现代定量荧光Western印迹技术指南及故障排除策略

本实验的目的是利用定量荧光转印与印迹技术，检测并准确定量复杂生物样品中特定蛋白质的相对丰度。首先，使用预制梯度凝胶通过电荧光方法分离蛋白质提取物；第二步，通过总蛋白染色验证所有样品泳道中的蛋白质上样量是否一致，然后采用iBlot半干转印系统将蛋白质转移至PVDF膜上。

最后，使用特异性的一抗孵育蛋白质，随后加入相应的荧光标记二抗，以实现对目标蛋白在红外和远红波长下的高灵敏度、稳健且线性的检测。最终，定量荧光 Western 印迹技术可用于在多种组织样本中可重复地检测、可视化并精确量化大量膜结合蛋白和可溶性蛋白。该技术相较于现有方法（如基于化学发光的成像）的主要优势在于，能够在更宽的线性范围内提供更高的灵敏度和更强的定量精确性。首先手动研磨组织样本，然后在新配制的提取缓冲液中进行匀浆处理，组织重量与缓冲液体积的比例约为 1:10，持续匀浆直至形成均匀一致的组织匀浆液。

接下来，在 4°C 条件下，以 20,000 × g 离心细胞裂解液 20 分钟。然后将含有可溶性蛋白质的上清液转移至新的洁净微量离心管中，并将沉淀和上清液组分均在 -80°C 下保存，直至后续使用。测定上清液中的蛋白质浓度后，将每份样品 15 µg 蛋白质转移至新的微量离心管中。

然后用蒸馏水将每个样品的终体积补至10微升，并加入5微升Forex上样缓冲液。通过涡旋充分混匀细胞溶液，随后在98摄氏度加热2分钟以使蛋白质变性。蛋白质变性后，在每块实验凝胶和上样对照凝胶的第一个加样孔中加入3微升适当分子量标准品。

随后，电泳结束后，将每个样品 10 微升加入相应的后续加样孔中。使用凝胶切刀将凝胶从胶盒中取出，并切除加样孔及凝胶底部。对凝胶进行标记，以便后续定位。

然后，为了确定等量的蛋白质上样量，将约30毫升蛋白质染色液倒入一个12厘米×12厘米的方形培养皿中，并将上样对照凝胶放入染色液内，确保溶液完全覆盖凝胶。室温下轻轻振荡凝胶至少一小时，随后弃去蛋白质染色液，并在进行肉眼观察前用蒸馏水洗涤凝胶三次。两次半干式快速蛋白质转膜：电泳完成后，通过移除底部转膜叠层的铝箔盖，并直接从凝胶槽中用运行缓冲液预先润湿膜，来准备转膜装置的底部叠层。

此时也用蒸馏水重新润湿滤纸。接下来，将实验凝胶放置在已准备好的底部转膜叠层上，然后将预处理的滤纸覆盖在凝胶上，并用滚轴轻轻滚压，以确保各层之间无气泡残留。最后将顶部叠层放置在滤纸和底部叠层之上。

然后滚动转移夹心结构以去除任何气泡。将转移夹心试剂盒中的海绵插入吸水垫上，并将转移夹心结构放入指定位置。接着牢固地盖上盖子，并启动 I 块二，在程序三下转移蛋白质七分钟。

程序结束后，从转印装置中取出转移夹心结构，揭开顶部的转移夹心层和滤纸层，暴露出底部转移夹心层上的凝胶。使用解剖刀沿凝胶边缘切割，并在膜上保留一个三角形切口以作方向标记。在修整膜后，通过蛋白染色检查转印效率时，如前所述取出凝胶，然后迅速将膜转移至一个洁净的 50 毫升离心管中，管内含有 5 毫升 PBS，进行三次、每次五分钟的洗涤，置于机械滚轮上轻轻摇动。第三次洗涤结束后，弃去洗涤缓冲液，并将膜在未稀释的封闭缓冲液中室温孵育至少 30 分钟。

接下来，将膜置于含有5毫升封闭缓冲液和0.1% Tween-20的稀释液中，加入一抗，于4°C在持续振荡条件下孵育过夜。次日早晨，弃去一抗溶液后，用PBS如前所述清洗膜6次，每次5分钟。然后，在避光条件下，将膜与荧光标记的二抗在含有5毫升封闭缓冲液和0.1% Tween-20的稀释液中孵育，并持续振荡，随后进行6次每次5分钟的PBS清洗，以用于所有成像分析。

首先，登录计算机和成像仪，然后打开成像软件以对 Western 印迹进行成像。先打开成像仪的盖子，并在玻璃上倒入少量 PBS。

将膜放置在成像仪左下角，使其位于 PBS 上方，确保膜与成像仪的坐标轴对齐，并在膜与网格坐标轴之间留出 1 厘米的间隙。轻轻滚动膜以确保玻璃与膜之间无气泡残留，然后记录膜在 x 轴和 y 轴方向所占据的方格数。接着，关闭成像仪盖子，并将方格数输入计算机软件中。

选择适当的红外通道和合适的强度，开始扫描以显示上样对照凝胶的总蛋白染色情况。按照之前演示的实验膜的方法修复凝胶和成像仪，然后选择700通道。将强度设置为5，开始扫描。

为了量化扫描数据，首先调整扫描文件的亮度和对比度按钮，以获得最佳图像质量，并根据需要旋转图像以达到所需的方向。接着，从形状菜单中选择一个矩形，用它在整条泳道周围绘制一个矩形框。

在样品泳道一中。将泳道一周围的形状复制并粘贴到样品泳道二。在确认背景测量未将信号带入相邻泳道后，为其余各样品泳道分别绘制一个矩形区域。

然后以任意荧光单位显示为每个绘制的矩形对应的形状表中的信号，并将图像保存为 TIFF 文件。在定量荧光 Western 印迹过程中，有若干项关键的对照措施对于确保准确收集数据至关重要。例如，应包含阳性对照样本。

其次，优化转膜时间非常重要，以确保高分子量和低分子量蛋白质从凝胶向膜的转移程度相当。第三，必须确定合适的初级抗体和次级抗体稀释比例，以避免因非特异性条带导致对目标蛋白的错误解读，如这些图像所示。第四，在预期蛋白条带未能被检测到的情况下，应考虑是否需要使用不同宿主物种产生的次级抗体。

第五，制备上样对照凝胶可确认样品上样的一致性。结合总蛋白分析，该凝胶可用于比较和定量各泳道在不同分子量范围内相对于每个样品的蛋白上样量。最后，由于具有包括但不限于更高的灵敏度、更低的背景、双色检测以及在长期储存条件下膜的稳定性等优势，该技术在膜的剥离和重新杂交方面比化学发光更具灵活性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用定量荧光 Western 印迹法检测并准确定量目标蛋白，以及如何排除该技术操作过程中可能出现的常见问题。