Name: 产生和人类INO80染色质重塑复合物及其亚纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 了解利用HEK293细胞表达Flag标签INO80蛋白，通过免疫亲和层析纯化野生型和突变型人类INO80染色质重塑复合物的方法。该技术可用于分析亚基组成并研究染色质重塑机制。

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作者实验室的工作得到了美国普通医学科学研究所（GM41628）资助以及堪萨斯城大社区基金会海伦·尼尔森医学研究基金对斯托尔斯医学研究所的资助。

1. 表达全长或突变型 FLAG 表位标签 Ino80 或其他 INO80 复合物亚基的 HEK293 稳定细胞系的构建与培养
<ol>
	<li>将编码全长或突变型人源 Ino80 ATP 酶或其他 INO80 亚基的 cDNA 克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA5/FRT 中，确保其带有同读框的 N 端 FLAG 表位标签。</li>
	<li>在进行后续实验前，通过 DNA 测序确认插入的 cDNA 序列正确无误。</li>
	<li>进行转染时，将 Flp-In HEK293 细胞在含 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）、5% 谷氨酰胺和 10% FBS（胎牛血清）的培养基中，于 10 cm 组织培养皿中培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 70% 时，向每个组织培养皿中加入 800 μl 的混合液，其中包含 40 µl FuGENE6 转染试剂、0.5 µg 相应的 pcDNA5/FRT 表达质粒以及 9.5 µg 编码 Flp 重组酶的 pOG44 质粒。</li>
	<li>48 小时后，用胰酶消化细胞，并以 1:30 的比例分种至新的 10 cm 培养皿中，在含 5% 谷氨酰胺、10% FBS 和 100 µg/ml 潮霉素 B 的 DMEM 培养基中继续培养 3–4 周。当培养基开始变黄时（通常每 3–5 天）更换新鲜培养基。</li>
	<li>为筛选表达 FLAG 标签蛋白水平最高的阳性克隆，挑取单个抗潮霉素 B 的菌落，并转移至 24 孔板中的单个孔内。
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到 80% 时，用约 1 ml PBS 收集每孔细胞，于 1,000 × g 离心 5 分钟后收集细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 60 µl SDS-PAGE 上样缓冲液中。</li>
		<li>取一半重悬液进行 SDS-PAGE 电泳及蛋白质印迹分析，以检测 FLAG 标签诱饵蛋白的表达情况；保留另一半样品用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若在细胞裂解物中未检测到 FLAG 标签的人源 Ino80 蛋白，则将初始单克隆细胞群体进一步扩增：将 24 孔板中单孔的细胞接种至 15 cm 组织培养皿中继续培养。
	<ol>
		<li>从 15 cm 培养皿中收集细胞时，用冰预冷的 PBS 重悬接近融合的细胞，并转移至 50 ml 圆底离心管中。</li>
		<li>加入 PBS 至终体积为 50 ml。</li>
		<li>在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞沉淀，并尽可能彻底去除上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 1 ml Lys450 缓冲液（20 mM HEPES-NaOH pH 7.9，450 mM NaCl，0.5% TritonX-100，10 mM KCl，4 mM MgCl2，0.2 mM EDTA，10% 甘油，1 mM DTT，200 µM PMSF 和 1:1,000 蛋白酶抑制剂混合液）中。 
		注：此处及后文中，DTT、PMSF 和蛋白酶抑制剂混合液均应在实验开始前立即加入缓冲液中。</li>
		<li>使用 20 µl 抗 FLAG 琼脂糖凝胶从所得全细胞裂解物中免疫沉淀 FLAG 标签蛋白，并通过蛋白质印迹分析 FLAG 洗脱物。[免疫沉淀操作的详细步骤见第 5 步。]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备所需单克隆细胞系的冻存样本12，并储存于液氮中备用。</li>
</ol>
2. 在旋转瓶中培养 HEK293 细胞系
为大规模制备INO80复合物，需在10至20个滚瓶中培养细胞；每个滚瓶通常可获得约1 ml的紧实细胞沉淀。
<ol>
	<li>向每个滚瓶中加入 200 ml DMEM、5% 谷氨酰胺和 10% 小牛血清，不添加潮霉素 B。</li>
	<li>将一个接近汇合的 15 cm 培养皿中的全部细胞转移至每个滚瓶中。</li>
	<li>将滚瓶放入 37 °C 滚瓶培养箱中，以 0.2 rpm 的速度旋转培养。</li>
	<li>当细胞达到约 70% 汇合度时，倾去并弃除培养基。</li>
	<li>向每个瓶中加入约 50 ml 冰冷的 PBS。将瓶子水平持握，轻轻晃动以松动细胞单层。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至 250 ml 塑料锥形瓶中，并置于冰上。</li>
	<li>用额外的 PBS 冲洗滚瓶，将冲洗液依次从一个瓶转移到下一个瓶。当冲洗液不再澄清时（通常在用于冲洗约 5 个瓶子后），将其加入细胞悬液中。</li>
	<li>在 400 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用 PBS 轻轻重悬细胞，合并至一个 250 ml 锥形瓶中，并保持在冰上，直至进一步处理。</li>
</ol>
3. 在表达另一种FLAG标签INO80亚基的细胞中通过siRNA介导敲低INO80亚基
为了获得缺失单个亚基的INO80亚复合物，可采用FLAG免疫纯化方法，从经siRNA处理的细胞或稳定表达shRNA的细胞中纯化INO80复合物。此处所述的“反向”siRNA（小干扰RNA）转染方案已针对在15 cm培养皿中生长的HEK293细胞进行优化。该方案适用于单个15 cm培养皿的细胞，应根据所需细胞数量相应放大。为了从siRNA处理的细胞中制备出具有生化应用价值的INO80复合物量，需将培养规模扩大至40个15 cm培养皿；这些培养物将产生约2 - 4 ml的压紧细胞沉淀。
<ol>
	<li>在15 cm培养皿中将稳定表达INO80复合物目标亚基的HEK293细胞培养至接近汇合状态。</li>
	<li>向含有冻干siRNA的离心管中加入适量的siRNA重悬缓冲液（20 mM KCl、6 mM HEPES-pH 7.5和0.2 mM MgCl2），以配制终浓度为50 µM的siRNA储备液。用移液器轻轻吹打数次，并在室温下于旋转仪上孵育30分钟，确保siRNA完全溶解。</li>
	<li>配制含有siRNA和转染试剂的转染混合液。取10 μl 50 µM的siRNA储备液与32 μl Lipofectamine RNAiMAX混合，加入4 ml Opti-MEM低血清培养基中，轻轻混匀；所有试剂使用前需平衡至室温。</li>
	<li>在室温下孵育该混合液30分钟。</li>
	<li>准备用于转染的Flp-In HEK293细胞（稳定表达目标INO80亚基）。
	<ol>
		<li>在步骤3.4孵育期间，用室温PBS洗涤15 cm培养皿中的细胞一次。</li>
		<li>吸除PBS后，加入1 ml胰蛋白酶消化液，直至细胞开始从培养皿表面脱落。</li>
		<li>立即向消化后的细胞中加入10 ml完全培养基（DMEM + 5%谷氨酰胺 + 10%胎牛血清），轻轻混匀。在室温下以1,000 × g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于约4 ml完全培养基中，使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数。</li>
		<li>用完全培养基将细胞稀释至浓度约为5.4 × 106/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个15 cm培养皿中加入15 ml完全培养基，随后加入4 ml转染混合液，轻轻摇晃使培养基与转染混合液充分混匀。最后加入1 ml细胞悬液，并再次轻轻摇晃使细胞均匀分布。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中培养60小时后，轻轻吸除培养基，用预冷的PBS重悬细胞，并立即进行核提取物的制备。</li>
</ol>
4. 核提取物的制备
本实验步骤经 Dignam 方案13 修改而来，可根据起始细胞沉淀的量进行放大或缩小。通常情况下，1 ml 紧密细胞沉淀可获得 1 ml 最终核提取物。所有缓冲液应预冷至冰上温度，所有操作步骤均需在冷室中进行；若无合适的冷室，则需在冰上操作。
<ol>
	<li>细胞核的分离：
	<ol>
		<li>将细胞轻轻转移至适当大小（15 或 50 ml）的刻度锥形管中，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并测量压紧细胞沉淀的体积。1 ml 压紧的细胞相当于约 3 × 108 个 HEK293 细胞。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入 5 倍体积的缓冲液 A（10 mM HEPES，pH 7.9，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，并新鲜添加 1 mM DTT、200 µM PMSF 和 1:1,000 蛋白酶抑制剂混合物）。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。</li>
		<li>在冰上准确孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
		<li>在缓冲液 A 中孵育期间，细胞沉淀的体积应最多增加至原来的 2 倍。</li>
		<li>用相当于 2 倍压紧细胞体积的缓冲液 A 重悬细胞，然后将细胞悬液转移至适当大小的 Dounce 组织匀浆器中。若起始压紧细胞体积小于 2 ml，使用 7 ml 匀浆器；若为 2–4 ml，使用 15 ml 匀浆器；若为 10 ml 或更多，使用 40 ml 匀浆器。</li>
		<li>使用 Dounce 匀浆器的松动玻璃杵进行匀浆，直至 90% 的细胞可被 1% 台盼蓝染色阳性。</li>
		<li>将悬液转移至 45 ml 高速离心管中，在 JA-17 或类似转子中于 4 °C 以 25,000 × g 离心 20 分钟（参见 材料/设备表）。</li>
		<li>从细胞核沉淀中弃去上清液，该上清液含有胞质蛋白或在分级过程中从细胞核泄漏出的蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用盐提取细胞核：
	<ol>
		<li>向细胞核沉淀中加入缓冲液 C（20 mM HEPES，pH 7.9，25% 甘油，1.5 mM MgCl2，0.2 mM EDTA，并新鲜添加 1 mM DTT、200 µM PMSF 和 1:1,000 蛋白酶抑制剂混合物）；每 3 ml 起始压紧细胞体积（约 1 × 109 个细胞）使用 2.5 ml 缓冲液 C。</li>
		<li>使用玻璃棒或移液器将细胞核沉淀从管壁上刮下，并将整个混合物转移至适当大小的 Dounce 匀浆器中。</li>
		<li>使用松动杵匀浆两次，以重悬细胞核。</li>
		<li>将重悬的细胞核组分转移至预冷的烧杯中。选择烧杯时应确保悬液体积至少达到 0.5 cm 深度。</li>
		<li>为从染色质或其他不溶性结构中提取细胞核蛋白，需在冰上轻轻搅拌的同时逐滴加入 5 M NaCl，逐步将悬液的盐浓度提高至 0.42 M NaCl；当所有 5 M NaCl 加入后，溶液应变得非常黏稠或呈凝胶状。根据以下公式计算将溶液终浓度调至 0.42 M NaCl 所需的 5 M NaCl 体积： 
		<img alt="NaCl 浓度计算公式；体积=初始细胞体积+步骤 4.2.1 中缓冲液 C 体积/10.9；化学计算。" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>小心地将黏稠悬液转移至适用于 Type 70.1 Ti 转子（或等效型号）的 10 ml 聚碳酸酯管，或适用于 Type 45 Ti 或类似转子的 70 ml 聚碳酸酯瓶中（参见材料/设备表）。若使用 10 ml 管，请用封口膜密封；若使用 70 ml 瓶，请用盖组件密封。</li>
		<li>将密封的管子在 4 °C 条件下使用旋转摇床缓慢摇动 30 分钟。</li>
		<li>在 Type 45 Ti 或 70.1 Ti 转子中于 4 °C 以 120,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至一个塑料管或瓶中。此上清液即为细胞核提取物，沉淀则含有染色质及其他细胞核碎片。</li>
		<li>将细胞核提取物分装为合适体积的等份，用液氮速冻后于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 人INO80或INO80亚复合物的免疫亲和纯化
<ol>
	<li>解冻冷冻的核提取物时，将装有提取物的离心管置于实验台面上或用手掌轻轻滚动，直至冻存物质变为浆状。随后将离心管置于冰上或冷室中，直至提取物完全解冻。</li>
	<li>将解冻后的核提取物转移至10 ml聚碳酸酯超速离心管中，在4 °C条件下，使用Type 70.1 Ti转子或同等型号转子于100,000 × g离心20分钟，以去除冻融过程中可能形成的沉淀物。</li>
	<li>将上清液转移至15 ml锥形管中。加入新鲜的DTT、PMSF和蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度分别为1 mM DTT、200 µM PMSF和1:1,000的蛋白酶抑制剂混合物。</li>
	<li>为准备用于免疫纯化的抗FLAG琼脂糖凝胶，使用P200或类似移液器（枪头末端用洁净的手术刀片或剃须刀片切去一段）将200 µl的50%抗FLAG琼脂糖珠悬液转移至1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在台式微量离心机中以8,000 × g离心30秒使珠子沉淀，弃去上清液。用1 ml Lys450缓冲液重悬珠子进行洗涤，再以8,000 × g离心30秒收集珠子。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>使用P200或类似可调移液器（枪头末端已切去）将洗涤后的抗FLAG琼脂糖珠重悬于约100 µl核提取物中，并用同一枪头将重悬的珠子转移至含有提取物的15 ml锥形管中。重复操作数次，直至所有珠子均转移至15 ml管中。</li>
	<li>将提取物与珠子的混合物在4 °C下于旋转仪上缓慢旋转孵育4小时。可选：加入终浓度为25单位/ml的苯甲酸酶（benzonase），以去除污染的DNA。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心5分钟收集FLAG琼脂糖珠。</li>
	<li>用10 ml Lys450缓冲液重悬珠子进行洗涤，在4 °C下于摇床上轻柔振荡孵育5分钟。然后在4 °C下以1,000 × g离心5分钟收集珠子。</li>
	<li>用100–150 µl Lys450缓冲液重悬珠子，并转移至1.5 ml微量离心管中。继续用100–150 µl Lys450缓冲液冲洗15 ml锥形管，直至所有珠子均转移至微量离心管中。</li>
	<li>在微量离心机中于4 °C以8,000 × g离心30秒使珠子沉淀。随后用1 ml Lys450缓冲液洗涤三次，再用1 ml EB100缓冲液（10 mM HEPES pH 7.9，10%甘油，100 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，0.05% Triton X-100，并新鲜添加1 mM DTT、200 µM PMSF和1:1,000蛋白酶抑制剂混合物）洗涤一次。</li>
	<li>为洗脱结合的蛋白质，加入含0.25 mg/ml 1× FLAG多肽的200 µl EB100缓冲液。在4 °C下于摇床上孵育30分钟，每次孵育后轻轻振荡。</li>
	<li>在微量离心机中于4 °C以8,000 × g离心30秒使珠子沉淀。将含有洗脱的INO80复合物的上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>重复洗脱步骤四次，并将所有上清液合并至同一管中。</li>
	<li>为去除洗脱蛋白组分中残留的FLAG-琼脂糖珠，将洗脱液通过一个空的离心柱过滤。</li>
	<li>使用超滤离心装置（分子量截留值为50,000）将洗脱的蛋白组分浓缩约10倍。</li>
	<li>为去除FLAG多肽，将浓缩后的蛋白组分依次通过两个脱盐柱。</li>
	<li>将纯化并脱盐后的蛋白组分分装为20 µl等份，用液氮速冻后于-80 °C保存。</li>
	<li>通过银染凝胶或Western blot分析INO80或INO80亚复合物的亚基组成，并利用已知浓度的重组INO80亚基作为标准品，通过半定量Western blot估算其浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

来自高等真核生物的多亚基哺乳动物染色质重塑复合物的结构与功能研究，一直受到难以制备出足够生化用量的突变亚基复合物或完全缺失特定亚基的复合物的限制。这一领域存在若干技术障碍：首先，在哺乳动物细胞中进行遗传操作在技术上具有挑战性且耗时较长。与酵母细胞不同，后者的基因组可通过重组工程技术轻松编辑和靶向，而哺乳动物基因组结构更为复杂，对重组工程技术的敏感性较低。因此，在培养细胞或动物中删除或修饰哺乳动物基因的过程更加耗时，并需要更专业的技术 expertise。结果，携带结构突变或缺失部分亚基的突变型哺乳动物复合物的构建成为研究的限速步骤。其次，利用异源蛋白表达系统进行生化重建的方法常用于生成明确的多蛋白组装体。然而，对于非常大的复合物而言，这类方法在技术上面临困难，因为其亚基可能需要以正确的化学计量比同时表达，和/或在特定顺序下组装，并依赖特定的分子伴侣或辅助因子协助。这些问题在INO80复合物的研究中尤为突出，因为其Ino80 ATP酶亚基在昆虫细胞或E. coli细胞中难以以生化可用的量有效表达。在对INO80染色质重塑复合物的研究中，采用本实验方案所述策略可部分克服上述挑战。
<p class="jove_co...

在进化上保守的SNF2家族染色质重塑复合物是染色质结构组织和DNA可及性的关键调控因子1。这些重塑复合物通常包含一个核心的SNF2样ATP酶亚基，在某些情况下，该亚基会与多种辅助蛋白组装，形成多亚基的大分子复合物。为了研究ATP依赖性染色质重塑过程的分子机制，理解特定亚基组合和/或结构域对复合物功能的贡献至关重要。此类分析需要能够制备出高度纯化的突变型复合物，即缺失特定蛋白亚基或结构域的复合物。
以往对ATP依赖性染色质重塑复合物的结构-功能研究广泛集中于酵母模型系统，原因是酵母基因组具有优越的可操作性（例如，参见文献1-4）。鉴于同源重塑复合物在亚基组成和功能上的保守性，对酵母重塑复合物结构与功能的研究为理解高等真核生物中相应复合物提供了重要启示。然而，不同物种间的重塑复合物确实存在显著的特异性差异，这些差异源于物种特异性亚基的获得或丢失、保守亚基中物种特异性结构域的获得或丢失，以及保守亚基中保守结构域内的序列变异。原则上，这些差异可能是由于高等真核细胞需要适应新的分子和细胞环境所驱动的。因此，理解高等真核生物重塑复合物的各个亚基如何参与核小体重塑过程具有重要价值，因为这不仅有助于阐明ATP依赖性染色质重塑过程的基本机制，还可能为揭示高等真核生物中染色质结构和基因表达调控的机制提供宝贵见解。
迄今为止，对多亚基哺乳动物染色质重塑复合物的结构与功能研究仍十分有限，部分原因在于难以获得生化定义明确的染色质重塑复合物及其亚复合物。我们通过以下所述方法部分克服了这些困难，即利用免疫亲和纯化技术，从稳定表达N端FLAG表位标签的野生型或突变型Ino80蛋白的人源细胞中制备完整的INO80复合物或INO80亚复合物5-7（图1）。为从人源细胞中获得完整的INO80复合物，我们采用Flp介导的重组技术，构建稳定表达FLAG表位标签cDNA的转基因HEK293细胞系，该cDNA编码INO80复合物的各个亚基8-10。由于INO80亚基的过表达可能具有一定的细胞毒性，因此有必要在选择性条件下分离并维持单克隆细胞系，以确保在大规模细胞培养扩增所需的多次传代过程中外源基因的稳定表达。为获得仅包含部分亚基的较小INO80亚复合物，我们成功采用了两种策略（图2A,B）。第一种策略是构建稳定表达缺失特定亚基相互作用所需结构域的Ino80突变体的HEK293 Flp-In细胞系5；另一种策略则是利用siRNA介导的基因敲低技术，去除表达适当FLAG标签INO80亚基的细胞中目标亚基（未发表数据）。最后，为纯化人源INO80复合物，采用基于FLAG琼脂糖的亲和层析方法11，从核提取物中富集含INO80的组分，从而有效减少最终纯化的INO80或INO80亚复合物组分中污染性胞质蛋白的存在。

<table><tbody><tr><td>DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I（稳定型谷氨酰胺）</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B，PBS中无菌溶液</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT 载体</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-重组酶表达载体</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview 红色 ANTI-FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>小牛血清</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA 混合物</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA 重悬缓冲液</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE（胰蛋白酶）</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG 肽段</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>微型 Bio-Spin 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心过滤装置（50k 截留分子量）</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG M2 抗体，小鼠来源</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG M2 抗体，兔来源</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶（benzonase）</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">仪器设备</td></tr><tr><td>J6 离心机中的 JS-4.2 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 聚碳酸酯管</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70 ml 聚碳酸酯瓶</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Type 70.1 Ti 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator 混合器</td><td>BD Diagnostics</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col 试管/小瓶旋转混合器</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪 PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>滚瓶培养箱</td><td>Bellco biotechnology</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL 转印膜 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>润滑型 1.5 ml 微量离心管</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

人源ino80染色质重塑复合物及其亚复合物的生成与纯化

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 染色质重塑复合物通过催化 ATP 依赖的核小体重塑来调控核小体动态性和 DNA 可及性。人类 INO80 复合物由 14 个蛋白质亚基组成，其中包括 Ino80，一种 SNF2 类 ATP 酶，它既是催化亚基，也是复合物组装的支架。其他亚基的功能及其对 INO80 复合物染色质重塑活性贡献的机制仍不清楚，部分原因在于难以在人类细胞或异源表达系统中生成 INO80 亚复合物。本 JoVE 实验方案描述了一种可用于纯化缺失一个或一组亚基的人类 INO80 染色质重塑亚复合物的方法。通过 Flp 介导的重组，将 N 末端带有 FLAG 表位标签的 Ino80 cDNA 稳定地导入人胚肾（HEK）293 细胞系中。若需删除 INO80 复合物中的某组亚基，则表达缺乏这些亚基组装所需平台的突变型 Ino80 蛋白。若需耗竭单个亚基，则将靶向该亚基的 siRNA 转染至稳定表达 FLAG 标签 Ino80 ATP 酶的 HEK 293 细胞系中。制备核提取物后，进行 FLAG 免疫沉淀，以富集含有 Ino80 衍生物的蛋白组分。随后可通过免疫印迹、银染及质谱等方法分析纯化的 INO80 亚复合物的组成。根据本实验方案生成的 INO80 及其亚复合物可进一步用于多种生化分析，相关方法详见配套的 JoVE 实验方案。此处描述的方法可适用于研究任何哺乳动物多亚基染色质重塑和修饰复合物的结构与功能特性。

图1 展示了一个流程图，总结了用于生成、纯化和表征人源INO80依赖ATP的染色质重塑复合物的实验步骤。
如图2和图3所示，这些方法可用于生成野生型INO80以及缺失不同亚基的INO80亚复合物，从而进一步对这些缺失亚基对INO80酶活性的贡献进行生化分析。图2描述了我们用于解析INO80复合物结构并生成INO80亚复合物的两种策略。第一种策略如图2A所示，通过带有FLAG标签的野生型亚基（Ies2或INO80E）纯化完整的INO80复合物。而亚复合物则可通过表达缺失特定结构域的突变型Ino80蛋白（这些结构域是不同亚基组装所依赖的位点）并进行表位标签纯化获得。如图3A所示，通过银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶评估所得复合物的纯度，而复合物的组成则通过针对不同INO80亚基的抗体进行Western印迹分析（图3B）或质谱分析（数据未显示）加以确认。采用该...

本方案描述了生成和纯化人源INO80染色质重塑复合物的野生型及突变型的方法。INO80亚基的表位标签版本在HEK293细胞中稳定表达，并通过免疫亲和层析纯化完整的复合物以及缺失特定亚基组合的复合物。

人源INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的生成与纯化

INO80 染色质重塑复合物通过催化 ATP 依赖性的核小体重塑，调控核小体动态性和 DNA 可及性。人类 INO80...

本实验的目的是生成并纯化野生型和突变型的多亚基INO80染色质重塑复合物。首先从表达FLAG表位标签化INO80蛋白的细胞中分离细胞核；第二步制备核提取物，随后通过抗FLAG亲和层析纯化野生型或突变型人源INO80染色质重塑复合物。最终，可通过Western印迹或银染法分析纯化的INO80复合物的亚基组成。该方法有助于解答有关多亚基染色质重塑复合物的各个亚基如何影响其整体活性的关键问题。该方法专为研究NO 80染色质重塑复合物的野生型和突变型版本而设计，但也可用于研究其他多亚基核复合物，例如中介复合物（mediator）。该实验流程中最关键的步骤是细胞核提取步骤。人们通常会遇到问题，原因是在盐提取步骤中，盐的添加速度过快或过于剧烈。在滚瓶中培养后，将 HEC 293 细胞转移至适当大小的带刻度锥形管中，在 1000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。去除上清液后，测量所获得的细胞沉淀体积，然后用相当于细胞沉淀体积 5 倍的缓冲液 A 轻柔吹打重悬细胞沉淀，并将细胞在冰上准确孵育 10 分钟。再次离心细胞后，第二次测量细胞沉淀，其体积应增大至原来的两倍。此次，将细胞重悬于两倍细胞压实体积的A缓冲液中，然后将细胞悬液转移至适当大小的组织匀浆器中，使用松散的玻璃研杵匀浆细胞悬液，直至90%的细胞台盼蓝染色呈阳性。将匀浆后的细胞转移至45毫升高速离心管中，在4℃条件下，使用固定角转子以25,000 × g离心20分钟。随后，弃去上清液（其中含有胞质蛋白），保留核沉淀，用于后续盐提取细胞核。向沉淀中加入缓冲液C，每3毫升起始压紧细胞体积加入2.5毫升。然后用血清移液管将沉淀从管壁上刮下，并将整个混合物转移至适当大小的下冲式匀浆器中。用松动的研杵匀浆两次，使细胞核重新悬浮，随后将重悬的核组分转移至一个已预冷的烧杯中，烧杯大小应确保悬浮液深度至少达到0.5厘米。接下来，根据以下公式计算所需5摩尔氯化钠的体积，以使溶液中氯化钠的终浓度达到0.42摩尔。然后，在冰上用玻璃棒轻轻搅拌悬浮液的同时，逐滴缓慢加入已计算体积的盐溶液，逐步提高悬浮液的盐浓度，直至全部氯化钠加入完毕，溶液变得非常黏稠。随后，将黏稠的悬浮液小心转移至70毫升聚碳酸酯管中，装入45型TI转子并配好管帽组件，使用摇床在4摄氏度下缓慢摇动密封的离心管30分钟。之后，在TI 45转子中以40,000 × g离心30分钟，温度保持在4摄氏度，离心结束后将含有上清液的核提取物收集至一个塑料容器中。然后将核提取液分装成便于使用的等份，用液氮速冻，并在负80摄氏度下保存。为制备用于免疫纯化的抗Flag琼脂糖珠，首先使用剪去尖端的200微升移液器，将200微升50%抗Flag琼脂糖珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中。将预洗过的珠子转移至含有10毫升新鲜解冻核提取液的锥形管中，在4摄氏度下于实验室旋转仪上缓慢旋转孵育数小时，然后在4摄氏度、1000 × g 条件下离心5分钟，收集Flag琼脂糖珠。接下来，在突变仪上，于4°C下用10毫升裂解液IV 50缓冲液轻柔振荡洗涤珠子提取物P，持续5分钟。然后离心沉淀珠子提取物混合物，再次回收使用。将沉淀重悬于100至150微升新鲜裂解液IV 50中，将珠子转移至1.5毫升微量离心管中。继续用100至150 µL Lysol 50反复冲洗15 mL锥形管，直至所有珠粒转移至微量离心管中。在微量离心机中离心沉淀珠粒后，用1 mL Lys Four 50洗涤三次，再用1 mL EB 100缓冲液洗涤一次。随后，为洗脱结合的蛋白质，加入含有flag肽的200 µL EB 100缓冲液，并将样品在4°C下于振荡仪上孵育。半小时后，将微离心管中的珠子在微型离心机中离心沉淀，然后将含有洗脱下来的OAC C复合物的上清液转移至新的微离心管中。重复洗脱步骤四次后，将收集的洗脱液通过一个空的旋转柱，以去除蛋白组分中残留的flag磁珠。最后，使用截留分子量为50,000的离心超滤装置，将目标蛋白组分浓缩约10倍。如图所示，可通过银染SDS聚丙烯酰胺凝胶评估使用指定Flag标签亚基制备的NO 80复合物的纯度（如上所述）。该对照泳道中出现的任何蛋白质均为非特异性结合Flag琼脂糖的污染物。这些标签指示对应于所检测NO 80亚基的条带，而这些标签指示分子量标记物的迁移位置。野生型NO 80的位置由黑色方块表示，NO 80突变体的位置由空心圆圈表示。被黑线分隔的泳道来自不同的凝胶。可通过使用针对不同NO 80亚基的抗体进行蛋白质印迹（Western blot）来评估复合物的组成。例如，本研究评估了末端结构域模块、解旋酶中心相关模块以及SNF2模块的亚基。一旦掌握该技术，从细胞收获开始到复合物纯化结束，可在一天内完成。该技术将使研究人员能够纯化哺乳动物细胞中的多亚基复合物及亚复合物，以研究其功能。观看本视频后，您将更好地掌握如何从人类细胞或其他哺乳动物细胞系中纯化染色质重塑及其他多亚基蛋白质复合物。

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科研

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生物学

产生和人类INO80染色质重塑复合物及其亚纯化

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。...

使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP...

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。...

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。...

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

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染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。...

用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

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从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

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单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

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人源INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的生成与纯化

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