Name: 隔离和人力富集脂肪基质细胞的成骨增强 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习使用流式细胞术分离具有增强成骨潜能的人脂肪基质细胞亚群的方法。该技术通过特异性抗体标记和细胞分选，为颅面骨骼重建和再生医学研究提供重要的细胞来源。

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本研究由美国国立卫生研究院研究基金 R01-DE021683-01 和美国国立卫生研究院研究基金 R01-DE019434 资助，受资助者为 M.T.L.；M.T.C. 获得霍华德·休斯医学研究所研究奖学金资助；D.C.W. 获美国外科医师学会 Franklin Martin 教师研究奖学金、Hagey 儿科再生医学实验室以及斯坦福大学儿童健康研究所教师学者奖资助。

注意：所有患者样本均在获得知情同意后采集，实验方案已通过斯坦福大学机构审查委员会（方案编号 #2188 和 #9999）的审查和批准。
1. 细胞分离与培养：
<ol>
	<li>从接受腹部、侧腹和/或大腿区域择期脂肪抽吸术的健康女性患者中获取人皮下脂肪组织。确保已获得机构审查委员会（IRB）对从人组织中分离ASCs的方案的批准，并在处理此类材料时遵循机构的安全防护措施。</li>
	<li>为从脂肪抽吸物中获取基质血管组分（SVF），首先用等体积的1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脂肪抽吸物三次。小心吸除并弃去底部水相层。</li>
	<li>配制胶原酶消化缓冲液：0.075% I型胶原酶溶于Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中。配制FACS缓冲液：PBS中含2% FBS、1% P188和1%青霉素-链霉素。使用市售的0.22 μm孔径快速流速聚醚砜滤器过滤上述两种溶液。</li>
	<li>为消化清洗后的脂肪组织，加入等体积的胶原酶消化缓冲液，并将消化容器稳妥置于摇动水浴中，在37 °C下消化60分钟（约180次/分钟）。 
	注意：最好使用比所需体积更大的消化容器，以便在振荡过程中实现最大程度的消化（即，250 ml胶原酶消化缓冲液与250 ml清洗后的脂肪组织置于1L无菌烧瓶中）。</li>
	<li>加入等体积的FACS缓冲液以中和酶活性，并在室温下静置5分钟。随后在4 °C下以233 × g离心20分钟。</li>
	<li>小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动高密度的SVF沉淀。</li>
	<li>根据沉淀物大小，用5–10 ml室温红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。室温静置5分钟&#160;，然后在室温下以233 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并根据沉淀物大小加入5–10 ml传统生长培养基重悬沉淀（DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素溶液[pen-strep]）。</li>
	<li>将细胞悬液通过100 μm尼龙细胞滤器过滤，以去除细胞碎片。</li>
	<li>在4 °C下以233 × g离心5分钟，弃去上清液，注意不要破坏沉淀。</li>
	<li>根据沉淀物大小，用5–10 ml传统生长培养基重悬沉淀。</li>
	<li>将2 × 106个细胞接种于15 cm标准培养皿中，在37 °C、21% O2、5% CO2条件下过夜建立原代培养。维持培养物处于亚融合状态，以防止在37 °C、21% O2、5% CO2条件下使用生长培养基时发生自发性分化。 
	注意：一个完全融合的15 cm培养皿中的细胞密度约为4–6 × 106个细胞。</li>
</ol>
2. 染色
<ol>
	<li>在染色/分选前，将ASCs在传统生长培养基中于37 °C、21% O2、5% CO2条件下培养36小时。</li>
	<li>使用Accutase从培养板上消化ASCs（按照制造商的操作说明）。</li>
	<li>用FACS缓冲液（含2% FBS和1%青霉素-链霉素的PBS）洗涤细胞一次。</li>
	<li>在4 °C下以233 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。根据细胞数量和所需抗体用量，将细胞重悬于0.5–1 mL FACS缓冲液中。 
	注意：细胞悬液的体积应根据FACS抗体制造商的建议确定抗体浓度。但如果首次使用某种抗体，通常建议进行抗体浓度滴定，起始浓度可设为1:100。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数总细胞数。</li>
	<li>将100 μL等分试样保留于1.5 mL离心管中，用于未染色样本及单色对照（根据所用荧光抗体的数量设置）。</li>
	<li>加入适当浓度的荧光标记单克隆抗体（根据制造商说明预先确定浓度），避光冰上孵育20–30分钟。
	<ol>
		<li>标记成骨亚群：将抗CD90抗体（APC标记抗人CD90（Thy1））或抗CD105抗体（FITC标记抗人CD105（endoglin））用FACS缓冲液按1:50稀释。</li>
		<li>标记其他细胞群体（例如，造血细胞和内皮细胞）：将抗CD45抗体（Pacific Blue标记抗人CD45）、抗CD34抗体（APC标记抗人CD34）和/或抗CD31抗体（PE标记抗人CD31）用FACS缓冲液按1:50稀释。</li>
		<li>若未使用直接偶联抗体，可采用生物素标记的一抗与相应的链霉亲和素偶联二抗（如Streptavidin PE-Cy7）联合使用，稀释比例为1:100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次：将离心管加满FACS缓冲液，在4 °C下以233 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于400–500 μl&#160;FACS缓冲液中，并通过70 μm尼龙细胞滤网过滤，以去除细胞团块。</li>
	<li>将标记后的细胞转移至带滤膜帽的FACS管中，分析期间始终保持样本在冰上。</li>
</ol>
3. 荧光激活细胞分选
注意：以下步骤要求操作者具备荧光激活细胞分选（FACS）的相关知识，或需由熟练的技术人员协助完成。
<ol>
	<li>使用适当的FACS软件设计分析图，以检测前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）、藻红蛋白-得克萨斯红（PE-Texas Red）、太平洋蓝（Pacific Blue）、异硫氰酸荧光素（FITC）、别藻蓝蛋白（APC）以及用于标记细胞的任何其他荧光染料。</li>
	<li>上样至细胞分选仪前，轻轻涡旋振荡每个样品以重悬细胞。</li>
	<li>首先分析未染色样本，以设定总细胞群的门控，排除细胞碎片，并确定自发荧光基线。</li>
	<li>向未染色样品中加入碘化丙啶（PI），并进行分析，以观察总细胞群体中活细胞的群体。围绕该群体设置门控。</li>
	<li>针对每种荧光染料分析单色对照样本，以设置荧光补偿。</li>
	<li>分析染色样本以确定分选门的位置。</li>
	<li>加入PI对染色样本进行死细胞染色。</li>
	<li>分选标记的细胞群体。将细胞分选至含有培养基的1.5 ml离心管或15 ml锥形管中。</li>
	<li>当获得所需数量的细胞后，手动停止分选。</li>
	<li>使用FACS，通过分析一小部分（例如所获细胞群体的500个细胞。 
	注意：此步骤用于确认分选后细胞群体的纯度。理想情况下，纯度应大于90-95%。</li>
	<li>分选完成后，立即在 4 °C 下以 233 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 1 ml 含 10% FBS 的新鲜培养基中。 
	注意：培养基的用量可根据细胞沉淀的大小适当增加。</li>
	<li>接种于明胶包被的培养板上以提高细胞存活率。根据最终细胞产量，将300,000个细胞接种至6孔板的每孔中，或将100,000个细胞接种至12孔板的每孔中。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均对本文中提到的任何产品、设备或药物没有经济利益。所有作者均无任何需要申报的竞争性经济利益。

目前，从人脂肪组织的基质血管组分（SVF）中分离出均一的脂肪源性干细胞（ASCs）亚群仍然是一个具有挑战性但值得追求的目标。其中，分离具有促成骨潜能的ASC亚群尤为理想，因为这类细胞可用于研究骨骼组织的形成与稳态。然而，脂肪组织的SVF在干细胞能力及分化潜能方面具有显著的异质性11。这种异质性的分子基础无法通过细胞混合群体来理解，而必须依赖单细胞分析12。通过这一方法，可鉴定出与ASC成骨分化潜能密切相关的表面标志物。
如上述方法所述，成功富集ASCs最关键的因素除了所使用的抗体外，还与FACS过程中采用的抗体密切相关。必须谨慎选择对目标细胞表面标志物具有高亲和力的抗体。理想情况下，应使用直接偶联的一抗，而不是需要多步操作的间接染色法，因为后者会增加细胞死亡、细胞丢失和误差累积的风险。此外，在FACS过程中进行一些细微优化可提高细胞活力，包括将细胞分选至低温容器中、始终将细胞置于冰上、将细胞分选至含有培养基的容器中，以及将分选获得的细胞群体接种到预先用10%明胶包被的培养板上。进行分选后纯度分析非常重要，以确保分选细胞的纯度。
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干细胞群体的异质性尚未被完全理解，这仍是开发临床有效的干细胞治疗应用的主要障碍之一。对干细胞异质性群体进行表征的最常用方法之一是采用细胞分选技术，例如基于荧光激活的细胞分选（FACS），根据细胞表面标志物的表达谱对其进行分离。随着分选方法日益复杂，人们得以识别出更多具有不同功能的细胞亚群。基于微流控的技术正越来越多地被用于单细胞水平的基因表达分析。在微流控芯片中进行多重定量聚合酶链式反应（qPCR），可实现高效、可靠、高分辨率的单细胞转录分析。1-5
在之前一项使用48个基因的单细胞转录谱分析的研究中，发现ASCs之间存在显著的转录异质性。6 然而，基因 MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 的分布与一群具有高度成骨转录特征的细胞簇表现出强烈关联。为了根据这一成骨基因表达谱分离细胞，研究人员将表面抗原表达模式与转录模式进行关联分析，随后发现内皮素（CD105）的表面标志物表达与ASCs增强的成骨分化潜能密切相关。除CD105表达外，表面受体Thy-1（CD90）的表达——一种由Chen et al. 早前证实与成骨前体细胞相关的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白——也被发现与成骨相关基因表达相关联。6,7 这些发现为前瞻性地从异质性较强的ASC群体中分离出具有更高成骨能力的亚群提供了可能，从而促进基于细胞的骨组织工程应用。

<table><tbody><tr><td>一次性 250 ml 锥形管</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘 - 抗菌消毒液</td><td>Purdue&amp;nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液，1×</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，美国来源</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>来自&amp;nbsp;Clostridium histolyticum 的胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE 细胞解离溶液</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记小鼠抗人 CD90 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗人 CD105（内皮糖蛋白）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45 eFluor 450 抗体（Pacific Blue 替代品）&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD34 APC 抗体</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD31（PECAM-1）PE 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II 仪器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）被认为是基于干细胞的组织工程应用中的“金标准”。然而，其获取过程可能伴随显著的供体部位并发症。相比之下，脂肪来源的基质细胞（ASCs）更为丰富且易于获取，使其成为BM-MSCs的一种有吸引力的替代选择。与BM-MSCs类似，ASCs可分化为成骨谱系细胞，并可用于组织工程应用，例如接种于支架材料上用于修复颅面部骨骼缺损。ASCs来源于消化后的脂肪组织中的基质血管组分（SVF），该组分是ASCs、血管内皮细胞和壁细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞以及循环细胞的异质性混合物。流式细胞术分析表明，ASCs的表面标志物谱与BM-MSCs相似。尽管已有若干发表的研究确立了ASC表型的标志物，但对于如何鉴定这一异质性群体中的成骨前体细胞，目前仍缺乏共识。本实验方案描述了如何分离并利用一种具有增强成骨能力的ASC亚群，以修复临界尺寸的颅骨缺损。

使用CD90作为成骨能力增强细胞的标志物，可分离出高度富集的人类ASCs群体（图1A、1B）。ASCs用Pacific Blue标记的抗人CD45抗体、FITC标记的抗人CD105抗体以及APC标记的抗人CD90抗体进行染色。分选后，通过分选后分析测定，细胞纯度高于98%。
基于转录谱对细胞群进行定义，使得两种新型亚群得以前瞻性分离。为表征各具潜力亚群（CD90）的成骨潜能+ 和 CD105低），以及未分选群体的相应指标 体外细胞在成骨分化培养基中培养14天，具体方法如前所述 6,8,9碱性磷酸酶染色（用于骨形成早期检测）10第7天时，CD90的表达显著增加+ 与其他组相比的人群图2A）。这在宏观观察和定量分析后均被观察到（图2A）。类似地，茜素红染色（一种用于检测细胞外基质矿化及终末成骨分化指标的实验方法）9在第14天显示CD90<...

利用细胞表面标志物和成骨基因，可在单细胞水平上定义人脂肪来源基质细胞内的转录异质性。我们描述了一种利用流式细胞术分离具有增强成骨潜能的细胞亚群的方案，该方案可用于增强颅面骨骼的重建。

骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）被认为是基于干细胞的组织工程应用的金标准。然而，……

本实验的总体目标是利用流式辅助细胞分选技术，分离出具有增强成骨潜能的人脂肪来源干细胞亚群。人脂肪来源干细胞（ASCs）从人脂肪抽吸物中获取，并培养36小时。随后，使用特异性抗体对细胞进行染色，以标记具有成骨潜能的细胞亚群，并通过流式辅助细胞分选技术分离目标细胞群。最终，碱性磷酸酶和偶氮染色显示分离得到的细胞具有增强的成骨潜能。该技术的意义在于再生医学及新型转化疗法的开发，因为它描述了如何分离出具有增强成骨能力的ASC亚群。以下实验操作使用健康女性患者在局部或全身麻醉下接受择期腹部、侧腹和/或大腿区域吸脂术后获得的皮下脂肪组织进行。从手术室直接获取含有500毫升至1升组织的吸引罐开始。在采集后立即开始组织处理操作，以最大限度地提高细胞活力，从而从吸脂获得的脂肪组织中获取基质血管组分（SVF）。首先按1:1的比例加入无菌PBS。然后轻轻摇动罐子以混合。混合后，静置溶液直至其分为三层。上层油相为清澈的黄色。中间脂肪层呈黏稠、不透明的黄色，下层血层为红色。小心使用血清学移液管，吸除并弃去下层血层，再吸走上层油相。然后重复此步骤，再额外清洗两次。按照随附文件中的说明配制胶原酶消化缓冲液和传真缓冲液后，将它们与红细胞裂解缓冲液一起放入生物安全柜中，使其升温至室温。随后，将洗涤后的脂肪组织转移至一个大烧瓶中，并加入等体积的胶原酶消化缓冲液进行消化。将烧瓶稳妥地置于37摄氏度的摇动水浴中，持续60分钟。最好使用比所需体积更大的消化容器，以便在振荡过程中实现最大程度的消化。例如，应将250 µL胶原酶消化缓冲液与250 mL洗涤后的脂肪组织置于一个无菌的一升锥形瓶中。孵育结束后，加入等体积的fax缓冲液以中和酶活性，并让组织在室温下静置五分钟。接下来，将消化后的组织转移至250毫升一次性锥形离心管中，在4°C条件下以233 ×g离心20分钟。离心结束后，吸除上清液，并根据沉淀物的大小，加入5至10毫升传统生长培养基重悬沉淀。然后用移液器将悬液通过一个100微米的尼龙细胞滤网转移至50毫升锥形管中，以去除任何细胞碎片。弃去上清液后，沉淀物应呈现如下所示的外观。此处，Reese，将沉淀物悬浮于10毫升室温下放置的溶液中。红细胞裂解缓冲液。将溶液在室温下静置五分钟，然后在室温下以233 ×g离心五分钟。接着在4°C下以233 ×g离心五分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。然后加入复苏液，根据沉淀物的大小，用5至10毫升的传统培养基重悬沉淀物。计数细胞后，将200万个细胞接种于10厘米的标准培养皿中，并过夜建立原代培养物。将SVF细胞维持在亚融合状态，以防止自发性分化。接种后36小时，根据制造商的方案，使用Accutase消化并收集细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞一次，然后在4°C下以233 ×g离心5分钟。离心后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用 0.5 至 1 毫升 effects.Buffer 重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将120万个细胞分配至未分选组，作为对照组单独接种。本实验中，将100微升样品转移至一个1.5毫升离心管中。针对每个待分析样本，需准备一份未染色样本，以及每种待用抗体的单色对照样本，并将其置于冰上。接下来，为标记成骨亚群，将抗CD 90或抗CD 105抗体用FACS缓冲液稀释；为标记其他细胞群体（如造血细胞和内皮细胞），将抗CD 45、抗CD 34和/或抗CD 31抗体用FACS缓冲液稀释。孵育后，用FACS缓冲液充满离心管，洗涤细胞两次，每次在4°C下以233 × g离心5分钟。第二次洗涤离心后，吸除上清液，将细胞重悬于400至500微升的效应液中。将样品通过70微米尼龙细胞滤网过滤至离心管中，以去除细胞团块。按照配套方案进行荧光激活细胞分选。使用Fact软件设计分析图，检测前向散射、侧向散射、FICO、ERYN、德克萨斯红、太平洋蓝、荧光素异硫氰酸盐、别藻青蛋白以及用于标记细胞的任何其他荧光染料。必须确保事实分析图绘制得当，以免无意中排除目标细胞群。将标记的细胞群分选至1.5毫升离心管，或含有培养基的15毫升锥形管中。手动停止分选。当本实验获得所需数量的细胞后，大约需要200万个细胞。接下来，利用已知信息，通过分析所获取细胞群体中约500个细胞的小部分样本来进行纯度检测。请注意，此步骤用于确认分选后细胞群体的纯度。理想情况下，分选后应在4°C条件下以233 ×g离心5分钟，此时细胞纯度应大于90%至95%。随后将细胞重悬于1毫升含10% FBS的新鲜培养基中，并将细胞接种至明胶包被的培养板上，以提高细胞存活率。根据最终的细胞得率，每孔接种300,000个细胞至6孔板，或每孔接种100,000个细胞。在12孔板中，分离具有增强成骨潜能的人类脂肪源性基质细胞。如本视频所示，使用太平洋蓝标记的抗人CD45抗体、FITC标记的抗人CD105抗体以及APC标记的抗人CD90抗体对ASCs进行染色，并据此进行分选。根据高表达CD90或低表达CD105进行分选，可获得高度富集的人类ASC群体。为表征这两个亚群的成骨潜能，将CD90阳性CD105低表达细胞、未分选的ASCs接种于成骨诱导分化培养基中培养14天，结果如本图所示。碱性磷酸酶染色作为成骨早期的指标，在CD90阳性群体中的表达较其他组升高，通过图像分析软件进行的定量分析证实，该差异具有显著性。同样，在第14天，用于检测细胞外基质矿化并作为终末成骨分化评估指标的茜素红染色，在CD90阳性群体中的表达也高于其他组。图像分析软件的定量结果同样证实该差异具有显著性。这些数据表明，CD90 阳性的 ASCs 比未分选的细胞能够矿化更多的细胞外基质，提示分选后获得的 ASCs 仍保留了成骨分化的能力。观看本视频后，您应能充分了解如何分离出具有增强成骨潜能的 ASCs 亚群。在处理本方案中所述的人体样本时，务必始终穿戴适当的防护服装。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

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人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

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