Name: 在造血干细胞和祖细胞利用共聚焦和多光子显微镜五荧光蛋白标记的活体克隆跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: 学习利用共聚焦和双光子显微镜技术对小鼠造血干细胞和祖细胞进行五荧光蛋白标记的体内克隆追踪方法。该技术可实现长达120天的非侵入性细胞命运追踪和三维重建分析。

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本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所的院内研究项目资助。我们感谢德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心的 Boris Fehse 提供了五种 LeGO 载体质粒；感谢 NHLBI、NIH 的 Christian A. Combs 和 Neal S. Young 在本研究过程中给予的讨论、支持与鼓励；并感谢 NHLBI、NIH 的 Andre LaRochelle 在尾静脉注射方面提供的协助。

所有小鼠的饲养和操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定，并纳入经国家心肺血液研究所（NHLBI）动物护理和使用委员会批准的实验方案。选用6至12周龄的雌性B6.SJL-Ptprc(d)Pep3(b)/BoyJ（B6.SJL）小鼠作为供体，C57Bl/6小鼠作为受体。
材料、试剂和设备列表见表1。
1. 小鼠HSPC的LeGO转导及骨髓移植
在经认证的生物安全二级（BSL-2）柜（组织培养罩）中进行下述操作。
<ol>
	<li>编码5FPs的LeGO载体的制备
	<ol>
		<li>使用编码不同荧光蛋白（FP）的慢病毒“基因本体”（LeGO）载体质粒，这些荧光蛋白由强组成型SFFV启动子驱动表达，包括LeGO-Cer2（Cerulean）、LeGO-G2（EGFP）、LeGO-V2（Venus）、LeGO-T2（tdTomato）和LeGO-C2（mCherry），由德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心Boris Fehse博士惠赠；现亦可从Addgene获取5-7.</li>
		<li>为制备LeGO载体，接种5 × 106 转染前24小时，在10 cm培养皿中接种293T细胞（每种载体使用12个培养皿），每皿加入8 ml I10培养基（IMDM添加10% FCS以及谷氨酰胺/青霉素/链霉素）。</li>
		<li>使用经略微修改的 CAPHOS 试剂盒说明书推荐方法，用磷酸钙转染细胞：
		<ol>
			<li>每块培养板中加入15 µg LeGO载体、12 µg pCDNA3.HIVgag/pol.4xCTE、4 µg pRev-TAT和1 µg pMD2.G-VSV-G质粒，并加入50 µl&#160;2.5 M CaCl2，并加水至终体积为 500 µl&#160;总体积。</li>
			<li>用 500 µl 沉淀 DNA 质粒&#160;加入2× HeBS（HEPES缓冲盐溶液），室温孵育20分钟，然后再添加至每孔293T细胞中。</li>
			<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞6小时2 培养箱；转染后6小时更换培养基，弃去旧培养基，加入新鲜培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每日收集各培养板中含有慢病毒颗粒的培养上清，持续3天。每次收集上清后，立即向每块培养板中加入新鲜的I10培养基。
		<ol>
			<li>经0.22 µm孔径滤器过滤，合并上清液，使用SW28转子在71,900 x g、4 °C条件下超速离心2小时进行浓缩。</li>
			<li>将上清液重悬于 1 ml StemSpan 培养基中。将慢病毒原液按每份 200 µl 分装&#160;并于 -80 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒颗粒的滴定 
	通过使用NIH3T3细胞定量转导单位/毫升，测定收集的上清液中LeGO载体颗粒的滴度。滴度可用于计算为实验靶细胞达到所需相对感染复数（MOI）所需的每种载体上清液的体积。
	<ol>
		<li>接种 5 × 10⁵ 细胞4 前一天在12孔板中每孔接种2 ml I10培养基的NIH3T3细胞。</li>
		<li>在添加硫酸鱼精蛋白（4 mg/ml）的 I10 培养基中，对病毒载体上清液进行 5 倍梯度稀释&#160;是1,000倍。</li>
		<li>吸除细胞中的培养基，替换为含有相当于 2、0.8、0.32 和 0.128 µl 浓缩病毒的上清液稀释液各 500 µl。</li>
		<li>确定转导时每孔中的细胞数量（No），计数一个对照孔。</li>
		<li>转导6小时后，加入2 ml I10培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养3天。2.</li>
		<li>使用胰蛋白酶-EDTA从每个孔中收集细胞，并通过流式细胞术测定荧光细胞百分比（%FP）。</li>
		<li>按下述方法计算滴度：取每孔（稀释度）所得 %FP 在 1% 至 50% 范围内的滴度进行平均。滴度（vector particles/ml）= No × %FP / 病毒上清液体积（ml）。若 %FP 在 1% 至 50% 之间，则对各稀释度获得的滴度取平均值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠细胞的收集、纯化、转导与移植（示意图如所示） 图1A 改编自 Malide 等4).
	<ol>
		<li>通过批准的程序处死供体小鼠。从前肢和后肢采集骨髓：分离肱骨、股骨和胫骨，彻底去除骨骼上的所有肌肉、韧带及多余组织，尽可能靠近关节处横切每根骨骼的末端，并使用27G针头将骨髓从骨中冲洗出来&#160;注射器中装有I10培养基的针头。</li>
		<li>以500 × g、4 °C离心10分钟，沉淀全骨髓细胞，并用50 ml ACK缓冲液裂解红细胞两次。将细胞重悬于10 ml I10培养基中。</li>
		<li>使用MACS谱系耗竭试剂盒，按照改良的试剂盒方案纯化谱系阴性（Lin-）前体细胞：
		<ol>
			<li>使用 30 µl Anti-Biotin MicroBeads，而非 10 µl/107 细胞；使用I2培养基（IMDM添加2% FCS）替代缓冲液完成洗涤步骤。</li>
			<li>在生物素化抗体混合物孵育与抗生物素微珠孵育之间增加一个洗涤步骤；并使用I10缓冲液而非缓冲液平衡层析柱。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 Lin- 细胞以 5 × 10 的起始密度培养 48 小时5 在添加了10 ng/ml小鼠IL-3、100 ng/ml小鼠IL-11、100 ng/ml人Flt-3配体和50 ng/ml小鼠干细胞因子的StemSpan培养基中，细胞密度为cells/ml。</li>
		<li>转移 1 至 4 x 105 将细胞接种至包被有RetroNectin的12孔板中，加入LeGO上清液进行转导，每个孔的感染复数（MOI）为6-7，以实现每种荧光蛋白（FP）约50%的表达效率；同时使用上述详细的StemSpan培养基和细胞因子，并添加4 µg/ml硫酸鱼精蛋白。</li>
		<li>分别使用每种LeGO载体转导细胞，操作步骤如1.3.5所述，转导后将细胞混合（称为Mix）；或者将5种LeGO载体的上清液同时共转导细胞（称为Co）。转导24小时后收集细胞，用不含细胞因子的StemSpan培养基洗涤一次，随后重悬于不含细胞因子的StemSpan培养基中用于移植；或者将细胞转移至含细胞因子的新鲜培养基中继续培养96小时，之后进行共聚焦显微镜观察和流式细胞术分析。
		<ol>
			<li>通过尾静脉注射，将经转导的Lin- HSPCs注入经11 Gy单次剂量预照射的受体小鼠体内（照射后6-18小时）&#160;移植前&#160;受体，总体积为100 µl，每只小鼠的细胞剂量相当于1-4 x 105 最初用于转导的 Lin- 细胞。每次实验中，使用相同群体的转导供体骨髓细胞对整批动物进行移植。</li>
			<li>对于 体外 转导HSPC的表征，在添加细胞因子的StemSpan培养基中将细胞继续培养4-5天，通过流式细胞术分析转导效率，并通过显微镜观察颜色多样性。
			<ol>
				<li>处死单只小鼠&#160;并在移植后不同时间点（最长至120天）获取组织和器官用于成像。
				<ol>
					<li>喷洒&#160;用乙醇擦拭小鼠毛发，并在腹侧皮肤上剪开切口，避免毛发散落。</li>
					<li>按照标准操作程序解剖并切除脾脏、腘淋巴结、肺、心脏、皮肤、脂肪组织、骨骼肌、肾、肝以及头部以获取颅骨。</li>
					<li>或者，可使用颅骨或建立骨窗，以便随时间重复进行活体成像2,8,9 或在活体动物中对皮肤和淋巴结等浅表器官进行成像。</li>
				</ol>
				</li>
				<li>将单个器官置于含50–100 μl PBS的35 mm 0号盖玻片培养皿中&#160;用于在不进行切片、固定或进一步处理的情况下完整成像，具体方法如步骤 2.5 所述。</li>
				<li>进行容积成像时，将器官保存在冷PBS中直至使用。进行延时成像时，立即在含20 mM HEPES的DMEM、10% FBS中对器官进行成像，温度为37 °C</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 共聚焦与双光子显微镜及图像分析
<ol>
	<li>使用配备多线氩离子激光器、561 nm二极管激光器、594 nm HeNe激光器和633 nm HeNe激光器的Leica SP5五通道共聚焦与多光子系统进行显微成像。在双光子模式下，采用可调谐脉冲飞秒钛宝石（Ti-Sa）激光器，激发波长范围为680至1,080 nm，并配备色散补偿功能。在涉及红移荧光蛋白（tdTomato和mCherry）的实验中，使用光学参量振荡器（OPO）激光器，将输出波长范围扩展至1,030–1,300 nm，可与Ti-Sa激光器依次或同时使用。</li>
	<li>使用HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA水浸物镜（WD = 2.5 mm）、HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA干式物镜（WD = 0.6 mm）或HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA水浸物镜（WD = 0.6 mm）对各种组织进行成像。</li>
	<li>获取经单一荧光蛋白LeGO载体转导的骨髓细胞以及未移植对照骨髓细胞的共聚焦荧光光谱，采集可见光谱范围内发射光的lambda堆栈（xyλ），带宽为5 nm。
	<ol>
		<li>使用 Leica LAS-AF v2.4.1 软件对图像进行处理，以生成所有 5 种荧光蛋白以及自发荧光的参考光谱图2A）。使用各荧光蛋白的光谱特性及其荧光亮度差异（以EGFP亮度为100%，Cerulean为79%，Venus为156%，tdTomato为283%，mCherry为47%），设定5个连续成像通道如下：Cerulean（458/468–482 nm）、EGFP（488/496–514 nm）、Venus（514/523–558 nm）、tdTomato（561/579–597 nm）和mCherry（594/618–670 nm）图2B).</li>
		<li>验证荧光蛋白（FP）分离的准确性，因为转导了单一荧光蛋白的细胞仅在对应的通道中可见，而在其他通道中不可见（图 2C此外，这种明确的多通道方法可生成独特的5通道“彩色图谱”，能够实现后续的颜色分析和克隆追踪，相较于光谱成像，具有缩短采集时间的优势。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在双光子模式下，使用高效率定制二向色镜分离荧光发射信号，并通过四通道非扫描探测器（NDD）进行收集，具体配置如下：首先使用568 nm二向色镜，随后使用465 nm二向色镜，接着配备452/45 nm发射滤光片用于SHG或自发荧光及Cerulean信号检测，525/40 nm发射滤光片用于EGFP或Venus信号检测，以及648 nm二向色镜配合620/60 nm发射滤光片用于tdTomato或mCherry信号检测。
	<ol>
		<li>通过双光子显微镜的内源性对比成像揭示组织结构信息，包括来自弹性蛋白和NADH的自发荧光（激发波长780 nm），以及来自骨组织和纤维状胶原的二次谐波信号（SHG）（激发波长920 nm或860 nm，以背向散射方式收集）10,11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于三维体积渲染，需采集一系列 x-y-z 图像（通常为 1 x&#160;1 ×&#160;4 μm3&#160;体素大小）沿z轴以5 μm间隔在骨髓及其他组织的一定深度范围（150–300 μm）内进行成像，利用软件的拼接功能在大范围内自动生成包含整个胸骨凹区域的拼接图像，尺寸约为2.5 ×&#160;1.2 mm2 (x-y) 和 300 μm (z) (图2D-2E）和 视频&#160;1.
	<ol>
		<li>通过颅骨直接成像颅顶骨髓，无需切片2, 8.</li>
		<li>沿矢状面纵向切开胸骨（二分法），然后在第2胸骨窝关节处横向切割，并通过切面进行成像3,4,12 （概述在 图1B 改编自 Takaku 等3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于4D延时成像，将新切除的腘窝淋巴结、脾脏、肺或颅骨骨样本未经切割直接置于35 mm零号盖玻片培养皿中，加入50–100 μl&#160;DMEM，含10% FBS及20 mM HEPES，37 °C条件下使用双光子Ti-Sa激发（860 nm）结合共聚焦激发（458 nm、488 nm、514 nm、561 nm、594 nm）和Leica共振扫描仪（8000 Hz/sec），每隔20秒采集一次z轴层扫图像（约80 μm），持续长达1小时。
	<ol>
		<li>用于同时三色双光子成像时，将钛宝石激光器调至860 nm，并与调至1,130 nm的OPO激光器同时使用&#160;对于 tdTomato；或 1,140 nm mCherry）（视频&#160;2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维体积与四维时间序列的重建与分析
	<ol>
		<li>使用 Imaris x64 软件版本 7.6 或其他替代软件包，将原始图像的拼接图层转换为骨髓及不同组织内荧光标记细胞的体渲染（3D）数据，并如前所述将其导出为 3D 旋转视频3,4 (视频&#160;1）逐步示例：
		<ol>
			<li>在 Imaris 中打开 z-stack 图像；选择“Surpass”以显示三维体积可视化。</li>
			<li>使用“navigate”功能将样本旋转360°。</li>
			<li>选择“动画”以创建动画；使用关键帧添加选定的视图、缩放和容积旋转；预览视频，根据需要进行编辑，并将文件保存为所需的视频格式（例如：avi、mov）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为定量评估三维细胞及克隆的频率、位置、大小和分布，可进一步使用 Imaris XT 模块处理 z 层图像，该模块整合了 MATLAB 应用程序，可进行距离测量（采用距离转换算法）和聚类分析，具体方法如前所述3,4使用 Imaris x64 软件将随时间变化的图像堆栈序列转换为体渲染的四维（4D）视频，并利用点状物和表面分析结合自回归运动算法，对细胞在三维空间中的运动进行半自动追踪。</li>
		<li>对细胞进行多光谱分析，步骤如下：通过 Imaris XT 的通道算术功能将全部 5 个通道叠加，提取多色标记的斑点至一个新通道；针对所有斑点（细胞）分别测定其在 5 个组分通道中的平均荧光强度。将所得数值导出至 Excel 软件，绘制显示独特“光谱指纹”的图表 即 单个细胞中每种荧光蛋白的相对百分比（图2E图表）。校正组织漂移数据，计算随时间变化的细胞速度和位移、轨迹长度、路径及距离；将数值导出至Excel软件以绘制图表。使用Adobe Photoshop CS5软件组装组合图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li>
<li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li>
<li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+ontology+%28LeGO%29+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%27gene+ontology%27+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li>
<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
<li>Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。

我们在此详细介绍一种近期开发的强大克隆细胞追踪方法，该方法结合了由组合标记产生的高度多样性与编码5种荧光蛋白（5FP）的LeGO载体，并利用串联共聚焦显微镜与双光子显微镜成像，实现在活体组织中进行三维及动态成像。该技术通过在5个“独立”的8位通道中记录共聚焦光谱特征，拓展了基于荧光蛋白的颜色标记应用。因此，每个细胞内Cerulean、EGFP、Venus、tdTomato和mCherry的相对比例形成独特的“颜色指纹”，可用于识别克隆子代细胞。利用5种荧光蛋白进行多色标记显著增加了标签的多样性，尤其在研究高密度组织样本中同类型细胞或细胞群的分布、接触、拼接排列以及竞争性相互作用时表现出重要优势。结合双光子激发对多种组织和器官内在结构特征的成像能力，我们能够在无需固定和物理切片的情况下，在天然微环境中追踪带有颜色标记的克隆细胞。我们已发表的研究证实，源自单个前体细胞的子代细胞即使经历分化与增殖，仍保留独特的“颜色指纹”，并在单个克隆中发现数百个已分化的细胞，验证了该方法的有效性 体外 具有相同“颜色图谱”的菌落（CFU）
该方法结合了单细胞分辨率高分辨率成像与共聚焦...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

血细胞的生成过程称为造血作用，由一小群造血干细胞和祖细胞（HSPCs）维持。这些细胞存在于骨髓（BM）中一个复杂的微环境生态位内，该微环境包含成骨细胞、基质细胞、脂肪组织和血管结构，均参与调控HSPCs的自我更新与分化1,2。由于完整的骨髓传统上难以直接观察，HSPC与其微环境之间的相互作用在活体（in vivo）条件下的特征仍 largely 未被阐明。此前，我们建立了一种利用共聚焦荧光与反射显微镜对完整骨髓进行三维结构成像的方法3。我们曾表征了骨髓中EGFP标记的HSPCs的扩增情况，但仅使用单一荧光蛋白（FP）限制了对克隆水平再生过程的分析。最近，我们利用可组成型表达荧光蛋白（FPs）的慢病毒基因本体（Lentiviral Gene Ontology, LeGO）载体，实现了对细胞的高效标记4,5。通过使用3种或5种载体对HSPC进行共转导，可产生多种组合颜色，从而实现对多个单个HSPC克隆的追踪。
标记的造血干细胞/祖细胞（HSPC）结合新型成像技术，使得在辐照小鼠骨髓（BM）中追踪单个HSPC的归巢与植入成为可能。采用LeGO载体将HSPC标记为3种或5种不同的荧光蛋白（FP）（包括Cerulean、eGFP、Venus、tdTomato和mCherry），并通过共聚焦显微镜和双光子显微镜长期观察其在骨髓中的植入情况，从而清晰地可视化骨组织及其他基质结构，并揭示HSPC克隆与其微环境组分之间的空间关系。HSPC从C57Bl/6小鼠骨髓中分离为谱系阴性细胞，经LeGO载体转导后，通过尾静脉注射回输至经骨髓消融的同源小鼠体内。通过对胸骨骨髓组织大体积的监测，我们观察到在骨髓再生早期即发生骨内膜区域的植入。最初，具有多样荧光光谱的细胞簇紧邻骨表面出现，并随时间逐渐向中央区域扩展。有趣的是，3周后骨髓中形成了宏观可见的克隆性细胞簇，提示造血活动由单个HSPC在骨髓内连续扩展而来，而非HSPC通过血液循环广泛播散所致。在后期时间点观察到荧光颜色多样性减少，提示长期重建造血细胞难以被多种载体同时转导。
此外，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在脾脏中形成了细胞簇，脾脏也是小鼠体内负责造血的器官之一。由HSPCs分化而来的单个细胞也可见于胸腺、淋巴结、脾脏、肝脏、肺、心脏、皮肤、骨骼肌、脂肪组织以及肾脏中。通过三维图像可对细胞分布情况进行定性和定量评估，同时对组织的干扰极小。最后，我们通过结合共振扫描多光子显微镜与共聚焦延时成像技术，展示了四维活体动态研究的可行性。该方法能够在完整的三维组织结构中，对光谱标记的细胞群体进行无创、高分辨率、多维度的细胞命运示踪，为组织再生与疾病病理研究提供了强有力的工具。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;病毒的制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Cerulean 的表达</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>eGFP的表达</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Venus的表达</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>tdTomato的表达</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>mCherry的表达</td></tr><tr><td>磷酸钙转染试剂盒</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco，Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺</td><td>Gibco，Life Technology</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>密理博注射器驱动滤器（0.22 µm） &amp;micro;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;小鼠细胞的收集、纯化、转导与移植&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>小鼠谱系细胞耗竭试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱 + 管</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器（30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>用于造血细胞培养与扩增的StemSpan SFEM无血清培养基（500 ml）</td><td>StemCell Technologies Inc&amp;nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-11 CF</td><td>R &amp;amp; D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &amp;micro;g/ml 是 1,000 倍</td></tr><tr><td>重组小鼠 SCF</td><td>RDI 分部，Fitzgerald Industries Intl&amp;nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &amp;micro;g/ml 是 2,000 倍</td></tr><tr><td>重组小鼠IL-3</td><td>R &amp;amp; D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &amp;micro;g/ml 是 2,000 倍</td></tr><tr><td>FLT-3配体</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &amp;micro;g/ml 是 1,000 倍</td></tr><tr><td>12孔板，Costar</td><td>康宁公司</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio 公司</td><td>T100A/B</td><td>重悬于50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &amp;micro;g/ml 是 1,000 倍</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;共聚焦与双光子显微镜技术&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro，Mediatech 公司</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>P35G-0-20-C 玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿 P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 培养皿盖玻片 #1 硼硅酸盐盖玻片；4 孔</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 盖玻片，No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS 五通道共聚焦与多光子显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph 激光器波长范围 680-1,080 nm</td><td>相干</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO 激光器，波长范围 1,030-1,350 nm</td><td>相干的</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25倍/0.95 数值孔径水浸物镜（工作距离=2.5 mm）</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA 干式物镜（工作距离=0.6 mm）</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA 水浸物镜（工作距离=0.6 mm）</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件版本 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

我们开发并验证了一种荧光标记方法，可用于高空间和时间分辨率下对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行克隆追踪研究 体内 利用小鼠骨髓移植实验模型研究造血作用。通过编码荧光蛋白（FPs）的慢病毒载体进行遗传组合标记，结合高级显微成像技术实现细胞命运示踪。使用编码五种不同荧光蛋白（Cerulean、EGFP、Venus、tdTomato 和 mCherry）的载体同时转导造血干细胞和祖细胞（HSPCs），从而生成具有多样化颜色标记的细胞群体。采用共聚焦/双光子混合显微成像技术，可同时高分辨率地评估独特标记的细胞及其子代，并结合组织结构成分进行分析。大范围体积成像分析表明，光谱编码的HSPC来源细胞可在移植后长期非侵入性地在包括骨髓（BM）在内的多种完整组织中被检测到。结合视频速率多光子成像与4D共聚焦延时成像的活体研究，展示了以定量方式动态追踪单个细胞及其克隆行为的可能性。

关键词：造血作用，骨髓移植，小鼠模型，慢病毒载体，荧光蛋白，细胞命运示踪，共聚焦显微镜，双光子显微镜，HSPC，活体成像

胸骨骨髓的全组织三维共聚焦/双光子显微镜时间序列重建揭示了移植的共表达5种荧光蛋白（co-5FPs）细胞的植入与扩增模式，具有显著特征：克隆边界清晰，最初均匀地标记有多种颜色，随着时间推移逐渐演变为主要包含单一颜色细胞的克隆。共聚焦显微镜的设置以及在胸骨骨髓中成像标记了5FPs的造血干细胞和祖细胞（HSPC）的代表性示例见图2以及视频1和2。
完整组织的三维共聚焦/双光子显微镜整体成像重建展示了在活体组织中长期追踪经颜色标记的骨髓来源细胞命运的可能性。以下展示了移植后造血及非造血器官中骨髓来源细胞的代表性示例。 图3.
<img alt="造血干细胞实验流程示意图，包含转导、回输及显微成像装置。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51669/51669fig1...

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。

我们开发并验证了一种用于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）克隆追踪的荧光标记方法，该方法具有高空间和……

本实验的总体目标是利用一种新型的共聚焦显微镜与双光子显微镜联合策略，在活体组织（包括骨髓）中追踪荧光标记的造血克隆。为此，首先分离小鼠造血祖细胞和干细胞，并使用编码五种荧光蛋白（Ian、EGFP、Venus、TD Tomato 和 mCherry）的慢病毒基因本体（Lentiviral Gene Ontology，简称 Lego）载体对其进行共转导。转导后的细胞被移植到经骨髓消融处理的受体小鼠体内。在最长可达120天的不同时间点，采集受体小鼠的骨髓和器官组织，随后进行联合共聚焦与双光子显微成像分析。通过三维重建获得的图像，可随时间追踪荧光标记的移植克隆及细胞的位置。这有助于研究造血过程中的克隆演化以及骨髓来源细胞在其他器官中的命运。与组织物理切片相比，该技术的主要优势在于结合了高分辨率成像与共聚焦显微镜的光学切片能力，同时可通过双光子显微镜实现对结构成分的可视化观察。该方法有助于解答血液学领域中的关键问题，例如在骨髓移植早期植入阶段，随着时间推移，克隆在空间和时间上的动态变化以及扩增克隆的地理分布维持情况。可对大量完整的致密组织进行检测。例如，通过计算重建约3000张图像，以可视化胸骨脂肪组织中标记颜色的克隆。尽管该方法可用于研究正常及异常血液系统发生过程中的克隆结构，也可应用于器官再生、免疫应答或肿瘤转移模式的研究。在此过程中，慢病毒基因本体或Lego载体编码五种荧光蛋白：Ian EGFP、Venus、TD番茄和M Cherry。每种荧光蛋白均由强组成型脾脏集落形成病毒（SFFV）启动子驱动表达。在制备编码荧光蛋白的Lego载体并测定病毒颗粒滴度后，通过解剖牺牲供体小鼠的肱骨和胫骨，从其前后肢收获骨髓。使用解剖刀彻底去除骨骼上的所有肌肉韧带和多余组织。随后，尽可能靠近关节处横向切断每根骨骼的末端。使用装有 I 10 培养基的注射器连接27号针头，将骨髓冲洗至50毫升锥形离心管中，在4°C、500 G条件下离心，使细胞沉淀。弃去上清液以裂解红细胞后，加入50毫升CK缓冲液，按前述方法离心，弃去上清液，重复一次。第二次弃去上清液后，将细胞重悬于10毫升I 10培养基中。然后根据随附文件中详述的改良试剂盒方案，使用Max谱系耗竭试剂盒纯化谱系阴性祖细胞。待谱系阴性细胞纯化后，将其以每毫升5 × 10⁵个细胞的密度接种于T75培养瓶中，培养基为干细胞培养基（Stem Span Medium），并添加小鼠IL-3、小鼠IL-11、人Flt3配体和小鼠干细胞因子，于37°C、5% CO₂条件下培养48小时。培养两天后，使用细胞刮棒重新悬浮细胞，并将每孔1 × 10⁵至4 × 10⁵个细胞接种至12孔板中，每孔加入MOI为6至7的病毒载体，载体溶于含细胞因子及4 µg/mL硫酸鱼精蛋白的干细胞培养基中。为了使每个孔中的总体积达到一毫升，务必为每种荧光蛋白准备一个单色对照。24小时后，使用细胞刮刀重悬细胞，并将其转移至一个五毫升离心管中。然后离心，并在不含细胞因子的干细胞培养基中重悬细胞，再次离心后，按每注射位点或用于共聚焦显微镜或流式细胞术分析的需求，将细胞重悬于100 µL不含细胞因子的干细胞培养基中。将它们转移至含有新鲜培养基和细胞因子的12孔板中，继续培养96小时。在准备进行骨髓移植时，将经照射的受体小鼠置于笼中，并在小鼠复温期间置于保温灯下。每只小鼠用100微升干细胞培养液中含1×10⁵至4×10⁵个谱系阴性细胞的注射器做好注射准备。为每只小鼠准备一个注射器。当小鼠尾静脉扩张后，即可进行注射。将待注射的小鼠放入小鼠固定器中，并用浸有70%乙醇的棉垫消毒尾部。此步骤还有助于更清晰地观察尾静脉。随后将细胞注入尾静脉。在移植后的不同时间点（最长至120天）对整组动物进行移植，所用转导供体骨髓细胞的群体保持一致。获取组织和器官，用于无需切片的完整成像。将各个器官置于含 50 至 100 微升冷 PBS 的 35 毫米零号盖玻片培养皿中，用于延时成像。将器官置于含有20毫摩尔HEPES的DMEM 10%FBS中，于37摄氏度条件下立即进行成像。此处使用配备多线氩离子二极管、561纳米氦氖、594纳米氦氖和633纳米可见光激光器的倒置Leica SP五通道共聚焦及多光子系统进行显微观察。将一个单个Lego转导的样品放置在显微镜载物台上并调焦。以五纳米为带宽间隔，采集覆盖整个光谱范围的lambda图像序列。接下来，使用软件在图像中选择感兴趣区域，并查看参考光谱的直方图。保存此数据。然后对实验中的每种荧光蛋白重复此过程。接下来，利用从单个荧光蛋白收集的光谱，在通道模式下设置带宽。为此，针对每个通道，单击黑色滑块并输入要使用的带宽。所选带宽应涵盖每种荧光蛋白激发光谱的峰值区域，同时确保各荧光通道之间无重叠。为每个检测器设置增益和偏移，使样品输出的动态范围处于可检测水平，不同荧光蛋白之间的信号强度相近且不发生饱和。例如，M cherry 蛋白的亮度约为 EGFP 的一半，因此应调整增益和偏移，使两者的动态范围相近。最后，在通道模式下，使用全部五个通道分别采集每种单色对照样本的图像，并检查以确保每种荧光蛋白仅在其对应的通道中可见，而在其他通道中均无信号。在所有通道的光谱均验证无误后，保存设置。这些设置可被导入并在未来使用相同荧光蛋白和样本组织的实验中重复使用。此处通过沿矢状面使用手术刀和镊子对胸骨进行切开，获取胸骨骨髓，并结合共聚焦和双光子显微镜进行成像。随后在两侧胸骨窝连接处进行横向切割。将切割后的骨块切面朝下放置于一个含有 50 至 100 微升冷 PBS 的 35 毫米零号盖玻片培养皿中，通过切面进行成像。在解剖显微镜下检查骨骼的位置。将样本放置在显微镜载物台上。然后设置成像软件，依次采集双光子激发产生的二次谐波信号。然后进行五色共聚焦激发。以五微米为步长，在150至300微米范围内设定Z轴采集范围的边界。使用平铺功能，指示软件自动生成包含整个胸骨凹区域的拼接图像，其在XY方向上约为2.5乘以1.2平方毫米。启动图像采集，以在全部五个通道中依次收集X、Y、Z图像，并结合来自骨骼和纤维胶原的二次谐波信号的双光子显微成像，进行四维时间序列成像。将 freshly excised、未切割的腘窝淋巴结、脾脏、肺或颅骨骨样本置于35毫米直径、0号盖玻片培养皿中，加入50至100微升含10% FBS和20毫摩尔HEPES的DMEM，于37摄氏度下孵育。将样品置于加热的显微镜载物台上。然后在软件中切换采集参数，使用860纳米的双光子钛蓝宝石激发，结合共聚焦激发和徕卡8,000赫兹每秒的共振扫描器。以22微米间隔采集80微米的Z轴堆栈图像，持续最长一小时，实现同步三色双光子成像；在软件中设置参数时，使用调谐至860纳米的钛蓝宝石激光器，同时结合OPO激光器调谐至1,130纳米（用于TD番茄红）或1,140纳米（用于M樱桃红）。最后启动采集以获取四幅D图像。与之前相同，待所有图像采集完成后，使用Amer 64位版本或软件中的类似软件进行三维和四维重建与分析。打开Zack图像，选择surpass以显示三维体积可视化器。然后使用“导航”功能将样本旋转360度。接下来选择动画功能，利用关键帧添加选定的视图、样本的缩放和旋转效果。预览视频并根据需要进行编辑。最后，将文件保存为所需的视频格式，以追踪荧光标记的造血干细胞和祖细胞的克隆历史。本视频中所述，将同时转导了五种不同Lego载体的供体细胞移植到受体小鼠体内，并对胸骨骨髓进行成像和分析。移植后第4天，在显示为白色的骨边缘附近，可见多种颜色标记的细胞簇。到第31天时，具有独特黄绿色的大型克隆已扩展并占据整个骨陷（Fosse），合并图像及单通道图像均显示了这一现象。FPS含量分析表明，两个FPS变异体EGFP和Venus均呈现均一标记。该3D重建视频展示了标记克隆在胸骨骨组织内的空间结构。此图像显示了移植后120天在腘窝淋巴结中出现的骨髓来源细胞示例。分散的细胞主要以黄色和红色标记，位于心脏心外膜侧视野中呈白色的胶原纤维周围。 大量单个细胞可见，散布于白色显示的心肌细胞之间，这些细胞通过780纳米的双光子自发荧光成像显示。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数天内完成。该技术的建立为器官再生与发育领域的研究者提供了重要基础，并推动了通过多色标记结合共聚焦及双光子成像技术，对克隆复杂的细胞及其结构元件在时空上的空间排列进行更深入的生物学研究。观看本视频后，您应该能够充分理解如何开发荧光标记方法，以实现对活体器官中造血干细胞和祖细胞克隆标记的示踪。

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在造血干细胞和祖细胞利用共聚焦和多光子显微镜五荧光蛋白标记的活体克隆跟踪

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使用氧化铁纳米颗粒标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞以实现磁共振成像无创体内示踪

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

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荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。...

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体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。...

追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

本文介绍了使用R26R-Confetti小鼠进行多色谱系示踪实验的设计与操作原理，并提供了一种针对角膜上皮细胞追踪的具体实验方案，该方案可经修改后适用于其他感兴趣的组织。...

使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

学习利用共聚焦和双光子显微镜技术对小鼠造血干细胞和祖细胞进行五荧光蛋白标记的体内克隆追踪方法。该技术可实现长达120天的非侵入性细胞命运追踪和三维重建分析。

体内克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

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