用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

以下实验的目的是测量依赖 TP 的染色质重塑复合物的各种生化活性。通过使用电泳迁移率变动分析（EMSA），检测核小体在 DNA 分子上从一端向中心位置的 TP 依赖性滑动，从而实现这一目标。类似的基于 EMSA 的方法可用于监测重塑复合物结合的单核小体的形成，以评估染色质重塑复合物的核小体结合活性。

此外，薄层色谱法可用于检测依赖ATP的染色质重塑复合物的APAs活性。最终，这些方法可用于检测人类INO80复合物中依赖ATP的染色质重塑过程。在本视频中，我们将演示用于研究INO80染色质重塑复合物的生物化学分析方法。

类似的方法也可用于研究其他染色质重塑复合物，以进行ATP依赖性核小体重塑实验。首先制备核小体底物，在PCR仪中按照表格所述设置100微升PCR反应体系。在热循环仪中进行PCR反应，然后将反应产物先后通过无核酸酶的离心柱纯化两次，以去除未掺入的核苷酸。

接下来，将两摩尔的P 32标记的6 0 1 DNA片段与六微克的 hilar 核小体在50微升缓冲液中混合，于30摄氏度孵育30分钟。然后依次加入12.5微升、20.8微升和41.6微升含有E-D-T-A-P-M-S-F和DTT的Tris HCl缓冲液，将混合物稀释至0.8摩尔、0.6摩尔和0.4摩尔的氯化钠浓度，每次加入后均于30摄氏度孵育30分钟；最后一次孵育后，再分别加入125微升和250微升的Tris盐酸缓冲液。进一步补充不含P 40的甘油和PSA，进行两次额外的稀释，分别稀释至0.2摩尔和0.1摩尔的氯化钠浓度，每次稀释后均于30摄氏度孵育30分钟。

然后将单核小体底物在4°C下保存，最多可保存三个月，之后进行检测并制备天然聚丙烯酰胺凝胶。对于每个反应，取约20 nmol的NO 80与适量EB 100缓冲液混合，使总体积达到4.75 µL，加入预冷的硅化1.5 mL微量离心管中。含有NO 80的剩余组分应立即重新冷冻，并用粉末状干冰处理。

接下来，将5.25 µL新配制的主混合液加入每个反应管中，通过上下吹打充分混匀。然后将反应管置于30 °C的加热块中孵育。孵育结束后，向每根反应管中加入1.5 µL新配制的终止反应混合液，以终止反应，随后混匀各反应管。

将样品充分离心后，在30摄氏度下再孵育30分钟。与此同时，在垂直电泳装置中用0.5×TBE作为电泳缓冲液，于4摄氏度预电泳30分钟，电压为100伏，并在下层缓冲液室中放入磁力搅拌子以保持缓冲液持续循环。孵育结束后，去除反应混合物，向每个反应体系中加入2.5微升上样染料，短暂离心后，使用上样吸头将样品加入凝胶中。

在4°C条件下，使用缓冲液循环，以200伏电压电泳4.5小时。然后将凝胶转移至两张滤纸组成的叠层上，并用透明塑料膜覆盖凝胶及滤纸，以便检测信号。将凝胶在4°C下暴露于储存型磷屏上所需时间，随后使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，并采用适当的软件分析数据，以完成DNA和核小体依赖性的APA分析。

首先，在每个预冷并润滑的 1.5 毫升微量离心管中，将 10 至 50 纳摩尔的免疫纯化亚复合物与适量 eeb 100 缓冲液混合，使总体积达到 2.2 微升，用于每个反应；然后立即将任何含有 NO 80 的组分在粉末状干冰中重新冷冻。接着，用移液器上下轻轻混入 2.8 微升新鲜配制的亚鸡尾酒混合物（包含 DNA 核小体或不包含），加入含酶的反应管中，并将反应管转移至 30 摄氏度的加热块中。下一步，用铅笔在 20 乘以 10 的聚乙烯板底部边缘上方至少 1.5 厘米处轻轻画一条线。

我指的是薄层色谱（TLC）板。然后在孵育后的5、15、30和60分钟时，立即将每种反应混合物各0.5微升点样到起始线上，并立即将每个样品放回加热块中，以便从同一根试管中获取多个时间点的样品。点完最后一个样品后，使用吹风机将板吹干，然后将板转移至含有足量展开剂的玻璃展开室中。

使用0.375摩尔的磷酸钾溶液，使薄层色谱板的底部0.5厘米浸入溶液中。盖上层析缸，展开反应，直至流动相前沿到达薄层色谱板顶部，此时应立即用气流吹干板子，并在室温下暴露于储存型磷屏。最后，使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，以确定放射性a TP底物和a DP产物的量。

第一个实验表明，通过 Flag-IES二联Flag、N-O-A-T-E以及Flag NO 80 ΔN纯化的复合物具有相似的核小体滑动活性，说明NO 80复合物发挥核小体重塑功能时，NO 80的N端和/或其相关亚基并非必需。相比之下，通过Flag NO 80 ΔN ΔHSA纯化的复合物在此实验中无活性，表明该重塑活性依赖于NO 80 APA亚基的HSA结构域和/或其相关亚基。通过改进核小体滑动实验流程，可测定染色质重塑复合物的核小体结合活性。

在本实验中，将核小体与通过NO 80复合物E亚基纯化的完整NO 80复合物以逐渐增加的量共同孵育，导致对应于游离单核小体的条带呈剂量依赖性消失，并出现一条新的迁移至凝胶顶部附近的新条带。相比之下，当核小体与通过NO 80 delta N纯化、缺失部分NO 80亚基的小型复合物共同孵育时，出现的迁移条带移动更快，表明超迁移条带的相对迁移率由复合物的大小决定。在本项最终实验中，展示了比较两种不同NO 80亚复合物的DNA和核小体激活的APAs活性的实验结果。

迁移较慢的斑点对应于起始的 α-32P 标记的 ATP，而迁移较快的条带则是 ADP 反应产物，图中区域指示了溶剂的迁移方向。在使用这些实验步骤时，重要的是要记住设置不同反应时间以及含有不同酶浓度的实验组。这将确保在产物随时间及剂量变化的响应曲线呈线性阶段时进行测量。

观看本视频后，您应能充分理解如何分析纯化的染色质重塑复合物在TPA作用下的核小体结合及核小体滑动活性。请务必注意，操作放射性材料可能存在危险，应采取预防措施，例如穿戴实验服和护目镜，监测放射性污染，并妥善处理放射性废弃物。