生成被屏蔽的腺病毒载体颗粒和重定向基因转移载体，并可用于研究载体与宿主之间的相互作用。...

腺病毒基因转移载体的遗传与化学衣壳联合修饰用于屏蔽与靶向

本文描述了大量制备重组腺病毒的方法，这些病毒可用于转导天然啮齿类动物尿路上皮，从而实现外源基因的表达或内源性基因产物的下调。...

利用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿路上皮中表达外源基因

本方案描述了通过脾内注射AAV8递送的短发夹RNA，可实现与门静脉注射相同的肝脏基因敲低效率，且操作更为简便，并显著降低围手术期和术后死亡率及并发症发生率。...

通过脾内注射腺相关病毒8型（AAV8）递送的短发夹RNA实现肝脏高效基因沉默

本文介绍了一种利用套管技术将组织工程血管移植物植入小鼠颈动脉的实验方案，为研究血管组织再生机制提供了合适的动物模型。...

小鼠颈动脉组织工程血管移植物植入术 通过 袖带技术

了解利用水解交联剂从金属支架表面释放腺病毒载体进行血管基因转移的技术。该方法通过在大鼠颈总动脉植入基因洗脱支架，结合生物发光成像评估转基因表达，为血管基因治疗提供新策略。

利用通过可水解交联剂连接的腺病毒载体从金属支架表面进行血管基因转导

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