产生和人类INO80染色质重塑复合物及其亚纯化
2014年10月23日
这个协议描述了用于产生和纯化野生型和人INO80染色质重构复合物的突变版本中的一个过程。表位标记的INO80亚基的版本都稳定地表达在HEK293细胞中，并完全配合物和配合物缺乏亚基的特定集合是通过免疫亲和层析纯化。
该程序的目的是在 oh 80 染色质重塑复合物中生成和纯化多亚基的野生型和突变型。这是通过首先从表达 O 80 蛋白中标记的 Flag 表位的细胞中分离细胞核来实现的。在第二步中，制备核提取物，然后通过抗 Flag aros 色谱纯化 O 80 染色质重塑复合物中的野生型或突变型人。最终，纯化的 NO 80 复合物的亚基组成可以通过蛋白质印迹或银染进行分析。
该方法可以帮助回答有关 MultiPro 染色质重塑复合物的亚基如何影响其整体活性的关键问题。该方法专为研究 NO 80 染色质重塑复合物的野生型和突变型而设计，但也可用于研究其他多亚基核复合物。就像调解员一样。
该程序最关键的步骤是细胞核提取步骤。人们通常会遇到问题，因为在盐提取步骤中，人们往往会过快或过猛地加盐 培养后 在滚瓶中，将 HEC 2 9 3 细胞转移到适当大小的刻度锥形管中，并在 1000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 10 分钟。去除旋滑物后，测量填充细胞沉淀的体积，然后轻轻移液将沉淀重新悬浮在五包细胞体积的缓冲液 A 中，并将细胞在冰上孵育整整 10 分钟。
再次离心细胞后，再次测量细胞沉淀，其大小应增加至两倍。这一次，将细胞重新悬浮在两个细胞体积的缓冲液 A 中，然后将细胞悬液转移到适当大小的羽绒组织匀浆器中，并用松散的玻璃杵匀浆细胞悬液，直到 90% 的细胞用 Trian Blue 离心机染色，匀浆细胞在 45 毫升高速离心管中以 25 分钟， 000 乘以 G 和 4 摄氏度在固定角转子中。然后从核沉淀中取出含有胞质蛋白的 SUP 纳脱剂，用盐提取细胞核。
现在加入 2.5 mL 缓冲液 C，但每 3 mL 起始填充细胞体积加入沉淀中。然后使用血清移液管，将沉淀从管壁上移出，并将整个混合物转移到适当大小的羽绒均质器中。用松散的杵敲击两次将混合物均质化，以复苏悬浮细胞核，然后将重悬的 nu 核部分转移到冷冻的烧杯中，该烧杯的大小使悬浮液将填充烧杯至至少 0.5 厘米深。
接下来，根据以下公式计算使溶液达到 0.42 mol 氯化钠的最终浓度所需的 5 mol 氯化钠的体积。现在逐渐逐滴加入计算体积的盐溶液，同时用玻璃棒在冰上轻轻地簇洒悬浮液，以增加悬浮液的盐浓度，直到氯化钠全部加入，溶液变得非常粘稠。然后小心地将粘性悬浮液转移到 70 毫升聚碳酸酯管中，装在 45 型 TI 转子中，并使用调节器在 4 摄氏度下缓慢摇动密封管 30 分钟后，在 TI 45 转子中以 40， 000 倍 G 和 4 摄氏度超速离心 30 分钟， 并将含有上清液的核提取物拉入单个塑料容器中。
然后将核提取物溶液分成大小方便的等分试样，在液氮中冷冻并储存在零下 80 摄氏度。为了制备用于免疫纯化的 Anti-Flag aros，首先使用 200 μL 移液器，将 50% Anti-Flag aros 珠浆中的 200 μL 转移到 1.5 mL微量离心管中。在 4 摄氏度之前，在实验室旋转器上缓慢旋转，将预洗的珠子转移到装有 10 毫升新鲜解冻的核提取物的锥形管中，然后以 1000 倍 G 和 4 摄氏度离心 5 分钟来收集旗子。
接下来，在 10 毫升虱子中洗涤珠子提取物 P，四个 50 缓冲液，在 4 摄氏度下轻轻摇动 5 分钟。然后在旋转珠子提取物混合物后，再次重复使用。将沉淀悬浮在 100 至 150 微升新鲜虱子中 4 50 微升，将珠子转移到 1.5 毫升微量离心管中。
继续用 100 至 150 微升季铵盐 Lysol 50 冲洗 15 毫升锥形管，直到所有珠子都转移到微量离心管中。在微量离心机中旋转珠子后，用 1 毫升 lys 4 50 洗涤 3 次，用 1 毫升 EB 100.Buffer 洗涤 1 次。然后，为了洗脱结合的蛋白质，加入 200 微升含有旗形肽的 EB 100 缓冲液，并在 4 摄氏度下将样品放在坚果上孵育。
半小时后，在您获得的微量离心机中沉淀珠子，然后将含有 OAC C 复合物中洗脱的 SUP natant 转移到新的微量离心管中。再重复 Elucian 四次后，将拉出的洗脱液通过空离心柱，以去除蛋白质组分中残留的 flag aero 珠子。最后，使用截留分子量为 50， 000 的离心超滤装置将所指的蛋白质部分浓缩约 10 倍。
如图所示，使用指示的标志标签亚基制备的 NO 80 复合物的纯度，如刚才所示，可以使用银染 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行评估。出现在该对照泳道中的任何蛋白质都是非特异性结合到 flag aeros 的污染物。这些标记表示与测试的 NO 80 亚基相对应的禁令，这些表示分子量标记物的迁移率。
野生型 NO 80 的位置由黑色方块表示，NO 80 突变体的位置由空心圆圈表示。由黑线分隔的泳道来自单独的凝胶。复合物的组成可以通过 Western blott 使用针对各种 NO 80 亚基的抗体进行评估。
例如。以下是评估了末端末端结构域模块、解旋酶中心相关模块和 SNF 两个模块的亚基。一旦掌握，这项技术可以在一天内完成，从细胞的收获开始，到复合物的纯化结束。
该技术将使研究人员能够纯化哺乳动物细胞的多亚基复合物和亚复合物，以研究它们的功能。观看本视频后，您将更好地了解如何从人细胞或其他动量细胞系中纯化染色质重塑和其他多亚基蛋白复合物。
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概述
本协议概述了一种生成和纯化人类INO80染色质重塑复合物野生型和突变体版本的方法。该过程包括在HEK293细胞中表达带有表位标签的INO80亚基并通过免疫亲和色谱纯化复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 染色质重塑
- 细胞生物学
- 分子生物学技术
背景
- INO80是一个多亚基染色质重塑复合物。
- 了解其亚基组成对于阐明其功能至关重要。
- 染色质重塑复合物在基因调控中发挥重要作用。
- 本协议也可以适用于其他多亚基复合物。
研究目的
- 生成和纯化野生型和突变体INO80复合物。
- 分析这些复合物的亚基组成。
- 研究亚基对整体复合物活性的贡献。
使用的方法
- 从表达带有标签的INO80蛋白的HEK293细胞中分离核。
- 制备核提取物。
- 使用抗Flag亲和色谱纯化INO80复合物。
- 通过蛋白质印迹或银染分析亚基组成。
主要结果
- 成功生成野生型和突变体INO80复合物。
- 复合物纯化显示亚基的有效分离。
- 分析揭示了特定亚基的作用。
- 该方法适用于其他多亚基核复合物。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究INO80复合物。
- 获得的见解可以增强对染色质重塑机制的理解。
- 该方法的适应性允许在核复合物研究中应用更广泛。
常见问题
Executive Industry Relevance
Purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes enables precise dissection of multi-subunit assembly and function, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability is critical for understanding how individual subunits contribute to chromatin remodeling activity, informing predictive confidence in epigenetic target portfolios. The approach provides a reusable platform for interrogating mammalian chromatin remodeling complexes relevant to gene regulation and disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic removal or mutation of subunits to clarify their functional roles in chromatin remodeling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the impact of specific protein components on complex activity.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of epigenetic regulatory pathways.
- Provides a foundation for target validation in chromatin-modifying enzyme programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated multi-subunit complexes for downstream biochemical and functional assays.
- Ensures reproducibility and standardization of complex composition for quantitative screening.
- Enables preparation of wild type and mutant complexes for comparative activity assays.
- Supports assay development for compound screening against chromatin remodeling targets.
Translational & Preclinical Research
- Allows study of disease-relevant mutations or subunit deletions in human chromatin remodeling complexes.
- Provides continuity from molecular mechanism to preclinical model system interrogation.
- Enables alignment of biochemical findings with translational biomarker strategies when supported by downstream assays.
- Supports risk-adjusted advancement of epigenetic targets into preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling mechanistic studies that inform both target validation and assay development for chromatin remodeling complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling isolation and analysis of specific subunit contributions to complex function.
- Screening: Provides standardized, reproducible complexes for quantitative biochemical assays and screening workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry to compare wild type and mutant complexes.
- Translational Research: Facilitates study of disease-relevant subunit alterations in a controlled biochemical context.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for purification of other mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling mechanistic dissection of chromatin remodeling complexes.
- Operational Value: Standardizes purification and analysis workflows for multi-subunit complexes, improving reproducibility.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions by clarifying subunit-specific contributions to complex activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, nuclear extraction, and immunoaffinity purification.
- Needs access to HEK293 cell lines, epitope-tagged constructs, and analytical instrumentation for protein analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization of extraction and purification steps to ensure reproducibility.
- Adaptable to other multi-subunit complexes with appropriate tagging and expression systems.
- Critical dependence on careful salt extraction and handling to preserve complex integrity, as highlighted in the protocol.
