人源INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的生成与纯化
2014年10月23日
本方案描述了生成和纯化人源INO80染色质重塑复合物的野生型及突变型的方法。INO80亚基的表位标签版本在HEK293细胞中稳定表达，并通过免疫亲和层析纯化完整的复合物以及缺失特定亚基组合的复合物。
本实验的目的是生成并纯化野生型和突变型的多亚基INO80染色质重塑复合物。首先从表达FLAG表位标签化INO80蛋白的细胞中分离细胞核；第二步制备核提取物，随后通过抗FLAG亲和层析纯化野生型或突变型人源INO80染色质重塑复合物。最终，可通过Western印迹或银染法分析纯化的INO80复合物的亚基组成。
该方法有助于解答有关多亚基染色质重塑复合物的各个亚基如何影响其整体活性的关键问题。该方法专为研究NO 80染色质重塑复合物的野生型和突变型版本而设计，但也可用于研究其他多亚基核复合物，例如中介复合物（mediator）。
该实验流程中最关键的步骤是细胞核提取步骤。人们通常会遇到问题，原因是在盐提取步骤中，盐的添加速度过快或过于剧烈。在滚瓶中培养后，将 HEC 293 细胞转移至适当大小的带刻度锥形管中，在 1000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。去除上清液后，测量所获得的细胞沉淀体积，然后用相当于细胞沉淀体积 5 倍的缓冲液 A 轻柔吹打重悬细胞沉淀，并将细胞在冰上准确孵育 10 分钟。
再次离心细胞后，第二次测量细胞沉淀，其体积应增大至原来的两倍。此次，将细胞重悬于两倍细胞压实体积的A缓冲液中，然后将细胞悬液转移至适当大小的组织匀浆器中，使用松散的玻璃研杵匀浆细胞悬液，直至90%的细胞台盼蓝染色呈阳性。将匀浆后的细胞转移至45毫升高速离心管中，在4℃条件下，使用固定角转子以25,000 × g离心20分钟。随后，弃去上清液（其中含有胞质蛋白），保留核沉淀，用于后续盐提取细胞核。
向沉淀中加入缓冲液C，每3毫升起始压紧细胞体积加入2.5毫升。然后用血清移液管将沉淀从管壁上刮下，并将整个混合物转移至适当大小的下冲式匀浆器中。用松动的研杵匀浆两次，使细胞核重新悬浮，随后将重悬的核组分转移至一个已预冷的烧杯中，烧杯大小应确保悬浮液深度至少达到0.5厘米。
接下来，根据以下公式计算所需5摩尔氯化钠的体积，以使溶液中氯化钠的终浓度达到0.42摩尔。然后，在冰上用玻璃棒轻轻搅拌悬浮液的同时，逐滴缓慢加入已计算体积的盐溶液，逐步提高悬浮液的盐浓度，直至全部氯化钠加入完毕，溶液变得非常黏稠。随后，将黏稠的悬浮液小心转移至70毫升聚碳酸酯管中，装入45型TI转子并配好管帽组件，使用摇床在4摄氏度下缓慢摇动密封的离心管30分钟。之后，在TI 45转子中以40,000 × g离心30分钟，温度保持在4摄氏度，离心结束后将含有上清液的核提取物收集至一个塑料容器中。
然后将核提取液分装成便于使用的等份，用液氮速冻，并在负80摄氏度下保存。为制备用于免疫纯化的抗Flag琼脂糖珠，首先使用剪去尖端的200微升移液器，将200微升50%抗Flag琼脂糖珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中。将预洗过的珠子转移至含有10毫升新鲜解冻核提取液的锥形管中，在4摄氏度下于实验室旋转仪上缓慢旋转孵育数小时，然后在4摄氏度、1000 × g 条件下离心5分钟，收集Flag琼脂糖珠。
接下来，在突变仪上，于4°C下用10毫升裂解液IV 50缓冲液轻柔振荡洗涤珠子提取物P，持续5分钟。然后离心沉淀珠子提取物混合物，再次回收使用。将沉淀重悬于100至150微升新鲜裂解液IV 50中，将珠子转移至1.5毫升微量离心管中。
继续用100至150 µL Lysol 50反复冲洗15 mL锥形管，直至所有珠粒转移至微量离心管中。在微量离心机中离心沉淀珠粒后，用1 mL Lys Four 50洗涤三次，再用1 mL EB 100缓冲液洗涤一次。随后，为洗脱结合的蛋白质，加入含有flag肽的200 µL EB 100缓冲液，并将样品在4°C下于振荡仪上孵育。
半小时后，将微离心管中的珠子在微型离心机中离心沉淀，然后将含有洗脱下来的OAC C复合物的上清液转移至新的微离心管中。重复洗脱步骤四次后，将收集的洗脱液通过一个空的旋转柱，以去除蛋白组分中残留的flag磁珠。最后，使用截留分子量为50,000的离心超滤装置，将目标蛋白组分浓缩约10倍。
如图所示，可通过银染SDS聚丙烯酰胺凝胶评估使用指定Flag标签亚基制备的NO 80复合物的纯度（如上所述）。该对照泳道中出现的任何蛋白质均为非特异性结合Flag琼脂糖的污染物。这些标签指示对应于所检测NO 80亚基的条带，而这些标签指示分子量标记物的迁移位置。
野生型NO 80的位置由黑色方块表示，NO 80突变体的位置由空心圆圈表示。被黑线分隔的泳道来自不同的凝胶。可通过使用针对不同NO 80亚基的抗体进行蛋白质印迹（Western blot）来评估复合物的组成。
例如，本研究评估了末端结构域模块、解旋酶中心相关模块以及SNF2模块的亚基。一旦掌握该技术，从细胞收获开始到复合物纯化结束，可在一天内完成。
该技术将使研究人员能够纯化哺乳动物细胞中的多亚基复合物及亚复合物，以研究其功能。观看本视频后，您将更好地掌握如何从人类细胞或其他哺乳动物细胞系中纯化染色质重塑及其他多亚基蛋白质复合物。
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概述
本方案概述了一种生成和纯化人源INO80染色质重塑复合物野生型及突变型的方法。该过程包括在HEK293细胞中表达带有表位标签的INO80亚基，并通过免疫亲和层析纯化复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 染色质重塑
- 细胞生物学
- 分子生物学技术
背景
- INO80 是一种多亚基染色质重塑复合物。
- 了解其亚基组成对于阐明其功能至关重要。
- 染色质重塑复合物在基因调控中发挥重要作用。
- 本方案也可适用于其他多亚基复合物。
研究目的
- 制备并纯化野生型和突变型 INO80 复合物。
- 分析这些复合物的亚基组成。
- 研究各亚基对复合物整体活性的贡献。
使用的方法
- 从表达带标签INO80蛋白的HEK293细胞中分离细胞核。
- 制备核提取物。
- 利用抗Flag亲和层析纯化INO80复合物。
- 通过Western印迹或银染分析亚基组成。
主要结果
- 成功生成野生型和突变型 INO80 复合物。
- 复合物的纯化表明各亚基得到有效分离。
- 分析揭示了特定亚基功能的新见解。
- 该方法适用于其他多亚基核复合物。
结论
- 该方案为研究INO80复合物提供了一种可靠的方法。
- 获得的见解可增进对染色质重塑机制的理解。
- 该方法具有良好的适应性，可在核复合物研究中实现更广泛的应用。
常见问题
行业应用价值
纯化人源INO80染色质重塑复合物及其亚复合物，可实现对多亚基组装与功能的精确解析，直接支持早期发现阶段的靶点验证和机制去风险化。该能力对于理解各个亚基如何贡献于染色质重塑活性至关重要，有助于提升表观遗传靶点组合的预测可信度。该方法为研究与基因调控和疾病生物学相关的哺乳动物染色质重塑复合物提供了一个可重复使用的平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过系统性地移除或突变亚基，阐明其在染色质重塑中的功能作用。
- 通过分离特定蛋白质组分对复合物活性的影响，支持机制层面的风险排除。
- 促进对表观遗传调控通路的假设驱动式探究。
- 为染色质修饰酶项目的靶点验证提供基础。
筛选与检测方法开发
- 为下游生化和功能检测生成经过验证的多亚基复合物。
- 确保复合物组成的可重复性和标准化，用于定量筛选。
- 可制备野生型和突变型复合物，用于比较性活性检测。
- 支持针对染色质重塑靶点的化合物筛选检测方法的开发。
转化与临床前研究
- 可研究人类染色质重塑复合物中与疾病相关的突变或亚基缺失。
- 实现了从分子机制到临床前模型系统验证的连贯性。
- 在下游检测支持下，可将生化研究结果与转化生物标志物策略相整合。
- 支持基于风险评估推进表观遗传靶点进入临床前验证阶段。
流程与工作流整合
该方法整合了早期发现与先导物鉴定之间的界面，能够开展机制性研究，从而为染色质重塑复合物的靶点验证和检测方法开发提供依据。
- 发现生物学：通过实现对复杂功能中特定亚基作用的分离与分析，支持假设验证。
- 筛选：提供标准化且可重复的复合物，用于定量生化检测和筛选工作流程。
- 分析：通过免疫印迹、银染和质谱分析提供定量读数，以比较野生型与突变型复合物。
- 转化研究：在受控的生化环境中促进对疾病相关亚基改变的研究。
- 企业级复用：可调整的实验方案，适用于纯化其他哺乳动物多亚基染色质重塑和修饰复合物。
运营与企业影响
- 科学价值：通过解析染色质重塑复合物的作用机制，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化多亚基复合物的纯化与分析流程，提升实验可重复性。
- 战略价值：明确各亚基对复合物活性的特异性贡献，支持科学的立项/终止决策。
- 项目组合影响：基于机制性认知，实现对表观遗传靶点的风险校正优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备哺乳动物细胞培养、核提取和免疫亲和纯化的专业技术。
- 需要获得HEK293细胞系、表位标签表达载体以及用于蛋白质分析的分析仪器。
- 要求各研究团队在提取和纯化步骤上进行严格统一，以确保实验可重复性。
- 通过适当的标签标记和表达系统，该方法可适用于其他多亚基复合物的研究。
- 如实验方案中所强调，该方法的关键在于谨慎进行盐溶液提取和操作，以维持复合物的完整性。
