一个在体外酶测定来测量转录抑制作用镓（Ⅲ）和H 3 -5,10,15-三（五氟苯基）corroles

该程序的总体目标是确定潜在的抗癌化合物是否抑制 rib 核酸或 RNA 转录。这是通过首先制备 RNA 转录反应来实现的，包括本实验中的潜在抑制剂，研究表现出差异细胞毒性特性的 CHO 化合物对 RNA 转录的抑制并与已知的抑制剂进行比较。彻底混合反应后，将反应管在 37 摄氏度下孵育，并在所需时间点取出等分试样。

接下来，凝胶电泳用于评估相对抑制，因为溴化铱在 RNA 结合时发出荧光，凝胶中较暗的条带对应于较高浓度的 RNA。为了定量转录抑制的程度，进行了紫外线、可见光或 UV vs 光谱分析。最终，该视频展示了一种评估抗癌候选特性的简单方法。

通过评估珊瑚的转录抑制，应评估潜在的抗癌药物抑制 RNA 的能力。转录。人类癌细胞经常依赖单个激活的癌基因进行生存治疗。阻断癌基因的表达可有效消除癌细胞。

此处描述的 RNA 转录抑制程序是识别潜在抗癌候选药物并了解有关其作用机制的更多信息的有用方法。首先，以 0.01：1 的复合物与 DNA 的摩尔比制备 Carole 和抑制剂化合物。为此，将 cin d Tripoli、TPFC 和镓、TPFC 和二甲基亚砜溶解在干净的单独容器中。

在开始转录反应之前，使用含核酸酶的谷物稀释液获得最终浓度。单独制备必要的试剂或从商业供应商处购买。在冰上解冻所有冷冻试剂。

然后按照文本方案中的说明在室温下混合用于转录反应的试剂。通过轻弹试管或轻轻上下移液混合物充分混合，然后在 37 摄氏度下孵育反应混合物。接下来，每小时从每个反应中取出 4 微升等分试样，并储存在零下 20 摄氏度，根据需要修改转录反应后所需的时间点。

如文本方案中所述，使用 RNA 离心柱从其他反应组分中纯化 RNA，以进行 agriros 凝胶电泳，制备 tris 乙酸 EDTA 或 TAE 运行缓冲液和 1000 x 溴化醚储备溶液。正如文本协议中所述，在处理溴化乙醚时，请始终佩戴适当的防护设备，因为它有毒。接下来，通过将 10 克超纯 agros 溶解在 1 升 XTAE 缓冲液中，并用常规微波炉熔化 agros 来制备 1%aros 凝胶。

冷却至 50 摄氏度后，将 1 毫升 1000 x 溴化铱加入 1% agros 凝胶溶液中，轻轻旋转或在密闭容器中倒置混合。然后将 Agro 溶液倒入凝胶灌注平台中，让凝胶凝固后在室温下凝固。从电泳槽中取出楔形，加入足够的 TAE 缓冲液以覆盖凝胶，直到孔被淹没。

在取下凝胶梳之前，检查 TAE 缓冲液的水平是否比凝胶水平高出约 1 毫米。为了制备用于凝胶电泳的 RNA 样品，将 1 微升每种纯化样品等分试样与 1 微升凝胶上样缓冲液混合，用微量移液管上下移液充分混合，小心地将溶液移液到每个样品的底部，将凝胶加载到每个样品的底部。注意不要在孔之间留下任何气泡或混合样品。

连接导线，使 DNA 向阳性导线迁移到凝胶中。将电压设置为所需的水平。通常为每厘米凝胶 1 至 10 伏特。

250 伏特的 23 厘米 x 25 厘米凝胶将运行大约一小时。150 伏特的 8 厘米 x 8 厘米凝胶将持续约 20 分钟。较小的 RNA 片段在较高电压下以更好的分辨率运行。

使用染料迁移来监测分离进度，将凝胶运行足够长的时间，以便在潜在 RNA 片段之间进行显著分离。在上样缓冲液中的染料迁移到凝胶图像的末尾之前，请关闭电源。作为粥样粟系物的 RNA 在紫外光下会发出荧光，拍摄图像照片并比较每种条件下纯化的 RNA 的荧光强度。

要使用 UV v 光谱法进行 RNA 定量，请在 NanoDrop 2000 或类似机器上加入两微升水并测量空白。接下来，在分光光度计上纯化后，将每个 RNA 样品放入 2 微升，并在吸光度高于 1 的情况下测量 200 纳米至 800 纳米波长范围内的紫外可见光。用不含核酸酶的水稀释样品，以获得小于 1 的光密度。

最后，使用绘图软件绘制各种样品并比较 260 纳米处的光密度，并使用凝胶电泳对转录的 RNA 进行成像。如果复合物抑制 RNA 转录，则 RNA 的产生减少，theban 会显得更轻。与这些长期研究的抑制剂的预期相比，肌动蛋白 d 和色氨酸显示 RNA 明显减少。

镓 TPFC 条带的 RNA 水平也非常低，而 TPFC 条带几乎没有抑制作用，并且表现出与对照 UV 相同的相对强度。对每个样品进行测量。经过 RNA 转录 4 小时并用 RNA 离心柱色谱纯化后，这里显示了波长为 220 纳米至 350 纳米的光谱。

四种抑制剂处理的转录反应中有三种产生的 RNA 比对照少，其中镓 TPFC 处理的 DNA 仅转录了未处理的 D-N-A-T-P-F-C 处理的 DNA 的 1/14，没有显示出明显的抑制。因此，用 TPFC 处理的细胞系中的细胞毒性不是由于 RNA 转录抑制引起的。所有样品在 280 纳米范围内的吸光度比为 260，比值约为 2.2，表明样品相对纯净。

按照此程序，可以测试反应中的其他变量，如浓度和加成顺序，以回答其他问题，如作用机制。看完这个视频，你应该对如何确定你的抗癌化合物是否抑制 RNA 转录有了很好的了解。不要忘记溴化物对您的健康极为危险。

始终佩戴适当的个人防护设备，切勿使用含有 Athene 溴化物的微波溶液或农产品。