利用微型计算机断层扫描评估人脂肪注射物在裸鼠体内的存活能力

本实验的总体目标是描述一种利用微型CT比较不同脂肪移植物制备和输送技术间体积保留率的小鼠模型。该目标首先通过处理人体脂肪抽吸物，获得可用于移植的脂肪来实现；第二步是将脂肪移植物植入CD-1型胸腺缺陷裸鼠的头皮中。

接下来，通过每周对小鼠进行 CT 扫描、图像重建及体积保留率定量分析，评估脂肪移植物的存活情况。最后一步是在八周结束时取出脂肪移植物，并通过称重和组织学方法进行比较。最终，采用微型 CT 和组织学方法来展示脂肪移植物质量和存活率的差异。

与现有的脂肪移植物称重等方法相比，该技术的主要优势在于，无需处死实验动物，即可在移植后的多个时间点对脂肪移植物体积进行可视化及客观定量分析。我们最初在使用微型CT分析颅骨缺损时，便提出了该方法的构想。该技术的意义在于，为所有评估脂肪移植物、存留率及存活率的研究提供了一种外科模型。

通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为将脂肪移植物准确固定在头皮上方的正确位置具有挑战性。该技术的可视化演示至关重要，因为移植和重建步骤较难掌握，操作过程中存在多个环节，任何细微的技术偏差都可能影响最终结果。采用科尔曼（Coleman）方法，从接受择期吸脂术的健康女性患者的腹部、侧腰部及大腿部位获取人体脂肪组织。

进行脂肪移植前的处理时，首先让抽吸的脂肪静置30分钟。脂肪抽吸物通常会分为三层：顶部为油层，中间为脂肪层，底部为血液层。吸除并弃去顶部的油层，随后吸除并弃去底部的血液层。

为了进一步去除残留的肿胀液或细胞碎片，将脂肪在 350 ×g、4 °C 条件下离心 5 分钟。离心后，吸除底部的血液层和顶部的油层，继续后续操作。按照文本方案中所述方法计算移植所需脂肪量，进行脂肪移植时，取雌性纯合 CD-1 裸鼠。

进行实验研究时，选择 8 至 12 周龄的小鼠以诱导麻醉。将小鼠放入诱导箱中，以每分钟 2 升的速度通入含 2.5% 异氟烷的氧气混合气体，持续约 10 分钟，直至小鼠呼吸频率减慢。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度是否足够。

将兽用润滑性眼膏涂抹于小鼠双眼，将小鼠鼻部置入鼻罩，以每分钟1至2升的速度输送2.5%异氟烷-氧气混合气体。随后，在小鼠下方建立无菌区域。接着用2.5%聚维酮碘溶液消毒头皮，再用70%乙醇溶液擦拭。

重复灭菌操作两次。用已平衡至室温的1毫升脂肪反向装填一支1毫升锁紧式注射器。将一根14号、长8厘米的脂肪移植套管连接至注射器末端。

通过按压注射器活塞对系统进行预充，直至注射器内剩余 200 至 400 微升脂肪。在按压注射器活塞的同时，使用精细镊子观察远端套管孔是否有脂肪溢出，以确认套管已完全充满脂肪。提起颅骨耳廓部背侧中线处的皮肤。

使用精细剪刀在皮肤上做一个1.5毫米的切口。将一根6-0尼龙缝线穿过切口中部，后续用于对合伤口边缘。植皮操作完成后，暂不打结。

然后，通过将套管插入皮肤切口，并在颅骨上以扇形前后移动套管，分离皮肤与下方结缔组织的连接，从而在颅骨上创建一个皮下囊腔。囊腔形成后，将套管置于小鼠颅骨正中线上，使其尖端位于囊腔的远端部位，该位置应略位于两眼之间连线的后方。以逆行方式缓慢注射脂肪，在回撤套管的同时推进注射器推杆。使用镊子将伤口边缘对合，并轻轻提起，以防止脂肪从囊腔中渗出。

结扎先前放置的缝线，确保第一个结轻轻贴附于皮肤。再打三个方结，并用3毫米的线尾剪断缝线。将小鼠移出麻醉状态，并按照文本方案中详细描述的步骤进行恢复。

在进行首次扫描之前，使用能够区分空气、水和骨强度的成像模体对微型CT进行校准。校准完成后，将四只小鼠以腹侧朝上的位置放入扫描仪中，上下各放置两只。

将小鼠放置于扫描床上。此前使用60毫升注射器构建用于固定小鼠身体的支架，使用10毫升注射器作为鼻锥。通过定位像确认，将对小鼠从鼻部至第一颈椎、从颅顶至颅底的整个颅骨进行成像。

按照文本方案中详述的步骤继续进行扫描。使用能够通过设定像素强度阈值来选择体素，从而创建感兴趣区域（ROI）的显微CT图像分析软件打开重建后的图像。首先加载重建后的CT图像，以二维形式显示冠状面、轴状面和矢状面视图。

以轴向切片为参考，导航至脂肪移植物最左侧对应的矢状切片。选择一个像素强度的上限和下限阈值，以包含所有对应于脂肪移植物的体素，同时排除周围组织和骨骼。在矢状切面视图中定义一个与脂肪移植物相对应的感兴趣区域（ROI）。

根据先前定义的像素强度阈值，每隔五个矢状切片重复此操作，直至到达移植物最右侧部分。随后，将所有二维感兴趣区域（ROI）中选定的体素插值合并为一个三维组合ROI，并记录软件计算出的ROI体积。重建三维等值面以直观显示最终的脂肪移植物体积。

在后续分析中，务必保持像素强度的最大值和最小值阈值与小鼠完成第八周时间点扫描后基线分析所用的阈值一致。按照文本方案所述方法处死小鼠。将小鼠置于手术区域，使用虹膜剪仔细切开皮下 pocket 及覆盖的皮肤和结缔组织，暴露脂肪移植物。

此时，可切除覆盖的背部皮肤的一小块区域，以协助移出移植物。切除时应尽量贴近移植物，以最大限度减少移出移植物后所带出的结缔组织。使用精度至少为 0.01 克的天平称量其质量。

在研究过程中，脂肪移植物的体积逐渐减小，至第8周时平均存活率为62.2%。在完成第8周的扫描后，每块脂肪移植物均被完整地取出。采用威尔科克森秩和检验（WIL coxin rank sum test）比较通过显微CT测得的脂肪移植物体积与根据物理质量计算出的体积之间的差异。

这两种方法之间未发现显著差异。一旦掌握，若操作得当，每次可将该技术的操作时间控制在两小时内。在实施该操作时，重要的是每次均需以相同的方式进行手术和重建，以遵循本操作规程。

还可以采用其他方法，如免疫染色和定量逆转录聚合酶链式反应（Q-R-T-P-C-R），以回答更多问题，例如不同移植方法如何影响血管化程度和基因表达。观看本视频后，您应能充分了解如何对抽脂物进行系列处理以用于移植，如何通过连续 CT 扫描在活体中检测移植物，评估移植物存活情况，并对移植物进行称重、组织学分析及后续研究。该技术的建立为整形外科领域的研究人员探索脂肪移植的镜像模型奠定了基础。