Name: 指南现代荧光定量免疫印迹与故障排除策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习现代荧光定量免疫印迹技术，通过电泳分离、半干转膜和荧光标记抗体检测，实现多种生物样本中膜蛋白和可溶性蛋白的高灵敏度定量分析。该方法适用于神经科学和生物化学研究。

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我们感谢以下机构提供的经费支持：BBSRC 研究所战略项目基金 - CF &amp;#38; TMW；BBSRC 东部生物科学博士培训项目资助——LG；爱丁堡达尔文信托基金——MLH。我们还要感谢 Barry McColl 博士允许我们在本文中纳入 TREM2 优化实验。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在开展任何实验之前，充分的考虑与规划至关重要，这最终将决定所用技术的成败。利用蛋白质印迹（WB）进行蛋白质检测的技术进步，在选择合适的抗体、转膜及显影方法时，可能会带来大量潜在的障碍。幸运的是，通过谨慎使用检查清单并采取适当的对照措施，荧光定量蛋白质印迹（QFWB）可被常规用于检测蛋白质的存在，以及样品间日益细微的表达差异。本方案提供了荧光定量蛋白质印迹的全面操作指南，并介绍了一些故障排除策略，以帮助避免和/或克服与此技术相关的诸多常见问题。
为保持灵敏度并获得真正可定量和可比较的测量结果，关键步骤包括：1）从组织样本中进行高效的蛋白质提取；2）样本制备；3）通过总蛋白分析确定准确的蛋白上样量；4）使用I-Blot实现蛋白质的最佳转膜；5）在含有0.1% Tween20的封闭缓冲液中配制一抗和二抗；以及6）利用红外成像仪及相关软件进行正确的可视化和分析。
红外荧光检测具有真正的定量性，与更传统的化学发光（ECL）检测技术相比，灵敏度更高3,11。该检测系统具有多种功能，因此不仅限于定量全组织印迹（QFWB）。该系统能够在低倍率下对免疫组织标记进行成像，从而实现对整个组织切片的可视化与定量分析12。在分辨率方面，这代表了一个潜在的未来发展方向，即远红成像在定量评估方面有望媲美传统显微镜下的常规免疫荧光成像。
然而，由于对蛋白质表达的微小变化具有更高的敏感性，因此必须确保变异程度尽可能最低，并采取严格的对照措施和稳健的实验方案。这包括从组织样本中进行严谨的蛋白质提取，随后制备总蛋白染色凝胶，以确认上样量的一致性；优化一抗和二抗的使用条件，以判断信号检测的真实性；并根据制造商提供的指南测试转膜时间，以实现高效的蛋白质转移。
然而，即使在对 WB 条件进行优化后，进行 Western blot 实验时仍可能存在一些尚未充分探讨的问题。这些问题包括但不限于蛋白质溶解以及提取缓冲液的选择。某些缓冲液可能干扰蛋白质浓度测定，而某些组织特别难以溶解，需要更高效的处理方法，例如使用 M 管等自动化研磨密闭容器配合 Macs 组织解离仪。此外，将提取后和未提取的样品在 -80 °C 下妥善保存这一简单的控制措施，可能决定了在提取后立即获得理想标记结果，还是数周后出现不良结果。
现代定量荧光Western印迹（QFWB）方法已被证实比传统的ECL等技术更灵敏，能够检测蛋白质表达的细微差异，并且具有更高的灵活性，可实现同时双重标记3。为了实现准确的定量和统计分析，Western印迹实验方案必须具有高度的稳健性和可重复性。本实验方案灵敏度高、重复性好，可常规用于多种不同组织样本和物种中蛋白质的检测3，并可在同一次QFWB实验中对低丰度和高丰度蛋白质进行定量，从而减少试剂消耗和每项实验所需时间11。此外，该技术的灵敏度提高使其可用于验证日益流行的组学（-omic）研究9,14，但准确性至关重要，必须严格采取适当的对照措施，以避免获得错误的数据。

蛋白质印迹（Western blotting，WB）是一种分析技术，最初于20世纪70年代末期开发，用于检测复杂生物样品（如组织匀浆）中是否存在目标蛋白质1。由于该技术依赖关键的抗体-抗原相互作用，通常被称为蛋白质免疫印迹。该方法包含五个明确的步骤：1）按蛋白质的等电点进行电泳分离；2）将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；3）使用针对目标蛋白的特异性一抗进行标记；4）孵育针对一抗的二抗；5）显影检测。
随着时间的推移，可视化技术不断发展，以提高安全性和灵敏度。最早的蛋白印迹（Western blot, WB）实验采用放射性标记探针，随后发展为比色法，再演变为目前更为广泛使用的化学发光法（ECL）。放射性标记是将放射性同位素直接连接到特异性抗原的探针上，而比色法和ECL方法则采用间接标记技术，使用酶作为报告分子，例如碱性磷酸酶或链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）2。通过密度测定法测量显色或发光产物的标记强度，信号的强弱可反映样品中目标蛋白含量的多少。ECL方法灵敏度更高，因此更受青睐2，但这三种方法最初均基于X光胶片成像，之后逐步建立了更为先进的数字成像技术3。蛋白印迹数字成像技术的进步，不仅使研究人员能够判断目标蛋白在样品中是否存在，还可通过与其他样品比较，推断特定蛋白的表达水平，因此可称为“半定量”分析。近年来，一种真正实现定量且灵敏度更高的蛋白印迹技术被开发出来，该技术通过测定荧光信号强度，直接反映样品中单个蛋白的含量与表达水平：即定量荧光蛋白印迹技术（QFWB）。
在比较QFWB与ECL标记方法时，使用荧光二抗可产生线性检测曲线4。这与ECL技术形成对比，后者通常仅在蛋白上样量低于5 μg时呈现信号线性，而信号饱和则与蛋白表达水平直接相关，即与普遍表达的管家基因相关5,6。这种差异很可能是由于生物素化二抗上存在更多的结合位点，使亲和素-ECL底物更易结合，从而更易导致信号饱和。这正是ECL基础免疫印迹法通常被称为“半定量”的主要原因之一7。在检测表达水平微小差异时，信号饱和点至关重要，可能引起测量结果不准确。近年来，随着高通量蛋白质组学技术的发展，其灵敏度不断提高，并能识别更细微的表达差异，使得研究对真正定量的Western印迹验证实验的依赖日益增加8,9。因此，采用灵敏、稳健且真正定量的方法至关重要。
许多独立实验室已采用各种“优化”的蛋白质印迹（Western blotting）方法，但由于方法学上的细微调整在正式记录的实验方案中往往不明显，这些方法通常难以建立或重复。本文提供了一种经过验证且可靠的快速荧光蛋白质印迹（QFWB）实验方案，并进一步提供了在实施过程中可能遇到的常见问题的实用解决方案与优化策略。
该方案最初针对小鼠脑组织匀浆进行优化，但此后已成功应用于多种组织样本和物种4,9,10。文中包含了针对特定故障排除问题所需的潜在方案调整。

<table><tbody><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M 管</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转膜套装，PVDF 常规</td><td>Life Technologies, UK</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP 西部蛋白标准品（20–220 kDa）</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>用于凝胶 1 的 Western blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue 预染蛋白标准品</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&amp;nbsp;</td><td>用于凝胶 2 总蛋白染色凝胶</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 上样缓冲液 4x</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（仅用于 Bis-Tris 凝胶）(20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris 凝胶 1.0 mm，12 孔</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 封闭缓冲液</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (H+L)，0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 驴抗小鼠 IgG (H+L)，0.5 mg&amp;nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG (H + L)，0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 驴抗山羊 IgG (H + L)，0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL 近红外成像系统</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>索取报价</td></tr><tr><td>iBlot 7 分钟转膜系统</td><td>Life technologies, UK</td><td></td><td>该型号已停产</td></tr><tr><td>InstantBlue 蛋白染色液</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot 西部印迹 stripping 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

现代定量荧光western印迹技术指南及故障排除策略

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

20世纪70年代末，首次公开报道了蛋白质印迹法（western blot）的使用，该技术用于检测复杂生物样品中特定蛋白质的存在及其相对丰度。自那时以来，蛋白质印迹技术已成为分子生物学家实验手段中的常用组成部分。在PubMed数据库中以“western blot”为关键词进行粗略检索可知，截至2014年，已有超过22万篇已发表的论文使用了该技术。尤为重要的是，近十年来，成像技术的进步与高灵敏度荧光标记物的开发相结合，显著提高了检测灵敏度，并进一步拓展了线性检测范围。其结果是，如今已发展出真正可定量的基于荧光的蛋白质印迹法（QFWB），使生物学家能够以前所未有的灵敏度和准确性开展比较性表达分析。目前存在多种“优化”的蛋白质印迹方法，并在不同实验室中被使用。然而，由于这些方法往往需要进行细微但未明确记录的操作步骤调整，因此在实际应用中常难以重复。本实验方案详细描述了一种成熟且可靠的QFWB方法，并提供了相应的故障排除策略。

由于QFWB检测的灵敏度和线性检测范围高于传统的ECL检测，因此必须采取若干关键的对照措施，以确保获得准确的数据，从而有助于有效的结果解读。首先，应设置阳性对照样本，如图1所示。其次，需优化转膜条件，以确保高分子量和低分子量蛋白从凝胶向膜的转移效率一致，如图2所示。第三，需对抗体进行优化，尤其是常被忽视的二抗优化，因为二抗可能产生非特异性条带，干扰对目标蛋白的正确解读，参见图3。第四，当某蛋白理论上应存在却无法检测到时，可能也是由于二抗的问题，此时可通过使用来自不同宿主物种的二抗来解决，参见图4。第五，与传统使用的单一组成型表达蛋白作为内参标准相比，总蛋白标记与分析是一种更为稳健且可量化的定量方法3。许多此类单一内参蛋白在神经退行性疾病模型中以及不同组织样本之间均被发现存在差异表达，且在同一组织内的表达均匀性也可能发生变化3。因此，通过总蛋白分析，结合各泳道在不同分子量范围内的蛋白上样量比较与定量，可生成上样对照凝胶图谱，用以确认各样本上样量的一致性，并显示标准误差，如图6所示。重要的是，所有这些故障排除技术和对照措施的有效性，取决于操作人员所采用分析工具的灵敏度与一致性（图5）。最后，由于QFWB技术具有更高的灵敏度、更低的背景信号、双色检测能力以及膜在长期储存条件下的稳定性等优势，其在膜的剥离与重复杂交方面比ECL更具灵活性。参见图7。

利用荧光技术改进的蛋白质印迹法（Western blotting）使得检测蛋白质表达的微小变化成为可能，从而实现定量分析。本文介绍了一种在多种物种和组织类型中检测多种蛋白质的可靠方法，并提供了解决常见技术问题的策略。

现代定量荧光Western印迹技术指南及故障排除策略

20世纪70年代末，首次公开报道了蛋白质印迹（western blot）技术的使用，该技术用于检测特定蛋白质的存在及其相对丰度……

本实验的目的是利用定量荧光转印与印迹技术，检测并准确定量复杂生物样品中特定蛋白质的相对丰度。首先，使用预制梯度凝胶通过电荧光方法分离蛋白质提取物；第二步，通过总蛋白染色验证所有样品泳道中的蛋白质上样量是否一致，然后采用iBlot半干转印系统将蛋白质转移至PVDF膜上。最后，使用特异性的一抗孵育蛋白质，随后加入相应的荧光标记二抗，以实现对目标蛋白在红外和远红波长下的高灵敏度、稳健且线性的检测。最终，定量荧光 Western 印迹技术可用于在多种组织样本中可重复地检测、可视化并精确量化大量膜结合蛋白和可溶性蛋白。该技术相较于现有方法（如基于化学发光的成像）的主要优势在于，能够在更宽的线性范围内提供更高的灵敏度和更强的定量精确性。首先手动研磨组织样本，然后在新配制的提取缓冲液中进行匀浆处理，组织重量与缓冲液体积的比例约为 1:10，持续匀浆直至形成均匀一致的组织匀浆液。接下来，在 4°C 条件下，以 20,000 × g 离心细胞裂解液 20 分钟。然后将含有可溶性蛋白质的上清液转移至新的洁净微量离心管中，并将沉淀和上清液组分均在 -80°C 下保存，直至后续使用。测定上清液中的蛋白质浓度后，将每份样品 15 µg 蛋白质转移至新的微量离心管中。然后用蒸馏水将每个样品的终体积补至10微升，并加入5微升Forex上样缓冲液。通过涡旋充分混匀细胞溶液，随后在98摄氏度加热2分钟以使蛋白质变性。蛋白质变性后，在每块实验凝胶和上样对照凝胶的第一个加样孔中加入3微升适当分子量标准品。随后，电泳结束后，将每个样品 10 微升加入相应的后续加样孔中。使用凝胶切刀将凝胶从胶盒中取出，并切除加样孔及凝胶底部。对凝胶进行标记，以便后续定位。然后，为了确定等量的蛋白质上样量，将约30毫升蛋白质染色液倒入一个12厘米×12厘米的方形培养皿中，并将上样对照凝胶放入染色液内，确保溶液完全覆盖凝胶。室温下轻轻振荡凝胶至少一小时，随后弃去蛋白质染色液，并在进行肉眼观察前用蒸馏水洗涤凝胶三次。两次半干式快速蛋白质转膜：电泳完成后，通过移除底部转膜叠层的铝箔盖，并直接从凝胶槽中用运行缓冲液预先润湿膜，来准备转膜装置的底部叠层。此时也用蒸馏水重新润湿滤纸。接下来，将实验凝胶放置在已准备好的底部转膜叠层上，然后将预处理的滤纸覆盖在凝胶上，并用滚轴轻轻滚压，以确保各层之间无气泡残留。最后将顶部叠层放置在滤纸和底部叠层之上。然后滚动转移夹心结构以去除任何气泡。将转移夹心试剂盒中的海绵插入吸水垫上，并将转移夹心结构放入指定位置。接着牢固地盖上盖子，并启动 I 块二，在程序三下转移蛋白质七分钟。程序结束后，从转印装置中取出转移夹心结构，揭开顶部的转移夹心层和滤纸层，暴露出底部转移夹心层上的凝胶。使用解剖刀沿凝胶边缘切割，并在膜上保留一个三角形切口以作方向标记。在修整膜后，通过蛋白染色检查转印效率时，如前所述取出凝胶，然后迅速将膜转移至一个洁净的 50 毫升离心管中，管内含有 5 毫升 PBS，进行三次、每次五分钟的洗涤，置于机械滚轮上轻轻摇动。第三次洗涤结束后，弃去洗涤缓冲液，并将膜在未稀释的封闭缓冲液中室温孵育至少 30 分钟。接下来，将膜置于含有5毫升封闭缓冲液和0.1% Tween-20的稀释液中，加入一抗，于4°C在持续振荡条件下孵育过夜。次日早晨，弃去一抗溶液后，用PBS如前所述清洗膜6次，每次5分钟。然后，在避光条件下，将膜与荧光标记的二抗在含有5毫升封闭缓冲液和0.1% Tween-20的稀释液中孵育，并持续振荡，随后进行6次每次5分钟的PBS清洗，以用于所有成像分析。首先，登录计算机和成像仪，然后打开成像软件以对 Western 印迹进行成像。先打开成像仪的盖子，并在玻璃上倒入少量 PBS。将膜放置在成像仪左下角，使其位于 PBS 上方，确保膜与成像仪的坐标轴对齐，并在膜与网格坐标轴之间留出 1 厘米的间隙。轻轻滚动膜以确保玻璃与膜之间无气泡残留，然后记录膜在 x 轴和 y 轴方向所占据的方格数。接着，关闭成像仪盖子，并将方格数输入计算机软件中。选择适当的红外通道和合适的强度，开始扫描以显示上样对照凝胶的总蛋白染色情况。按照之前演示的实验膜的方法修复凝胶和成像仪，然后选择700通道。将强度设置为5，开始扫描。为了量化扫描数据，首先调整扫描文件的亮度和对比度按钮，以获得最佳图像质量，并根据需要旋转图像以达到所需的方向。接着，从形状菜单中选择一个矩形，用它在整条泳道周围绘制一个矩形框。在样品泳道一中。将泳道一周围的形状复制并粘贴到样品泳道二。在确认背景测量未将信号带入相邻泳道后，为其余各样品泳道分别绘制一个矩形区域。然后以任意荧光单位显示为每个绘制的矩形对应的形状表中的信号，并将图像保存为 TIFF 文件。在定量荧光 Western 印迹过程中，有若干项关键的对照措施对于确保准确收集数据至关重要。例如，应包含阳性对照样本。其次，优化转膜时间非常重要，以确保高分子量和低分子量蛋白质从凝胶向膜的转移程度相当。第三，必须确定合适的初级抗体和次级抗体稀释比例，以避免因非特异性条带导致对目标蛋白的错误解读，如这些图像所示。第四，在预期蛋白条带未能被检测到的情况下，应考虑是否需要使用不同宿主物种产生的次级抗体。第五，制备上样对照凝胶可确认样品上样的一致性。结合总蛋白分析，该凝胶可用于比较和定量各泳道在不同分子量范围内相对于每个样品的蛋白上样量。最后，由于具有包括但不限于更高的灵敏度、更低的背景、双色检测以及在长期储存条件下膜的稳定性等优势，该技术在膜的剥离和重新杂交方面比化学发光更具灵活性。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用定量荧光 Western 印迹法检测并准确定量目标蛋白，以及如何排除该技术操作过程中可能出现的常见问题。

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