Name: 生化分析的分析ATP依赖的染色质重塑酶活性的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习使用电泳迁移率变动分析和薄层色谱法测定ATP依赖的染色质重塑复合物的核小体滑动、结合活性及ATP酶活性。该方法适用于研究INO80等复合物的生化功能。

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作者实验室的工作得到了美国普通医学科学研究所（GM41628）资助以及堪萨斯城大社区基金会海伦·尼尔森医学研究基金对斯托尔斯医学研究所的资助。

1. ATP依赖性核小体重塑实验
为了检测ATP依赖的核小体重塑活性，将免疫纯化的INO80或INO80亚复合物与ATP以及单核小体底物共同孵育，该底物包含一个定位在216 bp、32P标记的DNA片段一端的单个核小体。反应产物随后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析。
<ol>
	<li>为制备32P标记的“601”DNA片段，以pGEM-3Z-6014为模板，使用引物5′-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG（正向）和5′-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG（反向），扩增一段包含末端定位的601核小体定位序列的216 bp DNA片段。
	<ol>
		<li>按照表1所述配制100 μl PCR反应体系。</li>
		<li>在PCR仪中进行扩增，程序如下：96 °C预变性1 min；随后进行30个循环：94 °C变性45 sec，57 °C退火30 sec，72 °C延伸60 sec；最后72 °C终延伸7 min。</li>
		<li>PCR反应结束后，将反应产物通过无核酸酶的离心柱纯化两次，以去除未掺入的核苷酸。</li>
		<li>取5 μl纯化后的PCR产物，在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，确认是否成功扩增出约216 bp的目标DNA片段。</li>
		<li>将5 μl纯化后的PCR产物稀释20倍，使用紫外分光光度计测定DNA浓度。平均产量约为~40 ng/μl。</li>
		<li>使用液体闪烁计数器测定1 μl纯化PCR产物的放射活性，通过计算cpm/ng评估标记效率。成功的标记反应应获得约15,000 cpm/ng的601 DNA片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用连续稀释法将Hela细胞核小体转移至标记的601 DNA上5。
	<ol>
		<li>将2 pmol的32P标记601 DNA片段与6 µg Hela核小体（制备方法见文献5）混合于50 µl缓冲液中，缓冲液组成为1.0 M NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF和1 mM DTT，30 °C孵育30 min。</li>
		<li>依次加入12.5 µl、20.8 µl和41.6 µl的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF和1 mM DTT缓冲液，将混合物逐步稀释至0.8 M、0.6 M和0.4 M NaCl，每次稀释后均在30 °C孵育30 min。</li>
		<li>再加入125 µl、然后250 µl含有0.1% Nonidet P-40、20%甘油和200 µg/ml BSA的相同缓冲液，将混合物进一步稀释至0.2 M和0.1 M NaCl，两次稀释之间在30 °C孵育30 min。单核小体底物可于4 °C保存最多3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在总体积为10 µl的反应体系中进行ATP依赖性核小体滑动反应。反应组分见表2。由于INO80核小体重塑活性的最适NaCl浓度约为50 mM NaCl（未发表结果），需根据核小体和酶制剂中所含NaCl量，将各反应体系中的总NaCl浓度调整至50 mM。
	<ol>
		<li>在开始设置反应前，灌制天然聚丙烯酰胺凝胶（18 × 16 cm）。配制单块含5%丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 37.5:1）、0.5× TBE（45 mM Tris硼酸，1 mM EDTA）、0.01%过硫酸铵（APS）和0.001% N,N,N´,N´-四甲基乙二胺（TEMED）的凝胶，混合表3所列组分，室温下聚合至少2小时。</li>
		<li>同时，为每个反应在预冷的硅化1.5 ml微量离心管中加入约20 nM INO80或INO80亚复合物（制备方法见文献3），并加入适量EB100缓冲液（表4），使总体积达4.75 μl。剩余含INO80的组分应立即用粉末干冰或液氮速冻保存。</li>
		<li>将其余组分配制成主混合液（master cocktail），按“X”倍放大（X = 总反应数 + 3）。单个10 μl反应所需各组分的量见表5；根据实际反应数量按比例放大配制。通过轻弹管壁或移液器吹打充分混匀，并在台式微量离心机中短暂离心数秒。</li>
		<li>将5.25 µl主混合液分别加入步骤1.3.2中已准备好的各反应管中，吹打混匀。将反应管转移至30 °C金属浴或水浴中，开始反应并孵育2小时。</li>
		<li>同时，配制含有竞争性DNA和核小体的“终止反应混合液”（removing mix），按X倍放大（X = 总反应数 + 4）。单个反应需1.5 µl终止反应混合液，其各组分用量见表6；根据检测数量按比例放大配制。</li>
		<li>向各反应管中加入1.5 μl终止反应混合液以终止反应，充分混匀后短暂离心，再于30 °C孵育30 min。</li>
		<li>同时，在垂直电泳装置中，以0.5× TBE为电泳缓冲液，在4 °C、100 V条件下预电泳30 min，下层电泳槽中放置磁力搅拌子以保持缓冲液循环。</li>
		<li>上样前，向样品中加入2.5 µl上样染料（含3× TBE、30%甘油、0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯蓝FF），充分混匀后短暂离心，使用专用上样吸头将样品加至凝胶加样孔中。</li>
		<li>在4 °C、200 V条件下持续电泳4.5小时，保持缓冲液循环。</li>
		<li>为检测信号，将凝胶转移至两张滤纸叠成的吸水垫上，用保鲜膜包裹滤纸和凝胶，于4 °C条件下曝光至磷屏成像仪存储屏上所需时间。</li>
		<li>使用同位素成像扫描系统扫描存储屏，并用相应软件分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单核小体结合实验
为了检测给定的INO80复合物与单核小体的结合亲和力，使用第1.2步生成的单核小体底物进行电泳迁移率变动分析（EMSA）。
<ol>
	<li>按照核小体重塑实验所述设置结合反应体系，但反应中省略ATP和去除混合物；在30 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>向每种反应混合物中加入2.5 µl上样染料，并上样至含有3.5%丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 37.5:1）、1%甘油、0.5x TBE、0.01%过硫酸铵（APS）和0.001%四甲基乙二胺（TEMED）的非变性聚丙烯酰胺凝胶中。</li>
	<li>使用0.5x TBE作为电泳缓冲液，在4 °C下以200 V电压运行2.5小时，同时循环缓冲液，并将凝胶暴露于存储磷屏进行检测。</li>
</ol>
3. DNA 和核小体依赖性 ATP 酶活性检测
在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、60 mM NaCl、6.6 mM MgCl2、0.8 mM EDTA、0.015% Nonidet P-40、2.5% 甘油、0.1 mg/ml BSA、1 mM DTT、0.1 mM PMSF、2 mM ATP 和 2 μCi [α-32P] ATP（3,000 Ci/mmol）的5 μl反应体系中进行ATP酶活性检测。针对每种待测的INO80复合物或不同量的INO80复合物，设置三个平行反应：一个加入EB100缓冲液以检测DNA或核小体非依赖性ATP酶活性，一个加入闭合环状质粒DNA（5,000 bp，约30 nM）以检测DNA依赖性ATP酶活性，另一个加入HeLa寡核小体（约185 nM）以检测核小体依赖性ATP酶活性。所有反应均需在冰上设置。
<ol>
	<li>每个反应中，将10–50 nM经免疫纯化的INO80或INO80亚复合物与适量EB100缓冲液混合，使总体积达到2.2 μl，置于预冷并润滑的1.5 ml微量离心管中。立即将任何含INO80的组分在粉末干冰或液氮中重新冷冻。</li>
	<li>配制主混合液。单个反应所需各组分的用量见表7。将配方按3(X+2) +1倍放大，其中X = 需要检测的INO80样品数量。</li>
	<li>为制备仅含缓冲液、DNA或核小体的“次级混合液”，将2.5(X+2) μl主混合液分别加入三个独立的离心管中。向各管中分别加入0.3(X+2) μl EB100、闭合环状质粒DNA（1.5 µg/µl）或Hela寡核小体（1.5 μg/μl），并充分混匀。</li>
	<li>将2.8 μl相应的次级混合液加入第3.1步准备好的含酶反应管中。轻轻吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>为启动反应，将反应管转移至30 °C金属浴中。</li>
	<li>在孵育5、15、30和60分钟后，从每个反应体系中取0.5 μl反应混合物，沿直线点样于纤维素聚乙烯亚胺薄层色谱（TLC）板（20 × 10 cm）上，点样位置距离板底边缘至少1.5 cm。点样后立即将反应管放回30 °C金属浴，以便从同一反应管中采集多个时间点。点样完成后，使用吹风机彻底干燥TLC板。</li>
	<li>将TLC板转移至玻璃展开槽中，槽内加入足量0.375 M磷酸钾溶液（pH 3.5），使TLC板底部约0.5 cm浸入溶液中。</li>
	<li>盖上展开槽盖子，待液相前沿迁移至TLC板顶端时停止展开。立即使用吹风机将板彻底干燥。</li>
	<li>将干燥后的TLC板在室温下暴露于储存型磷屏。使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，并测定放射性ATP底物和ADP产物的量。</li>
	<li>计算水解ATP的量时，将ATP水解百分比乘以起始反应混合物中ATP的总量，计算公式如下：水解ATP的pmol数 = 起始反应中10 pmol ATP × [ADP/(ATP+ADP)]</li>
</ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了确保在实验中观察到的核小体重塑和ATP酶活性依赖于INO80复合物的催化活性，而非来自污染的重塑酶和/或ATP酶，我们通常会平行纯化出与野生型INO80采用相同方法制备的催化失活型INO80复合物，并常规检测其核小体重塑活性和ATP酶活性。在检测核小体重塑活性时，还应设置一个不含ATP的阴性对照反应，以检测是否存在污染的ATP和/或ATP非依赖性重塑活性，这些因素可能会影响对不同制备批次的INO80复合物或亚复合物活性比较实验结果的解释。催化失活型的INO80或INO80亚复合物应不表现出任何核小体重塑或ATP酶活性。此外，若检测到DNA或核小体非依赖性的ATP酶活性，则表明酶组分中存在污染的ATP酶。如果在使用催化失活型Ino80的情况下仍检测到活性，或即使按照“代表性结果”部分所述优化了纯化步骤后，仍存在显著的DNA或核小体非依赖性ATP酶活性，则可进一步通过离子交换层析、凝胶过滤层析或梯度沉降等额外步骤对复合物进行进一步纯化。
在测定核小体重塑和ATP酶活性时，建议使用不同时间长度以及多种浓度的INO80或INO80亚复合物进行实验，以确保在产物-时间曲线和剂量-反应曲线...

SNF2家族染色质重塑复合物包含一个中心SNF2样ATP酶亚基1,2。某些SNF2样ATP酶以单亚基酶的形式发挥作用，而另一些则作为大型多亚基复合物的催化亚基发挥作用。要阐明染色质重塑复合物各个亚基如何在分子机制上贡献其活性，需要能够开展可解析重塑过程的生化实验。
人类INO80复合物及其他染色质重塑酶依赖ATP的核小体重塑过程可视为一个多步骤机制，起始于重塑酶与核小体的结合，随后激活其DNA和/或核小体依赖的ATP酶活性，接着重塑酶在核小体DNA上发生转位，最终实现核小体的重新定位 1,2理解ATP依赖性染色质重塑过程的分子细节，需要将重塑反应分解为各个独立步骤，并明确染色质重塑复合物中各个亚基在反应每一步骤中的作用。此类分析需要能够利用定义明确的分子底物来研究核小体重塑及其他相关活性。 体外.
在之前的一期JOVE实验方案中，我们描述了用于生成具有明确亚基组成的INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的方法3。在此，我们介绍了三种生物化学检测方法，可用于定量分析此类复合物相关的核小体结合能力、DNA及核小体激活的ATP酶活性以及核小体重塑活性。

<table><tbody><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR反应缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Taq DNA聚合酶</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>NucAway无核酸酶离心柱&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>货号 # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>超纯ATP&amp;nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>超声处理的鲑鱼精子DNA&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10%过硫酸铵（APS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶&amp;nbsp;</td><td>Novagen</td><td>货号 No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP，[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR热循环仪 PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer垂直电泳装置</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>润滑型1.5 ml微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>储存式磷屏&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM滤纸</td><td>Whatman&amp;nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon磷光成像仪&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant软件</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC玻璃板，PEI-纤维素F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL转印膜 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>通用型辐射巡测仪，配备端窗或薄饼型GM（盖革-米勒）探头</td><td>Biodex</td><td>Model 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

用于分析atp依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

SNF2 家族 ATP 酶的成员通常作为多亚基染色质重塑复合物的组分，通过催化依赖 ATP 的核小体重塑，调控核小体动态和 DNA 可及性。为了从生物化学角度解析此类复合物中各个亚基在多步骤的 ATP 依赖性染色质重塑反应中的具体贡献，需要采用能够监测反应产物生成并测量反应中间体形成的实验方法。本 JoVE 实验方案描述了可用于测定包含不同亚基组合的染色质重塑复合物或亚复合物生化活性的多种检测方法。染色质重塑活性通过 ATP 依赖性核小体滑动实验进行测定，该方法采用基于电泳迁移率偏移分析（EMSA）的技术来监测核小体在 DNA 分子上的移动。核小体结合活性则通过类似的 EMSA 方法检测，用于观察重塑复合物结合的单核小体的形成。而 DNA 或核小体依赖的 ATP 酶活性则采用薄层色谱法（TLC）测定，在存在 DNA 或核小体的条件下，检测 ATP 转化为 ADP 和磷酸的速率。利用这些检测方法，可通过比较完整复合物与缺失一个或多个亚基的复合物之间的活性差异，来研究染色质重塑复合物中各亚基的功能。本文以人类 INO80 染色质重塑复合物为例进行说明；然而，此处描述的方法也可适用于其他染色质重塑复合物的研究。

图中展示了用于表征INO80活性的生化实验的代表性结果，包括核小体滑动（图1）和结合（图2）实验，以及DNA或核小体依赖性ATP酶实验（图3）。
实验如图所示 图1 比较通过 FLAG-Ies2 或 FLAG-INO80E 纯化的完整 INO80 复合物，以及通过 FLAG-Ino80ΔN 或 Ino80ΔNΔHSA 纯化的 INO80 亚复合物，催化组装于 216 bp 放射性标记 DNA 片段上的单核小体发生重塑的能力。核小体在 DNA 片段上的位置影响其电泳迁移率；位于侧位的核小体在凝胶中的迁移速度比位于中心位置的核小体更快。由于 INO80 染色质重塑复合物优先将单核小体向 DNA 片段的中心位置移动6,7,8通过观察电泳迁移率降低的一组核小体的出现，来监测重塑活性。反应结束后，需向反应体系中加入过量的HeLa寡核小体以及鲑鱼精子DNA或其他DNA作为竞争性抑制物，以去除与底物结合的INO80或INO80亚复合物，因为...

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

SNF2家族ATP酶成员常作为多亚基染色质重塑复合物的组分，调控核小体动态性及……

以下实验的目的是测量依赖 TP 的染色质重塑复合物的各种生化活性。通过使用电泳迁移率变动分析（EMSA），检测核小体在 DNA 分子上从一端向中心位置的 TP 依赖性滑动，从而实现这一目标。类似的基于 EMSA 的方法可用于监测重塑复合物结合的单核小体的形成，以评估染色质重塑复合物的核小体结合活性。此外，薄层色谱法可用于检测依赖ATP的染色质重塑复合物的APAs活性。最终，这些方法可用于检测人类INO80复合物中依赖ATP的染色质重塑过程。在本视频中，我们将演示用于研究INO80染色质重塑复合物的生物化学分析方法。类似的方法也可用于研究其他染色质重塑复合物，以进行ATP依赖性核小体重塑实验。首先制备核小体底物，在PCR仪中按照表格所述设置100微升PCR反应体系。在热循环仪中进行PCR反应，然后将反应产物先后通过无核酸酶的离心柱纯化两次，以去除未掺入的核苷酸。接下来，将两摩尔的P 32标记的6 0 1 DNA片段与六微克的 hilar 核小体在50微升缓冲液中混合，于30摄氏度孵育30分钟。然后依次加入12.5微升、20.8微升和41.6微升含有E-D-T-A-P-M-S-F和DTT的Tris HCl缓冲液，将混合物稀释至0.8摩尔、0.6摩尔和0.4摩尔的氯化钠浓度，每次加入后均于30摄氏度孵育30分钟；最后一次孵育后，再分别加入125微升和250微升的Tris盐酸缓冲液。进一步补充不含P 40的甘油和PSA，进行两次额外的稀释，分别稀释至0.2摩尔和0.1摩尔的氯化钠浓度，每次稀释后均于30摄氏度孵育30分钟。然后将单核小体底物在4°C下保存，最多可保存三个月，之后进行检测并制备天然聚丙烯酰胺凝胶。对于每个反应，取约20 nmol的NO 80与适量EB 100缓冲液混合，使总体积达到4.75 µL，加入预冷的硅化1.5 mL微量离心管中。含有NO 80的剩余组分应立即重新冷冻，并用粉末状干冰处理。接下来，将5.25 µL新配制的主混合液加入每个反应管中，通过上下吹打充分混匀。然后将反应管置于30 °C的加热块中孵育。孵育结束后，向每根反应管中加入1.5 µL新配制的终止反应混合液，以终止反应，随后混匀各反应管。将样品充分离心后，在30摄氏度下再孵育30分钟。与此同时，在垂直电泳装置中用0.5×TBE作为电泳缓冲液，于4摄氏度预电泳30分钟，电压为100伏，并在下层缓冲液室中放入磁力搅拌子以保持缓冲液持续循环。孵育结束后，去除反应混合物，向每个反应体系中加入2.5微升上样染料，短暂离心后，使用上样吸头将样品加入凝胶中。在4°C条件下，使用缓冲液循环，以200伏电压电泳4.5小时。然后将凝胶转移至两张滤纸组成的叠层上，并用透明塑料膜覆盖凝胶及滤纸，以便检测信号。将凝胶在4°C下暴露于储存型磷屏上所需时间，随后使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，并采用适当的软件分析数据，以完成DNA和核小体依赖性的APA分析。首先，在每个预冷并润滑的 1.5 毫升微量离心管中，将 10 至 50 纳摩尔的免疫纯化亚复合物与适量 eeb 100 缓冲液混合，使总体积达到 2.2 微升，用于每个反应；然后立即将任何含有 NO 80 的组分在粉末状干冰中重新冷冻。接着，用移液器上下轻轻混入 2.8 微升新鲜配制的亚鸡尾酒混合物（包含 DNA 核小体或不包含），加入含酶的反应管中，并将反应管转移至 30 摄氏度的加热块中。下一步，用铅笔在 20 乘以 10 的聚乙烯板底部边缘上方至少 1.5 厘米处轻轻画一条线。我指的是薄层色谱（TLC）板。然后在孵育后的5、15、30和60分钟时，立即将每种反应混合物各0.5微升点样到起始线上，并立即将每个样品放回加热块中，以便从同一根试管中获取多个时间点的样品。点完最后一个样品后，使用吹风机将板吹干，然后将板转移至含有足量展开剂的玻璃展开室中。使用0.375摩尔的磷酸钾溶液，使薄层色谱板的底部0.5厘米浸入溶液中。盖上层析缸，展开反应，直至流动相前沿到达薄层色谱板顶部，此时应立即用气流吹干板子，并在室温下暴露于储存型磷屏。最后，使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，以确定放射性a TP底物和a DP产物的量。第一个实验表明，通过 Flag-IES二联Flag、N-O-A-T-E以及Flag NO 80 ΔN纯化的复合物具有相似的核小体滑动活性，说明NO 80复合物发挥核小体重塑功能时，NO 80的N端和/或其相关亚基并非必需。相比之下，通过Flag NO 80 ΔN ΔHSA纯化的复合物在此实验中无活性，表明该重塑活性依赖于NO 80 APA亚基的HSA结构域和/或其相关亚基。通过改进核小体滑动实验流程，可测定染色质重塑复合物的核小体结合活性。在本实验中，将核小体与通过NO 80复合物E亚基纯化的完整NO 80复合物以逐渐增加的量共同孵育，导致对应于游离单核小体的条带呈剂量依赖性消失，并出现一条新的迁移至凝胶顶部附近的新条带。相比之下，当核小体与通过NO 80 delta N纯化、缺失部分NO 80亚基的小型复合物共同孵育时，出现的迁移条带移动更快，表明超迁移条带的相对迁移率由复合物的大小决定。在本项最终实验中，展示了比较两种不同NO 80亚复合物的DNA和核小体激活的APAs活性的实验结果。迁移较慢的斑点对应于起始的 α-32P 标记的 ATP，而迁移较快的条带则是 ADP 反应产物，图中区域指示了溶剂的迁移方向。在使用这些实验步骤时，重要的是要记住设置不同反应时间以及含有不同酶浓度的实验组。这将确保在产物随时间及剂量变化的响应曲线呈线性阶段时进行测量。观看本视频后，您应能充分理解如何分析纯化的染色质重塑复合物在TPA作用下的核小体结合及核小体滑动活性。请务必注意，操作放射性材料可能存在危险，应采取预防措施，例如穿戴实验服和护目镜，监测放射性污染，并妥善处理放射性废弃物。

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一种乙酰化-点击化学检测法用于测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化水平

学习使用电泳迁移率变动分析和薄层色谱法测定ATP依赖的染色质重塑复合物的核小体滑动、结合活性及ATP酶活性。该方法适用于研究INO80等复合物的生化功能。

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

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