评估癌症药物增敏效果 体外 和 体内

以下实验的总体目标是通过体外测定细胞代谢变化以及体内测定转移频率，来评估癌症药物增敏的效果。首先在体外利用反义分子转染癌细胞，以敲低目标分子；随后将转染后的细胞接种至生物传感器芯片，并将其载入代谢检测系统，以量化药物处理过程中酸化、呼吸及细胞黏附的变化情况。

分别对转染的细胞进行药物处理，然后将其注入鸡胚的静脉循环中，以评估其对转移频率的影响。结果显示，药物对癌细胞的敏感性增强，表现为细胞代谢和转移频率的变化。该技术拓展了癌症治疗的发展，因为它能够在药物靶点或化合物常规临床前测试中，同时评估那些通常未被充分考虑的参数。

尽管该方法可为DNA修复相关的新药物靶点提供研究思路，也可应用于其他系统（如细胞周期调控）中的靶点验证。在无菌环境下，按照文本方案用反义寡核苷酸转染肿瘤细胞后，使用400 µL PBS小心清洗六块生物传感器芯片。为灭菌，吸除PBS后加入400 µL 70%乙醇，孵育20分钟，再用PBS清洗芯片三次。将三块芯片分别放入无菌培养皿中，标记为对照组和目的靶点组，并以相同方式标记两个50 mL离心管。

接下来，使用 PBS 清洗转染后的细胞，然后加入适量的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，等待单层细胞脱落，将细胞悬液转移至相应的离心管中。计数细胞后，通过添加培养基或浓缩细胞，调整体积以达到每毫升 6.0 × 10⁵ 个细胞的终浓度。每次处理一组，向每个生物传感器芯片中加入 250 µL 细胞溶液。

将含有芯片的无菌培养皿放入湿度孵育 chamber 中，以防止蒸发，并过夜孵育，以按照文本方案中详述的实验流程进行代谢测量。标记1450毫升的试管，并加入50毫升生长培养基，添加0.2% FBS以及1×青霉素和链霉素（PS）。将六根试管放入一个代谢测量系统的试管架中，另六根放入第二个试管架，剩余的试管放入第三个试管架中，该试管架还包含含有顺铂的试管。使用透气膜密封前两个试管架，以防止蒸发。

接下来，用含0.2% FBS和一倍XPS的培养基配制适当体积的6微摩尔顺铂溶液。将所需体积的培养基分装至四个已标记的50毫升离心管中，并将其放回第三个代谢测定管架的四个插槽内。使用透气膜密封各管。

标记六个 50 毫升离心管，并在每个管中加入 20 毫升含 0.1% Triton X 的溶液。该 Triton X 溶液可裂解任何残留的细胞，从而为每个芯片提供零值。将这些离心管放入第四个试管架中并密封。然后将芯片装入生物模块中。

将两个brack装入brack支架中，然后启动实验。在细胞转染第二天，按照文本方案中所述制备鸡胚后，将对照组和目标兴趣组分别分入两个装有载体的培养瓶和两个装有顺铂的培养瓶中。吸除培养基，加入三毫升新鲜培养基或含六微摩尔顺铂的培养基进行补充。

将烧瓶孵育6小时。孵育结束后，吸除培养基，然后洗涤细胞并用胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移至四个相应标记的15毫升离心管中，离心后用PBS洗涤三次，重悬细胞。计数后，用PBS稀释或通过离心浓缩细胞，使其最终浓度为1.0 × 10⁶ 个细胞/毫升。

将细胞悬液转移至已标记用于注射的5毫升离心管中，并置于冰上。随后，在体视显微镜下，使用连接至1毫升注射器的玻璃针（通过柔性管连接，并以缓慢脉冲方式操作），预留24枚9日龄的鸡胚用于注射。以100微升体积，将1.0 × 10⁵个细胞注入鸡胚尿囊膜（CAM）的静脉循环中，操作时动作轻柔。

轻轻按压注射部位以止住血液流动，并吸除任何溢出的液体。每次在荧光显微镜下注射后，应正确标记每个胚胎容器。在cam血管系统中确认荧光细胞的存在及其分布情况。

注意观察肿瘤细胞数量较少或分布不佳的任何胚胎。最后，将鸡胚置于湿度培养箱中，孵育7至9天，然后按照文中方案所述计数转移灶。如图所示，在24小时后，经BRCA2靶向ASO和顺铂处理的人A549肺癌细胞与仅接受对照ASO和顺铂处理的细胞相比，表现出早期且不可逆的呼吸下降。与对照组处理的细胞相比，呼吸下降39%，该变化大约在细胞黏附力可检测到下降前10小时即已开始，提示该现象独立于细胞数量的变化发生，并可能是在细胞死亡之前发生的早期事件，如本实验所示。

在72小时的实验过程中未观察到酸化作用的差异，表明BRCA2 ASO和顺铂处理对葡萄糖代谢几乎没有影响。在本实验中，人A549肺癌细胞经对照ASO或BRCA2 ASO处理后，在有或无顺铂存在的情况下被注入鸡胚尿囊膜的静脉循环中。九天后，经BRCA2 ASO联合顺铂处理的细胞，其转移灶出现频率比经对照ASO联合顺铂或单独使用BRCA2 SSO处理的细胞低77%，提示BRCA2 ASO联合顺铂治疗可能有助于减少或预防实体瘤患者中的转移负担。

通过该实验步骤，可进一步采用细胞增殖实验、体外检测以及体内异种移植研究等更为传统的方法，深入探究特定靶点在增强药物敏感性中的作用。