Name: 一个在体外酶测定来测量转录抑制作用镓（Ⅲ）和H 3 -5,10,15-三（五氟苯基）corroles (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习体外RNA转录抑制测定法来评估镓(III)corrole类抗癌化合物的活性。该方法结合凝胶电泳与紫外可见光谱技术，可定量分析候选药物对RNA合成的抑制效果，为抗肿瘤药物筛选提供可靠的生化检测方案。

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我们衷心感谢邱辛迪博士（Dr. Cindy N. Chiu）在凝胶电泳方面的帮助，感谢周安迪（Andy Zhou）和迈克尔·格罗迪克（Michael Grodick）慷慨捐赠DNA和限制性内切酶。我们诚挚感谢希思教授（Professor J. Heath）和普罗伯教授（Professor D. Prober）慷慨提供仪器和材料的使用权限。我们感谢莎萨妮博士（Dr. Karn Sorasaenee）提出的有益建议。我们感谢唐玛丽（Mary H. Tang）为视频中示意图概览部分创作的插图。本研究由强生公司（Johnson &amp;#38; Johnson）和南加州大学（USC Y86786）提供经费支持。

注意：操作 RNA 时，应保持工作环境清洁，避免被可降解 DNA 和 RNA 的 DNase 与 RNase 酶污染。确保移液器吸头和离心管无 DNase 和 RNase。使用去污染溶液擦拭实验台面和仪器设备（如移液器、离心管架等）也有助于防止污染。
1. 伴咯啉处理的RNA转录
<ol>
	<li>以[复合物]:[DNA]摩尔比为0.01:1的比例配制corrole和抑制剂化合物。 
	注：在本实验中，该比例为4.3 fmol复合物 : 0.43 pmol DNA，所用DNA模板为带有来自E. coli的ligA基因的apET-28c载体，该基因受T7启动子调控。其他含有T7启动子的DNA也可作为转录实验的有效候选模板。
	<ol>
		<li>将放线菌素D（Actinomycin D）、雷公藤内酯（triptolide）、tpfc和Ga(tpfc)分别溶解于洁净且独立的容器中的二甲基亚砜（DMSO）中。通过使用无核酸酶水进行系列稀释，获得[复合物]:[DNA]为0.01:1摩尔比的最终浓度。
		<ol>
			<li>将1 mg放线菌素D溶解于1.8 ml DMSO中。取10 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/100稀释液。再从中取1 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/1,000稀释液。 
			注：放线菌素D终溶液的浓度为4.3 fmol。</li>
			<li>将1 mg雷公藤内酯溶解于0.64 ml DMSO中。取1 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/1,000稀释液。再从中取1 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成第二个1/1,000稀释液。 
			注：雷公藤内酯终溶液的浓度为4.3 fmol。</li>
			<li>将1 mg tpfc溶解于2.9 ml DMSO中。取10 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/100稀释液。再从中取1 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/1,000稀释液。 
			注：tpfc终溶液的浓度为4.3 fmol。</li>
			<li>将1 mg Ga(tpfc)溶解于2.6 ml DMSO中。取10 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/100稀释液。再从中取1 µl分装至另一独立容器中，并用无核酸酶水定容至1 ml，制成1/1,000稀释液。 
			注：Ga(tpfc)终溶液的浓度为4.3 fmol。 
			注：这些corrole化合物和抑制剂不溶于水，必须预先溶于DMSO。少量DMSO（低于1%）不会在细胞中引起细胞毒性（未发表数据）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始转录反应前，单独配制所需试剂或从商业供应商处购买。
	<ol>
		<li>将所有冷冻试剂置于冰上解冻（参见表1获取冷冻试剂列表）。</li>
		<li>让10x反应缓冲液和4种核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP和UTP）溶液充分混合，直至完全溶解。</li>
		<li>短暂离心所有试剂，以防止材料残留在管壁上。解冻后，将核糖核苷酸置于冰上保存，而10x反应缓冲液则保持在室温（RT）。</li>
		<li>在室温下混合转录反应所需的试剂（参见表2获取试剂列表）。 
		注：若在冰上而非室温下配制反应体系，10x反应缓冲液中的亚精胺可能导致模板DNA共沉淀。</li>
		<li>通过轻弹管壁或轻轻吹打混合溶液，确保充分混匀。混匀后短暂离心，使反应混合物集中于管底。</li>
		<li>将反应混合物在37 °C孵育总共2–4小时。 
		注：所需反应时间会因DNA模板的大小和序列而异。此步骤可能需要针对特定序列进行优化。较短的模板可能需要更长的反应时间以获得较高的总RNA产量。</li>
		<li>每小时从每个反应体系中取出4 µl等分试样，储存于-20 °C。可根据所需时间点进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNA 离心柱
<ol>
	<li>转录反应完成后，使用适合微量离心的层析柱纯化RNA。 
	注意：使用RNA离心柱纯化长度大于20个碱基的RNA时，回收率可超过80%。44 
	注意：柱层析是纯化RNA的一种常见且便捷的方法。其他纯化方法还包括氯化锂沉淀法、苯酚:氯仿抽提法、异丙醇沉淀法，以及多种市售试剂盒。
	<ol>
		<li>通过剧烈倒置柱子三次或更多次，使Sephadex基质在柱缓冲液中均匀重悬。可通过快速弹击柱子实现。</li>
		<li>取下柱子的顶部盖帽。盖帽中可能会残留部分Sephadex基质；如果盖帽内充满基质，则将盖帽重新盖回柱子上，并重复上一步操作，直至大部分基质进入柱体中。</li>
		<li>折断柱子底部的尖端。 
		注意：可能会有少量液体从柱子中流出。</li>
		<li>装填柱子。
		<ol>
			<li>将柱子放入一个无菌（无RNase和DNase）的1.5 ml微量离心管中。</li>
			<li>在台式离心机中以1,000 × g离心1分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>弃去含有从柱子中洗脱出的缓冲液的1.5 ml微量离心管。</li>
		<li>立即将柱子转移至一个新的无菌1.5 ml微量离心管中，并将样品加至柱床中央。使用20–50 µl样品，以避免过载柱子。</li>
		<li>在台式离心机中以1,000 × g离心1分钟。 
		注意：流出液即为纯化的RNA样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 琼脂糖凝胶电泳（1% 琼脂糖凝胶）42
注意：溴化乙锭在与 DNA 和 RNA 结合后会发出荧光，因此可通过将这些生物分子与 0.5 µg/ml 的溴化乙锭溶液孵育，再用紫外光照射进行可视化。
<ol>
	<li>通过将 5 mg 溴化乙锭溶解于 10 ml 水中，制备 1,000 倍浓度的溴化乙锭储存液（0.5 mg/ml）。</li>
	<li>为琼脂糖凝胶电泳制备 Tris-乙酸-EDTA（TAE）电泳缓冲液。配制 50 倍浓度 TAE 缓冲液时，将 2.0 M Tris-乙酸与 0.05 M 乙二胺四乙酸（EDTA）混合，并调节 pH 至 8.5。</li>
	<li>通过将 10 g UltraPure 琼脂糖溶解于 1 L 1×TAE 缓冲液中，并使用普通微波炉加热溶解琼脂糖，制备 1%（质量/体积）琼脂糖凝胶。待溶液冷却至 50 °C 后，向 1% 琼脂糖凝胶溶液中加入 1 ml 1,000 倍浓度的溴化乙锭，轻轻旋转或在密闭容器中倒置混匀，然后将琼脂糖溶液倒入凝胶制胶板中，在室温下使其凝固。 
	注意：溴化乙锭为诱变剂及潜在致癌物，操作时应佩戴手套并小心处理。有关溴化乙锭的正确操作规程，请参见：<a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a>。</li>
	<li>待凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中。加入足够的 TAE 缓冲液，使液面完全覆盖凝胶，淹没加样孔，确保 TAE 缓冲液液面比凝胶表面高出约 1 mm。随后小心移除梳子。 
	注意：在加样孔已被缓冲液浸没后移除梳子，可防止加样孔内产生气泡。</li>
	<li>准备 RNA 样品。将每份纯化后样品的 1 µl 等分试样与 1 µl 凝胶上样缓冲液混合（或与 1 µl 10×上样缓冲液混合，并用无核酸酶水稀释至 10 µl），使用微量移液器反复吹打以充分混匀。 
	注意：10×上样缓冲液包含 20% Ficoll 400、0.1 M Na2EDTA（pH 8.0）、1.0% SDS、0.25% 溴酚蓝。也可在上样缓冲液中添加 0.25% 二甲苯青，其迁移速度约为溴酚蓝的 50%，可用于监测长时间电泳过程。42</li>
	<li>使用移液器小心地将各样品溶液加入各加样孔底部，避免产生气泡或将样品混入相邻加样孔。 
	注意：可同时使用 RNA 分子量标记物（RNA ladder）以确定转录本的大小。</li>
	<li>连接电极，确保 RNA 向凝胶正极方向迁移。将电压设定至所需值，通常为每厘米凝胶长度 1 至 10 V。根据染料的迁移情况监测分离进程，电泳至 RNA 片段实现充分分离所需时间即可。 
	注意：23 cm × 25 cm 的凝胶在 250 V 下电泳约需 1 小时，而 8 cm × 8 cm 的凝胶在 150 V 下约需 20 分钟。较小的 RNA 片段在较高电压下具有更好的分辨率。</li>
	<li>当上样缓冲液中的染料迁移至足以实现 RNA 片段有效分离的距离时，关闭电源。</li>
	<li>在紫外光下观察 RNA，溴化乙锭将产生荧光信号。</li>
	<li>拍摄图像，并比较不同条件下纯化 RNA 的荧光强度。</li>
</ol>
4. 通过紫外-可见光谱法进行 RNA 定量
<ol>
	<li>在 NanoDrop 2000 或类似仪器上加入 2 µl H2O，测定空白值。</li>
	<li>随后，将纯化后的每种 RNA 样品各取 2 µl 加入分光光度计，测量 200 nm 至 800 nm 波长范围内的紫外-可见光吸收值。 
	注意：A260 值为 1.0 时相当于约 40 µg/ml 的 RNA，纯 RNA 的 A260/A280 比值为 2.1。45</li>
	<li>若吸光度高于 1 O.D.，则用无核酸酶水稀释样品，使 O.D. 低于 1。</li>
	<li>使用绘图软件绘制各样品的吸收曲线，并比较在 260 nm 处的 O.D. 值。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验表明，Ga(tpfc) 的加入对 RNA 转录的抑制作用与已知的 DNA 结合型抗癌复合物放线菌素 D 和雷公藤内酯相当。Ga(tpfc) 的细胞毒性行为（GI50 = 58.1–154.7 μM）可能源于其抑制特性。由于在 tpfc 中未观察到转录抑制现象，因此 tpfc 的细胞毒性并非由 RNA 转录抑制引起，而是由其他尚未研究清楚的机制所致。
在进行的四组转录反应中，DNA 分别以 [复合物]:[模板 DNA 碱基] 比值为 0.01 的条件，用放线菌素 D、雷公藤内酯、tpfc 或 Ga(tpfc) 处理，另设未处理对照组。将转录反应试剂混合后，在 37 °C 下反应 4 小时。通过 RNA 离心柱纯化转录生成的 RNA，并利用紫外-可见光谱法和凝胶电泳分析其产量。通过对此方法进行多种改进，可进一步研究转录抑制的性质，或者也可将这些化合物用于其他替代实验。 体外 和 体内 研究。为进一步确定抑制作用的分子机制，可开展额外实验，包括对可能形成的corrole-DNA加合物进行X射线晶体学分析，或对转录反应进行计算...

化疗通常涉及广谱细胞毒药物，这类药物常伴随不良副作用且靶向性有限。然而，随着对癌症生物学的深入理解，人们对靶向性更高、副作用更少的抗癌药物的需求日益增长。1 人类癌细胞常常在生存上依赖于单个被激活或过表达的癌基因。2 因此，许多抗癌药物通过其抑制RNA转录的能力进行评估。能够阻断这些转化基因表达的治疗方法在消除癌细胞方面具有显著效果，并可导致细胞死亡。3 转化细胞对RNA转录的干扰比相应的正常细胞更为敏感。4 预期能够抑制转录的抗癌药物可选择性抑制癌细胞存活所必需的癌基因的表达。5 因此，抑制RNA转录是鉴定潜在抗癌药物候选物并深入了解其作用机制的有效方法。本方案表明，Ga(tpfc)对RNA转录的抑制作用与化疗药物放线菌素D和雷公藤内酯相当；利用该方案也可对其他抗癌药物候选物进行类似的比较分析。放线菌素D是一种RNA转录抑制剂，常用于治疗妊娠性滋养细胞肿瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤和尤因肉瘤。6放线菌素D自1964年首次获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，已用于癌症治疗近五十年。雷公藤内酯是一种选择性转录抑制剂，已被广泛研究。 体外 并在多种荷瘤动物模型中研究了30年。7
corrole 的两亲性大环结构相较于其他药物类别（如小分子或生物制剂）具有显著优势8-14。这种大环结构赋予其超出预期的细胞通透性，尽管分子量较大，但仍能有效穿透细胞膜，同时其尺寸足以与蛋白质等大分子表面发生相互作用8。已知 corrole 能与生物分子和药物形成稳定的非共价复合物10。除了 corrole 骨架本身具有的固有细胞毒性外，我们已证明磺化 corrole 可作为化疗药物的载体分子，特别是对嵌入 DNA 的蒽环类药物阿霉素（doxorubicin）。当磺化 corrole 与阿霉素联合给药时，在 DU-145 细胞中观察到阿霉素的 IC50 提高了 3 倍9。corrole 骨架稳定，并具有固有的吸收和荧光特性，经功能化修饰后会产生独特的吸收光谱位移，可用于表征分析10。对骨架的功能化修饰本身并不影响 corrole 的光物理性质9-15，但如磺化 corrole 所示，选择性地修饰其分子框架可显著改变其生物学特性16。我们此前评估了六种金属 corrole 对七种人癌细胞系的作用，结果表明，其对人癌细胞的毒性依赖于特定的金属离子以及取代基团的类型。例如，磺化镓 corrole 在脑转移性前列腺癌细胞（DU-145）中表现出高细胞摄取，并能选择性地进入细胞核；而同一 corrole 虽不能进入其他细胞系的细胞核，但对乳腺癌（MDA-MB-231）、黑色素瘤（SK-MEL-28）和卵巢癌（OVCAR-3）细胞的细胞毒性却强于对前列腺癌细胞的毒性9。
初步的细胞实验表明，这些化合物作为抗癌治疗剂具有潜力，值得进一步研究其作用机制。某些有机金属配合物已被发现具有转录抑制作用17-27，我们因此试图考察这一过程是否可能是咕啉类化合物家族产生细胞毒性的可能机制。本转录实验提供了一种简单、经济且便捷的方法来评估转录抑制效应，有助于获得这些分子在活细胞中作用的更详细信息。
本文测试了镓(III) 5,10,15-(三)五氟苯基-corrole（Ga(tpfc)）及其游离碱类似物5,10,15-(三)五氟苯基-corrole（tpfc）的转录抑制作用（图1）。与某些过渡金属配合物不同，镓(III)不具有氧化还原活性，因此不直接参与基于氧化还原代谢途径的氧化还原过程28。尽管如此，镓(III)仍表现出细胞毒性，并已被用于治疗目的的研究。在抗癌治疗金属中，镓是继铂之后第二有前景的金属，已开展大量研究；硝酸镓和氯化镓盐已在临床试验中用于治疗肝癌、淋巴瘤、膀胱癌及其他疾病29-34。因此，镓(III)是研究抗癌corrole化合物的理想选择。初步数据显示，Ga(tpfc)和tpfc在多种癌细胞系中均具有较低的GI50值（即抑制50%最大细胞增殖所需的药物浓度）（见图2）；这证实了进一步研究这两种化合物抑制特性的合理性。我们将这两种化合物与常用的抗癌药物放线菌素D和雷公藤内酯进行比较。放线菌素D可插入DNA，抑制RNA延伸，并在皮摩尔浓度下诱导某些细胞系发生凋亡6,35-37。雷公藤内酯已被证明可抑制肿瘤生长；其通过结合人源XPB/ERCC3（转录因子TFIIH的一个亚基），从而抑制RNA聚合酶II的活性6-7,38-40
尽管众所周知corrole具有细胞毒性，但关于其功能化后产生的不同作用机制的相关信息却十分有限。研究corrole对RNA转录的抑制作用，将有助于更深入理解其与生物大分子的相互作用。其他已知可与DNA结合的配合物，如双铑(II,II)配合物、铬(III)配合物、钌(II)多吡啶配合物、铑(III)配合物以及多种其他配合物，均已通过RNA转录实验进行检测18-27，从而加深了对其与生物大分子相互作用的理解。这一操作简便且广泛可用的实验，也是评估特定分子细胞毒性特性的良好初步检测方法，可用于判断该分子是否值得进一步开展生物学测试。RNA转录实验还具有多种可调参数，例如可改变所用化合物或酶的用量、孵育时间、反应时间及取样时间点，以及DNA模板的长度和序列等其他感兴趣的变量，因而可能提供大量数据。该转录实验还可通过经济实惠的商用试剂盒便捷实施，试剂盒中包含所有必需的反应组分，当然也可单独购买并配制各组分。在本实验中，我们采用一种 commercially available kit，已知其具有较高的产量41。
为了评估转录抑制作用，我们采用两种方法：琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见光谱法。琼脂糖凝胶电泳是一种简单且有效的方法，可用于分离、鉴定和纯化大小为0.5至25 kb的DNA和RNA片段。42 紫外-可见光谱法可用于测定RNA的浓度和纯度。43

<table><tbody><tr><td>放线菌素 D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>储存于 2-8 &amp;deg;C，避光</td></tr><tr><td>雷公藤内酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>储存于 2-8 &amp;deg;C，避光</td></tr><tr><td>无核酸酶水 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 体外转录试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>储存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>注意：有关溴化乙锭的正确操作方法，请参见：http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Tris 乙酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Quick Spin RNA 纯化柱</td><td>Roche Life Science</td><td>11814427001</td><td>储存于 2-8 &amp;deg;C，切勿冷冻</td></tr><tr><td>1 kb DNA Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>储存于 &amp;ndash;20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一个 体外 通过酶法测定镓(iii)和氢对转录抑制作用的实验方案3 5,10,15-三(五氟苯基)corrole

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

化疗通常涉及具有多种副作用且靶向性有限的广谱细胞毒性药物。Corrole 是一类四吡咯大环化合物，根据其所螯合的金属和官能团的不同，在特定细胞系中表现出差异性的细胞抑制和细胞毒性作用。功能化 corrole 对特定细胞系的独特作用为靶向化疗提供了可能。
许多抗癌药物通过其抑制RNA转录的能力进行评估。本文介绍了一种在已知或潜在抑制剂存在条件下进行RNA转录的逐步实验方案。通过凝胶电泳和紫外-可见光谱法对转录反应产生的RNA产物进行分析，可提供有关潜在抗癌药物候选物抑制特性的信息；通过调整实验条件，还可进一步了解其作用机制。
关于corrole类化合物细胞毒性的分子作用机制，目前知之甚少。在本实验中，我们研究了两种corrole化合物：镓(III) 5,10,15-(三)五氟苯基corrole（Ga(tpfc)）和其游离碱类似物5,10,15-(三)五氟苯基corrole（tpfc）。采用RNA转录实验检测corrole化合物的抑制特性。共制备了五个转录反应体系：分别用放线菌素D、雷公藤内酯、Ga(tpfc)和tpfc处理DNA，其[复合物]:[模板DNA碱基]比例均为0.01，另设未处理对照组。
转录反应进行4小时后，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见光谱法进行分析。Ga(tpfc)、放线菌素D和雷公藤内酯均表现出明显的抑制作用。
通过改变抗癌复合物、DNA 或聚合酶的浓度，或在 RNA 转录前将 DNA 或聚合酶与复合物预先孵育，可对该 RNA 转录实验进行改进，以提供更详细的机制信息；这些改进可区分抑制机制是作用于 DNA 还是作用于酶。在 RNA 转录完成后加入复合物，可用于检测复合物是否降解或水解 RNA。该实验也可用于研究其他潜在的抗癌候选分子。

通过琼脂糖凝胶电泳对RNA转录进行定性评估
琼脂糖凝胶电泳用于对转录的RNA进行成像。溴化乙锭在结合后会发出荧光（λem = 605 nm，λex = 210 nm，285 nm）46 ，从而实现RNA的成像。凝胶中颜色较深的条带对应较高浓度的RNA。如果放线菌素D、雷公藤内酯或任一corrole配合物抑制了RNA转录，则RNA的生成量减少，条带颜色将变浅。基于此原理，可评估相对抑制程度。
图3显示了经不同处理的RNA转录反应产物在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶（1%）上的结果，处理条件分别为无复合物、放线菌素D、雷公藤内酯、tpfc或Ga(tpfc)，其[复合物]:[模板DNA碱基]比例为0.01:1。与已知的抑制剂作用一致，放线菌素D和雷公藤内酯组的RNA量较对照组明显减少。Ga(tpfc)条带的RNA水平也非常低，而tpfc条带则几乎没有抑制作用，其相对强度与对照组相当。
<p clas...

镓(III) 5,10,15-(三)五氟苯基corrole 及其游离碱类似物表现出低微摩尔级别的细胞毒性。本文描述了一种RNA转录反应，通过溴化乙锭染色凝胶对RNA进行成像，并利用紫外-可见光谱法对RNA进行定量，以评估corrole类化合物对转录的抑制作用，从而展示了一种评估抗癌候选物性质的简便方法。

一个 体外 通过酶法测定镓(III)和氢对转录抑制作用的实验方案3 5,10,15-三(五氟苯基)corrole

化疗通常涉及具有多种副作用且靶向性有限的广谱细胞毒性药物。Corroles 是一类四吡咯类化合物……

本实验的总体目标是确定潜在的抗癌化合物是否能够抑制核糖核酸（RNA）的转录。为此，首先制备RNA转录反应体系，并在本实验中加入潜在抑制剂——CHO化合物，这些化合物具有不同的细胞毒性特征，将被用于检测其对RNA转录的抑制作用，并与已知的抑制剂进行比较。充分混匀反应体系后，将反应管置于37°C条件下孵育，并在预定的时间点取出等分试样进行分析。接下来使用凝胶电泳来评估相对抑制程度，因为溴化铱在与RNA结合后会发出荧光，凝胶中较暗的条带对应较高浓度的RNA。为了定量测定转录抑制的程度，需进行紫外-可见光谱或紫外分光光度分析。最终，本视频展示了一种评估抗癌候选药物特性的简便方法。通过评估珊瑚对转录的抑制作用，应考察潜在的抗癌药物是否具有抑制RNA转录的能力。人类癌细胞通常依赖于单个活化的癌基因来维持存活。阻断这些癌基因的表达可有效清除癌细胞。本文所述的RNA转录抑制实验方法是一种用于鉴定潜在抗癌药物候选物并深入了解其作用机制的有效手段。首先，将卡洛尔（Carole）和抑制剂化合物按配体- DNA复合物与DNA的0.01至1摩尔比进行配制。具体操作为：将氯化三苯基卟啉（cin d Tripoli, TPFC）、镓-TPFC以及二甲基亚砜分别溶解于洁净的独立容器中。在开始转录反应之前，使用无核酸酶水对谷物提取物进行稀释，以获得最终浓度。自行配制所需试剂，或从商业供应商处购买。将所有冷冻试剂置于冰上解冻。然后按照文本方案中的描述，在室温下混合转录反应所需的试剂。通过轻弹离心管或用移液器轻轻吹打混合物，充分混匀，随后将反应体系在37摄氏度下孵育。接下来，每隔一小时从每个反应体系中取出4 µL等分试样，于-20摄氏度保存，可根据转录反应所需的时间点进行相应调整。使用RNA离心柱按照文本方案中的描述，从其他反应组分中纯化RNA，以进行琼脂糖凝胶电泳。配制TAE（Tris-乙酸-EDTA）电泳缓冲液以及1000倍浓度的溴化乙锭储备液。如文本方案所述，操作溴化乙锭时务必穿戴适当的防护装备，因其具有毒性。接下来，配制1%琼脂糖凝胶：将10克超纯琼脂糖溶解于1升1×TAE缓冲液中，并使用常规微波炉加热熔化琼脂糖。当溶液冷却至 50 摄氏度时，向 1% 琼脂糖凝胶溶液中加入 1 毫升 1000 倍浓度的溴化铱，并通过轻轻旋转或在密闭容器中倒置混匀。随后将琼脂糖溶液倒入凝胶制备平台，待凝胶在室温下完全凝固后，从电泳槽中移除梳子，并加入足够的 TAE 缓冲液覆盖凝胶，直至加样孔完全浸没。在取出胶梳之前，检查TAE缓冲液的液面是否高于凝胶表面约一毫米。为准备RNA样品进行凝胶电泳，取每份纯化后样品的一微升与一微升凝胶上样缓冲液混合，用微量移液器反复吹打混匀，然后小心地将溶液移入每个加样孔的底部以完成上样。注意避免产生气泡，并防止不同加样孔之间的样品交叉污染。连接电极，使 DNA 向凝胶的正极方

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition-gallium

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Bioengineering

生物工程

一个<em&gt;在体外</em&gt;酶测定来测量转录抑制作用镓（Ⅲ）和H<sub&gt; 3</sub&gt; -5,10,15-三（五氟苯基）corroles

该方法可实现高产量 体外 从含有线性化质粒的模板合成带帽和无帽mRNA 高斯荧光素酶 荧光素酶（GLuc）基因。RNA经纯化后，取部分未加帽RNA通过酶法加帽 痘苗病毒...

体外 转录与Gaussia荧光素酶mRNA加帽及其后续的HeLa细胞转染

本实验方案描述了一种快速构建人工转录因子（ATFs）及其相应GFP报告系统的实验方法 并通过流式细胞术定量分析ATF刺激GFP表达的能力。...

基于GFP报告系统的化学激活型转录因子的快速合成与筛选

内质网钙稳态在多种病理状态下受到破坏。一种分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMP）报告系统可用于检测内质网钙库的异常变化。本方案描述了使用该报告系统的具体方法。 高塞氏菌 利用荧光素酶SERCaMP检测内质网钙离子稳态 体外 和 体内.

利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

在本研究中，我们提供了一种实验流程，用于鉴定并实验验证活性增强子。...

视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。...

体外 转录实验及其在药物发现中的应用

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。...

体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

本文介绍了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验方案，以及石蜡切片和复染的方法。该方法操作简便、快速，可用于监测发育过程中的基因表达，也可应用于组织切片、器官或培养细胞。...

通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。...

使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

本实验方案采用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、磺酰罗丹明B（SRB）检测、3’非翻译区（3’...

一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

学习体外RNA转录抑制测定法来评估镓(III)corrole类抗癌化合物的活性。该方法结合凝胶电泳与紫外可见光谱技术，可定量分析候选药物对RNA合成的抑制效果，为抗肿瘤药物筛选提供可靠的生化检测方案。

一个体外通过酶法测定镓(III)和氢对转录抑制作用的实验方案₃ 5,10,15-三(五氟苯基)corrole

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一个 体外 通过酶法测定镓(III)和氢对转录抑制作用的实验方案3 5,10,15-三(五氟苯基)corrole

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