一种用于生物标志物研究的下一代组织微阵列（ngTMA）实验方案

以下实验方案的目的是构建用于生物标志物研究的最优或靶向组织微阵列。首先，从具有代表性的组织切片生成数字切片档案。在数字切片上标注感兴趣的组织学区域，以精确定义需转移至组织微阵列块中的相应供体组织块的具体区域。

在完成组织芯片的设计与布局后，供体组织块将被自动打孔，并将组织芯加载到组织芯片中。通过这种精确、快速且自动化的下一代技术，可准确捕获并转移特定的组织学区域甚至特定的细胞群至组织芯片上。与现有的组织芯片制备方法（如使用手工制作或半自动装置）相比，本技术的主要优势在于其组织学上的高精度。

这是通过结合数字病理学的优势与组织学专业知识以及自动化的组织微环技术实现的。今天演示该操作的是来自我们实验室的两位技术人员 Kalin Hamman 和 Jose Galvan。使用扫描软件时，首先选择明场扫描的自动模式。

然后单击扫描选项以调整玻片的质量参数。接下来，选择将玻片扫描文件保存到本地，或通过单击服务器参数并设置扫描目标为病例中心，将文件保存到网络。在将玻片装入扫描仪的玻片盒之前，请先准备玻片，并检查玻片是否清洁。

如有必要，可用乙醇清洁。每个载片盒最多可装载25张载玻片，扫描仪最多可装载10个载片盒。装载时，多个载片盒将堆叠放置。载玻片装载完毕后，在案例中心为所有载玻片指定文件名并设置保存文件夹。

现在通过点击绿色箭头开始扫描载玻片。在此部分，组织样本在载玻片上打孔的位置由数字载玻片的注释设定。首先打开数字载玻片文件夹。

在查看软件中，可以对文件夹本身进行修改。可以添加注释、重新排列幻灯片，并设置用户权限以及附件。现在，通过单击一张幻灯片开始进行标注。

它将在查看器中显示。在查看器中，使用放大工具评估切片，并找到需要整合到下一代组织微阵列（TMA）中的感兴趣区域。

使用TMA注释工具，选择所需核心的尺寸和注释的颜色。通过单击切片将该注释附加到切片上，然后将注释移动至所需的组织学结构。

这些注释标记了相应组织块上的打孔位置。重复此过程，直至所有切片均完成注释。作为组织样本的另一种处理方式，可将其送入0.2毫升PCR管中进行分子分析。

使用不同颜色的标记对切片进行标注，以区分这些点与组织微阵列（TMA）的位置。完成所有标注后，保存一个电子表格文件，其中包含所有切片及其相应标注和标注颜色的列表。接下来，通过获取所有已标注数字切片对应的石蜡包埋组织块，开始进行组织微结构重建。

称为供体组织块。将组织块按数字切片的相同顺序排列。检查每个组织块厚度是否至少为四毫米。

如果未保存，组织样本需要在计算机中重新设计。打开组织芯片软件，为项目命名。进入工具更换界面，选择所需的工具直径。

现在将最多12个受体组织块装入仪器中。注意记录组织块的名称，所有组织块应使用相同的编号系统以保持一致性。

然后在软件中为每个组织块分配适当的名称，以创建组织芯片（TMA）布局。首先，通过设定 punches 的行数、列数、空白行数以及间距来创建一个新的 TMA 设计。保存该布局并将其分配给相应的组织块。

然后对下一个组织块重复此过程。无论是采用新的布局还是相同的布局，受体组织块之间的核心尺寸均可变化。接下来，将最多60个供体组织块装入仪器中。

每行可容纳最多 10 个组织块，编号为 A 至 F。剩余的供体组织块将在软件中稍后加载。为每个供体组织块指定一个唯一的标识名称。

将自动获取每个组织块的图像。现在，将数字切片与其对应的供体组织块对齐。首先，选择一个组织块。

然后点击幻灯片，将幻灯片与组织块图像并排比较。在供体组织块图像上选择与相应数字幻灯片上特定位置相对应的参考点。然后点击下一步，注释将转移至供体组织块图像上。

如果注释正确，请依次点击每个注释以确认其位置。然后点击“开始”。系统将提示微阵列在受体模块的参考点处钻孔，随后在同一位置从供体模块打孔，并将组织芯转移至受体模块中。

要将组织芯收集到 PCR 管中，请点击该组织块的 PCR 工具。最多可使用四个注释区域向 PCR 管提供组织样本。设置完成后，点击“开始”，系统将调用供体并加载 PCR 管。

机器完成钻孔和打孔后，对供体组织块进行成像更新。接着对下一个组织块重复进行对齐和标注操作，然后进行取芯。

对TMA中的每个供体组织块都重复此操作。完成第一组60个供体组织块后，将其卸下，并装入另外60个组织块。

继续该过程，直至所有供体组织块均排列完毕。在采集约500个芯样后，清洁钻头和打孔工具将自动弹出。当阵列制备完成后，导出项目。

包含项目数据的电子表格文件将位于导出文件夹中。该文件显示了每个组织微阵列（TMA）块中每份样本的位置。然后，将带有叠加注释的供体块图像另存为 JPEG 文件至导出文件夹。

至此，完成TMA切片的制备过程。该TMA布局显示了六个NG TMA切片，每个制备两份，共得到12个最终切片以填满阵列。每个肿瘤切片包含402个组织点，每个正常组织切片包含268个点。

在完成60个供体组织块的注释后，进行了打孔操作。核心转移时间约为12秒。核心损失极小，而本项目中完成一个阵列的总时间约为24小时。

这包括在N-G-T-M-A流程之后，为后续分子分析而打孔取材所耗费的时间。还可对这些组织微阵列应用其他方法，如免疫组织化学、细胞杂交以及特殊染色，以回答某些问题，例如哪些基因或蛋白质在不同组织中表达或发生改变。