Name: 成像细胞内Ca 2+从成年小鼠使用基因编码的钙指标纹状体星形胶质细胞信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 了解利用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞进行钙信号成像的方法。该技术通过腺相关病毒注射实现特异性表达，结合共聚焦显微镜成像，为研究星形胶质细胞功能提供了可靠工具。

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大部分工作及相关人员由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目NS060677支持，并部分由NIH资助项目MH099559和MH104069（资助对象：BSK）提供支持。部分工作还得到了CHDI基金会的支持。

所有动物实验方案均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》，并经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会批准。
1.1）准备微量移液器和 AAV2/5 病毒加载
<ol>
	<li>使用细的硼硅酸盐玻璃微量移液管进行病毒注射。使用垂直拉制仪，采用两步拉制程序来拉制移液管。使用移液管研磨器以40°角度对移液管进行斜面打磨。适合使用的移液管应具有20 - 40 μm的尖端直径和6 - 7 mm的杆部长度。对移液管和手术器械进行高压灭菌。钻头通过70%乙醇擦拭进行消毒。</li>
	<li>将病毒AAV2/5-GfaABC1D.cyto-GCaMP3.SV40（1.5 x 1013 gc/ml）以10 μl分装液的形式在-80 °C下保存。手术前，从冷冻箱中取出分装液，并置于冰上保存，直至用于填充微量移液管。</li>
	<li>使用注射泵将病毒填充至微量移液管中。通过合适尺寸的管路压接接头，将一段管路的一端紧密连接至带有加强型活塞的玻璃注射器。通过合适尺寸的可拆卸针头压接接头，将已灭菌的微量移液管连接至管路的另一端。</li>
	<li>在装载病毒载体之前，使用1 ml注射器（27 G针头）中的苏丹红IV染色矿物油（约1 mg/50 ml）填充系统，以排除泵送系统（包括管路、注射器和微量移液管）中的气泡。</li>
	<li>在玻璃微量移液管下方放置一块干净的Parafilm膜，并将5 - 10 μl病毒载体滴加到Parafilm膜上。</li>
	<li>通过以0.5 μl/min的速度向后移动注射器活塞吸取病毒载体，并在玻璃移液管上标记载体与油之间的界面位置。</li>
</ol>
1.2）麻醉、剪毛、头部固定和开颅准备
<ol>
	<li>将一只小鼠（P49-63，C57BL/6）放入充满 N2O 和 O2 混合气体并含 5% 异氟烷的麻醉舱中。通过观察小鼠是否失去自主运动能力以及呼吸频率是否减慢（约 60 - 90 次/分钟）来评估麻醉深度。当小鼠进入麻醉状态后，剪除其头部毛发。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪中，用钝性耳棒固定其头部，并将鼻部接入麻醉与通气系统。持续维持 2 - 3% 的异氟烷麻醉浓度。由于小鼠在麻醉状态下会丧失眨眼反射，需在双眼涂抹人工泪眼膏以保护角膜。</li>
	<li>通过皮下注射给予 0.05 ml 的丁丙诺啡（0.1 mg/ml）以缓解术后疼痛。</li>
	<li>使用 10% 聚维酮碘和 70% 酒精交替消毒手术区域三次，起始使用聚维酮碘，从头部前部向后部擦拭，以清除已剪下的毛发。</li>
	<li>在头顶部做一皮肤切口，切口起始于两眼之间，终止于双耳之间。</li>
</ol>
1.3）开颅与微量注射
<ol>
	<li>用棉签擦拭去除骨膜，然后用牙科棉球擦干颅骨表面。在注射部位周围做标记，使用高速钻机驱动的小型钢制磨头沿标记边缘进行钻孔。</li>
	<li>去除骨质，并用生理盐水清洁表面。</li>
	<li>将移液管插入左侧背外侧纹状体，坐标如下（单位：mm）：前后方向 +0.8，内外方向 +2.0，背腹方向从软脑膜表面起 -2.4 13。需注意，这些坐标意味着微量注射针尖位于背外侧纹状体上方稍许位置（图 1A、B），即仅轻微进入该核团。应避免损伤血管。若移液管恰好位于血管上方，可将坐标微调约 0.1–0.2 mm。</li>
	<li>以 0.2 μl/min 的注射速率开始注射，通常注射 1 至 1.5 μl 病毒液。</li>
	<li>注射完成后，将移液管留置原位 10 分钟，然后缓慢撤出。</li>
	<li>最后使用连续缝合的外部尼龙缝线闭合手术切口。</li>
</ol>
1.4）恢复
<ol>
	<li>将小鼠放入干净的笼子中，并置于加热垫上持续 24 小时。手术后的小鼠在完全恢复之前不得与其他动物合笼饲养。在小鼠恢复至能够维持胸卧位意识状态之前，不得使其无人看管。</li>
	<li>在饮水中添加甲氧苄啶磺胺甲恶唑（每 500 ml 水中加入 5 ml，含 40 mg 甲氧苄啶和 200 mg 磺胺甲恶唑），持续一周。术后每日给予布托啡诺两次，持续最多 3 天。</li>
	<li>将小鼠维持在 12 小时光照-黑暗循环条件下，每日定时喂食和供水，并在术后 3 天内每天称重一次。在此 3 天内，若小鼠体重减轻超过 10%，则视为健康状况受损，应予以安乐死，不再用于实验。</li>
	<li>每周单独更换小鼠笼子两次，并至少每日一次监测其总体健康状况。通常在立体定位微量注射后 2 至 3 周内使用小鼠。</li>
</ol>
2. 用于共聚焦 Ca2+ 成像的急性脑切片制备
2.1）切割和记录溶液的配制。
<ol>
	<li>配制切割液，其成分（单位：mM）为：194 蔗糖、30 NaCl、4.5 KCl、10 D-葡萄糖、1 MgCl2、1.2 NaH2PO4 和 26 NaHCO3，用 95% O2 和 5% CO2 饱和。</li>
	<li>配制记录液，其成分（单位：mM）为：124 NaCl、4.5 KCl、1 MgCl2、10 D-葡萄糖、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4 和 26 NaHCO3；pH 值为 7.3–7.4，渗透压为 290–295 mOsm，用 95% O2 和 5% CO2 饱和。将记录液注入脑片储存烧杯中，并维持在 34 °C。</li>
</ol>
2.2）切片
<ol>
	<li>立体定位微量注射后两到三周，对小鼠进行深度且终末麻醉，随后将其断头。</li>
	<li>取出大脑，用刀片切除未注射的右半球，将左半球用超级胶水固定在振动切片机的切片托上。在振动切片机托盘中加入冰冷的切割缓冲液，并持续用95% O2 和5% CO2 混合气体饱和。</li>
	<li>以300 μm厚度切割冠状或矢状纹状体脑片。通常可收集4–5片冠状切片或6–7片矢状切片。</li>
	<li>将切片转移至预热至34 °C的切片保存烧杯中，在其中孵育30分钟，随后于室温下保存，以备后续记录使用。</li>
	<li>在进行[Ca2+]i成像前，将脑片在充氧的记录缓冲液中室温孵育至少30分钟。</li>
</ol>
3. 免疫组织化学（IHC）
<ol>
	<li>病毒注射后两周，用 PBS 经心脏灌注小鼠，随后用 PBS 中的 10% 甲醛溶液进行灌注固定。</li>
	<li>取出脑组织，于 PBS 缓冲的 30% 蔗糖溶液中后固定过夜并进行冷冻保护，时间至少为 2 天。</li>
	<li>使用冷冻切片机制备 40 μm 厚的脑切片。</li>
	<li>用 PBS 漂洗切片 3 次，每次间隔 10 分钟。</li>
	<li>将切片在含 10% 正常山羊血清和 0.5% Triton X-100 的 PBS 中孵育 1 小时。</li>
	<li>将切片在 4 °C 下与一抗溶液（溶于含 0.5% Triton X-100 的 PBS）中孵育过夜。所用一抗如下：鸡抗 GFP 抗体（1:1,000）、鼠抗 S100β 抗体（1:400）、鼠抗 NeuN 抗体（1:600）、鼠抗谷氨酰胺合成酶抗体（1:300）。</li>
	<li>用 PBS 漂洗切片 3 次，每次间隔 10 分钟。</li>
	<li>将切片在室温下与二抗溶液（溶于含 10% 正常山羊血清的 PBS）中孵育 2 小时。所用二抗如下：抗小鼠 IgG-Alexa546（山羊来源，1:500）、抗鸡 IgG-Alexa488（山羊来源，1:500）。</li>
	<li>将切片贴附于载玻片上，干燥后滴加数滴抗荧光淬灭封片剂，缓慢加盖盖玻片。将载玻片置于 4 °C 保存。</li>
	<li>使用数值孔径为 1.3 的 40X 油浸物镜，在共聚焦显微镜下采集图像。</li>
</ol>
4. 共聚焦 [Ca2+]i 成像
注意：使用配备数值孔径为0.8的40倍水浸物镜的共聚焦显微镜进行细胞内[Ca2+]i成像。
<ol>
	<li>切片后1至5小时内，将切片放入记录槽中，以室温下流速为1-2 ml/min的充氧记录缓冲液进行灌流。然后在切片上方放置带有尼龙丝的铂金网格，以减少实验过程中的组织移动。</li>
	<li>在10倍水浸物镜下使用明场透射光成像，观察并定位背侧纹状体。</li>
	<li>切换至40倍水浸物镜，并开启氩离子激光器的488&#160;nm激光线。通过调节焦平面，寻找位于切片表面下方约20 μm处的细胞，这些细胞在胞体、分支及细小分支中显示基础荧光。需要注意的是，状态受损的细胞通常荧光强度高于平均水平，应予以避免。</li>
	<li>使用“帧扫描”模式开始成像。通常将激光强度调节至最大输出功率的0.5–5%，即可对表达cyto-GCaMP3的细胞进行[Ca2+]i成像。为监测星形胶质细胞全区域内的[Ca2+]i动态变化，建议采用每帧1&#160;秒或更快的扫描速率进行“帧扫描”，但具体参数需根据实验需求确定。</li>
	<li>如需对突起内的[Ca2+]i进行成像，可使用2-3倍的数字放大倍率，以便在整个视野中监测1-2个星形胶质细胞。</li>
	<li>为避免记录过程中像素饱和，使用“HiLo”伪彩模式对细胞进行着色。每次实验前应先进行约5分钟的“预记录”，检查是否有红色出现以提示像素饱和。若出现饱和，应降低激光输出功率，或调低光电倍增管（PMT）/增益（Gain）/偏移（offset）数值，并重新进行预记录，直至像素值处于非饱和范围。通常用于纹状体星形胶质细胞[Ca2+]i成像的参数组合如下：激光输出功率0.5–5%（基于10 mW），PMT电压550–650伏特，增益2.0–3.5倍，偏移0–5%。</li>
</ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本文所述方法使我们能够在纹状体星形胶质细胞中表达胞质GCaMP3 体内 用于后续的 [Ca2+]i 成像 原位该方法相较于使用转基因或基因敲入小鼠具有多项优势，包括靶蛋白表达强、实验实施快速灵活以及解剖学特异性高。利用 AAV2/5 载体表达 GCaMP3 被证实具有高度特异性和强表达水平。GFAP GfaABC 的组合1D启动子与5型腺相关病毒（AAV）联用对于实现特异性至关重要。本方法的一个局限性在于，病毒感染和手术操作可能引起星形胶质细胞反应性，尤其是在使用高滴度病毒时。19重要的是，在本研究中，使用相对较低滴度的 AAV2/5 微量注射并未引起谷氨酰胺合成酶（GS）水平的下降，而这种下降通常与星形胶质细胞反应性相关19. 类似对照已在海马星形胶质细胞中报道8然而，必须强调针对每个待研究脑区设置这些对照的必要性，尤其因为星形胶质细胞具有异质性20，因为它们可能在大脑的不同区域执行不同的功能。
<p class="jove_content...

星形胶质细胞是大脑中广泛存在且数量丰富的胶质细胞。已明确星形胶质细胞具有重要的支持和稳态功能，包括缓冲细胞外空间的K+浓度、摄取神经递质以及提供营养物质。然而，近期研究表明，星形胶质细胞还可表现出细胞内[Ca2+]i信号，这些信号可自发产生，并随神经元活动而增强1。越来越多的研究认为，星形胶质细胞的[Ca2+]i信号可能触发其与神经元之间的通讯，因此被解读为星形胶质细胞中的一种“Ca2+兴奋性”。过去二十年积累的数据提示，星形胶质细胞与神经元之间可能存在两种通讯方式，或许是双向的。首先，当神经元释放的神经递质和神经调质激活星形胶质细胞时，后者常表现为[Ca2+]i水平升高2。其次，星形胶质细胞内[Ca2+]i的升高可促使该细胞释放信号分子，进而影响神经元和血管。有证据表明，星形胶质细胞释放的分子可通过星形胶质细胞-神经元信号通路，引起突触、神经环路乃至行为功能的改变3-5。然而，该领域仍处于快速发展阶段，有观点认为，需要更深入、更详细地理解星形胶质细胞的[Ca2+]i，以解决当前存在的一些不确定性6。
在以往的研究中，已证明有机钙的大量加载2+ 将指示剂染料导入星形胶质细胞无法可靠地检测[Ca2+]i 培养的星形胶质细胞全细胞内的信号 原位7-10这些发现已由我们及其他研究者进行了讨论6,11,12。目前逐渐形成的观点是[Ca2+]i 星形胶质细胞突起内的信号例如， 分支和小分支）作为与神经元和血管相互作用的主要部位，其详细研究仍较为罕见。近年来，基因编码的钙指示剂（GECIs）如胞质内的GCaMP3、GCaMP5G和GCaMP6，以及膜锚定版本的GCaMP例如，Lck-GCaMP3）使得研究[Ca2+]i 星形胶质细胞小隔室中的信号，如细突起、质膜附近以及整个区域内的信号7,8然而，GECI 相较于有机 Ca 指示剂有一个缺点2+ 指示剂染料，这也是基因方法选择性地将编码基因递送至星形胶质细胞所必需的条件 体内 持续数周以使GECIs得到适当表达。表达 体内 通常通过转基因小鼠、基因敲入小鼠或基于病毒的递送方法实现。在本JoVE文章中，我们报告了使用腺相关病毒将GECI递送至纹状体星形胶质细胞所采用的方法与操作流程。我们以胞质定位的GCaMP3为例进行说明，但相同的基本操作流程适用于任何其他GECI或基于荧光蛋白的报告分子。

<table><tbody><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器研磨仪</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>送往宾夕法尼亚大学病毒载体核心进行病毒包装的质粒</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 病毒</td><td>宾夕法尼亚大学病毒载体核心</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>苏丹红 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV300 和 FV1000</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗-GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗-s100&amp;beta; 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗-NeuN 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗-谷氨酰胺合成酶抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗-小鼠-Alexa546 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗-鸡-Alexa488 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 ca2+ 信号进行成像

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

星形胶质细胞表现出自发性胞内Ca2+ 浓度波动（[Ca2+]i）并在多种条件下，通过增强的[Ca2+]i 信号。已有研究提出，星形胶质细胞反过来通过钙依赖性机制（如释放信号分子）调节神经元和血管。然而，[Ca2+]i 利用基因编码的钙指示剂（GECIs）（如GCaMP系列）对整个星形胶质细胞进行成像，直到最近才成为可能。在星形胶质细胞中使用GECIs现在为研究星形胶质细胞[Ca2+]i 在纹状体等模型微环路中详细研究信号，纹状体是基底神经节中最大的核团。本报告中，详细描述了在星形胶质细胞中表达GECIs的手术方法 体内 以及采用共聚焦成像方法记录[Ca2+]i 纹状体星形胶质细胞中的信号 原位， 进行了描述。我们强调了注意事项、必要的对照和检测方法，以确定GECI表达是否对星形胶质细胞具有选择性，并评估是否存在明显的星形胶质细胞活化迹象。我们还详细描述了脑切片和成像条件，这些条件可实现可靠的[Ca2+]i 纹状体星形胶质细胞成像 原位. 这些方法的应用揭示了单个纹状体星形胶质细胞的完整区域以及自发的[Ca2+]i 信号，位于其胞体、分支及小分支中。在纹状体中进一步应用和拓展这些方法，将有助于对星形胶质细胞[Ca2+]i 纹状体微环路中的信号

为了在纹状体中实现星形胶质细胞特异性的胞质GCaMP3表达，我们使用了5型腺相关病毒（AAV）以及GFAP GfaABC1D启动子（图1A），该启动子此前已被证明可在海马和皮层的星形胶质细胞中驱动强烈的GCaMP3及报告基因表达8,14。在将病毒微量注射到小鼠纹状体两周后，对小鼠（约10周龄）进行灌注，并对脑组织薄切片进行免疫组化染色，以评估纹状体中cyto-GCaMP3的表达情况（图1B）。我们使用GFP抗体检测cyto-GCaMP3，并用已知的星形胶质细胞标志物S100β对切片进行共染色。结果显示，cyto-GCaMP3仅存在于S100β阳性细胞中。在NeuN标记的神经元中未检测到任何表达（图2A和2B），表明其具有星形胶质细胞特异性表达特征。重要的是，约60%的S100β阳性细胞中可检测到cyto-GCaMP3的表达（图2C）。
星形胶质细胞在脑损伤、缺血和感染等脑部损害刺激下会发生一系列变化，这些...

星形胶质细胞内 Ca²⁺ 的特性与功能2+ 纹状体中的信号仍未能得到充分研究。本文描述了利用血清型2/5的腺相关病毒（AAV2/5）在纹状体星形胶质细胞中表达基因编码钙指示剂的方法，以及可靠地对钙信号进行成像的操作流程。2+ 纹状体星形胶质细胞内的信号 原位.

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 Ca2+ 信号进行成像

星形胶质细胞表现出自发的细胞内 Ca2+ 浓度波动（[Ca2+]i），并在多种情况下对神经元兴奋产生响应，伴随……

本实验的总体目标是利用基因编码的钙指示剂（如 cyto G CAMP three），对成年小鼠纹状体 AAL 星形胶质细胞内的钙信号进行成像。首先将病毒注射到小鼠纹状体中，手术后让小鼠恢复两到三周，即可实现该目标。接下来，处死小鼠并制备急性脑切片。最后一步是对脑切片进行共聚焦钙成像。最终，通过免疫组织化学证实，Cyto G Camp 3 仅在星形胶质细胞中表达，而不在神经元中表达，且病毒注射未引起明显的星形胶质细胞反应性。与现有的转基因或 nochi M 等方法相比，该技术的主要优势在于能够实现目标蛋白的稳定表达，并具有快速且灵活的实验操作性。该方法有助于回答骨细胞钙信号研究领域中的关键问题，例如如何可靠地测量骨细胞突起及细小分支中的骨细胞钙信号。在手术前，通过高压灭菌对微量移液器和手术器械进行病毒注射前的准备。从负80摄氏度冰箱中取出预先制备的AAV5G camp three病毒分装样品，并置于冰上保存。下一步是用病毒填充微量移液器。首先，通过合适尺寸的管路压接接头，将一段管路的一端紧密连接至带有加强型活塞的玻璃注射器上。然后使用合适尺寸的可拆卸针头压缩接头，将高压灭菌过的微量移液管连接到这段管路的另一端。接着，使用带有27号针头的1毫升注射器，吸取经苏丹红4号染色的矿物油。随后将矿物油注入注射器管路及微量移液系统中，以排除气泡。将一块干净的石蜡膜置于玻璃微量移液管下方后，将10微升病毒载体滴加到石蜡膜上。接着，以每分钟0.5微升的速度向后移动注射器活塞，将病毒载体吸入微量移液管中。操作完成后，在玻璃移液管上标记病毒载体与油相之间的分界线。麻醉小鼠后，剃除其头部的毛发。将小鼠固定于立体定位仪中，将其鼻子置于麻醉和通气系统内，并持续维持2%至3%的异氟烷。同时在两只眼睛上涂抹人工泪液软膏。接着，通过皮下注射给予0.05毫升的丁丙诺啡以缓解疼痛。从中心向外周以环形方式擦拭，先用10%聚维酮碘清洁手术区域，再用70%酒精重复交替三次。随后，在头部顶部做皮肤切口，切口起始于两眼之间，终止于双耳之间。用棉签擦拭去除骨膜后，使用牙科棉球将颅骨表面擦干，并用高速钻头和小型钢制磨头在预定注射部位周围做标记，然后沿标记边缘在颅骨上钻孔。根据需要使用生理盐水清除骨屑并清洁颅骨表面。下一步是将含有病毒载体的移液管通过显微操作仪缓慢插入脑内，推进至以下坐标位置：以前囟表面为参考点，前-后向 +0.8 毫米，内-外向 +2.0 毫米，背-腹向 -2.4 毫米。注意，这些坐标意味着显微注射针尖位于左侧背外侧纹状体上方，仅轻微穿入该核团内。以 0.2 微升每分钟的注射速率开始注射，注入约 1 至 1.5 微升病毒液。注射完成后，将移液管留在原位 10 分钟，然后缓慢撤出。最后使用连续的外部尼龙缝线闭合手术切口。小鼠从麻醉中恢复后，将其置于铺有加热垫的清洁笼具中，并持续保温24小时，每天

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成像细胞内Ca 2+从成年小鼠使用基因编码的钙指标纹状体星形胶质细胞信号

我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。...

测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。...

制备用于钙成像的急性侧脑室下区脑片

来源：Bannai, H., et. al., 利用膜靶向Ca2+指示剂解析培养细胞中的局部Ca2+信号。 J. Vis. Exp.

星形胶质细胞区室特异性动态的自发钙成像

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca2+ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca2+ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析2+...

时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca2+...

成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

本方案描述了制备一个大型（6 x 3 mm）2) 使用食品保鲜膜、透明硅胶和盖玻片制作颅窗。该颅窗可允许 体内...

体内 宽场与双光子钙成像技术在小鼠大颅窗中的应用

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案全面描述了一种可同时记录多个与记忆相关脑区中神经元和星形胶质细胞钙信号的方法，并展示了其在学习与记忆行为范式中的应用。...

一种双色光纤光度法用于记录学习与记忆行为过程中多个脑区的星形胶质细胞-神经元活动

了解利用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞进行钙信号成像的方法。该技术通过腺相关病毒注射实现特异性表达，结合共聚焦显微镜成像，为研究星形胶质细胞功能提供了可靠工具。

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 Ca²⁺ 信号进行成像

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