一种特异性测定颗粒酶B蛋白水解活性的比色法：Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl的水解反应

以下实验的总体目标是测定颗粒酶B这种丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。该目标通过首先制备目标细胞的裂解液，然后迅速向样品中加入底物来实现。随后通过比色反应来检测颗粒酶B的活性。最终，可根据颗粒酶B对天冬氨酸残基的独特底物特异性，评估其对Ac-IEPD-pNA底物的高效特异性切割能力。

与现有方法（如通过 PCR 或 Western 印迹检测颗粒酶 B 表达）相比，该技术的主要优势在于苯甲基的水解具有颗粒酶 B 特异性，同时还能表明该蛋白酶具有活性。为制备细胞裂解物，首先使用商品化试剂盒，按照制造商说明书通过阴性筛选法从野生型 C57BL/6 小鼠或对照颗粒酶 B 基因敲除小鼠脾脏的单细胞悬液中分离原代 NK 细胞，分离前需先激活细胞。用 PBS 洗涤细胞三次，每次最大速度离心 2 至 3 秒，然后将含有至少 500 万个 NK 细胞的沉淀重悬于 100 微升冰上预冷的 Nonidet P-40 裂解缓冲液中，冰上孵育 20 分钟。

然后在微型离心机中以15,000 ×g离心裂解液10分钟，将上清液转移至新的离心管中。根据相应的 commercially available 试剂盒说明书测定蛋白浓度后，将样品以每毫升至少约2毫克的浓度分装，并于-20°C保存，用于后续caspase-3酶活性检测。接下来，每份样品取至少100微克的蛋白裂解液，用新配制的hepes缓冲液稀释至终体积为160微升。

然后使用多通道移液器将每种样品各50 µL以每孔三复孔的方式加入96孔乙烯基U型底板中。注意设置三个仅含缓冲液的对照孔，向每个孔中加入100 µL稀释后的DTNB。随后迅速向各仅含缓冲液的孔中加入50 µL新近稀释的丙氨酰-丙氨酰-对硝基苯基底物，接着加入任何阴性对照孔，最后加入预期的阳性样品孔。

使用微孔板读板仪，在405纳米光密度下，通过每15秒采集一次、共采集25次读数的动力学检测方案，测定AlaAlaAsp-苯甲酯底物水解所反映的酶活性。最后，利用微孔板读板仪软件计算每个孔中底物裂解的最大速率，然后将原始数据导入相应的统计分析软件，并使用颗粒酶基因敲除小鼠进行分析。研究发现，合成肽底物AlaAlaAsp-苯甲酯可被颗粒酶B特异性水解。在野生型原代自然杀伤（NK）细胞的细胞裂解液中可检测到该合成底物发生进一步强烈的裂解，而在颗粒酶B基因敲除动物的NK细胞中则无法检测到裂解活性，后者作为对照。

在本实验中，颗粒酶A的蛋白水解活性具有类似胰蛋白酶的底物特异性，且在两种细胞的裂解液中均存在，其活性通过BLT苯甲酯的水解来测定，结果相等。I-E-P-D-P-N-A被广泛用于跨物种检测颗粒酶B的活性。在此代表性实验中，对四肽序列的分析显示，人颗粒酶B能够高效地在IEPD序列后发生切割，而小鼠颗粒酶B则不能；该序列与人和小鼠Bid蛋白中的识别序列一致。相比之下，将人NK白血病细胞裂解液的用量从30微克减少至10微克，仍含有足够的颗粒酶B以水解I-E-P-D-P-N-A底物。

观看本视频后，您应能够充分理解如何为体外分析人和小鼠的红色酶B选择合适的底物及实验对照。