纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

本实验的总体目标是在重建的系统中测量 CFTR 通道群体的功能，并研究这些通道对调节分子存在的反应。首先，通过快速纯化方法从 SF nine 细胞中纯化野生型或突变型 CFTR 蛋白，获得在去垢剂溶液中具有功能活性的 CFTR 蛋白；其次，将纯化的蛋白重组到由实验者选定的特定脂质构成的蛋白脂质体中。

接下来，通过去除脂质体外的过量碘离子，在膜两侧形成碘离子的化学梯度，从而为离子经CFTR通道的跨膜移动提供驱动力。最后一步是在目标调节分子存在的情况下激活通道，启动蛋白脂质体中碘离子的释放。最终，在该重建系统中，利用碘离子选择性电极实时监测CFTR通道的功能。

该方法可实现将纯化的CFTR分子群体重组到磷脂脂质体后，对其氯离子通道活性进行研究。尽管该方法最初旨在深入了解CFTR第九通道的功能及小分子调节剂的作用，但也可应用于其他体系，例如对其他膜蛋白的功能表征。为确保实验成功，初次操作该方法的研究人员需优化蛋白与脂质的比例，确保所用蛋白具有良好的功能活性，避免使用功能低下或无功能的蛋白，并在密封良好的囊泡两侧建立足够的碘离子浓度梯度。

首先，在非硼硅酸盐玻璃管中加入五毫克卵磷脂酰胆碱（egg phosphatidylcholine）或卵磷脂（egg PC），在室温下通入氩气流中干燥20分钟。接着，根据文本方案中说明计算所需缓冲液六（buffer six）的体积，然后将缓冲液六直接加入脂质中。用Perfil密封玻璃管，随后在室温下涡旋振荡两分钟，使脂质在缓冲液中充分悬浮。

接下来，使用连接在1毫升注射器上的25号针头在室温下悬浮脂质，直至试管壁上无可见的脂质膜。由于脂质处于悬浮状态，缓冲液将呈现浑浊。将试管置于含冰的水浴中超声处理，进行22次脉冲超声，然后将试管放在冰上静置1分钟。

重复此步骤三次。接着，将CFTR蛋白加入脂质中，最终体积为一毫升。用25号针头将蛋白与脂质悬液混合10次。

将样品置于冰上 30 分钟，每 5 分钟轻轻涡旋混匀试管 5 次，孵育期间保持混合。取一次性去垢剂结合离心柱，折断底部标签，于 2000 × g 离心 2 分钟。为去除保存缓冲液，用 5 mL 缓冲液 7 洗涤柱子，于 2000 × g 离心 4 分钟，以洗脱洗涤缓冲液。

用缓冲液洗涤柱子三次，将全部1 mL蛋白质-脂质样品转移至柱子树脂顶部，室温孵育2分钟。在室温下以2000 × g离心柱子4分钟。然后将浑浊的蛋白-脂质体样品转移至一支干净的微量离心管中，并将管子置于冰上。将5 g Sephadex G-50珠子浸入50 mL缓冲液九中，室温下至少浸泡2小时。

然后将四个小型筛选柱装入饱和的珠子，直至填充至至少四分之三满。以2000 × g离心柱子4分钟，以去除树脂中的过量缓冲液。离心后，柱中应含有约2.25 mL的压紧树脂。

必须确保树脂充分水化，以便用蛋白脂质体进行洗脱。接下来，将125微升蛋白脂质体样品加至每根层析柱的顶部，以2000 × g离心4分钟。收集洗脱液（EITs），用于后续的碘化物FLX实验。

将一个微型F型聚四氟乙烯搅拌子放入96孔板的一个孔中，然后向该孔加入150 µL VX seven 70，使其在缓冲液9中的浓度为20 µmol。使用移液枪头去除任何气泡。随后向孔中加入150 µL蛋白脂质体样品，总体积为300 µL。

将96孔板置于搅拌器上，以每分钟130转的速度搅拌。将碘离子敏感电极的探头插入溶液中，注意不要接触搅拌子或孔底。为记录电极信号的轨迹，通过低通滤波器对信号进行过滤，以每秒2赫兹的采样率记录样品信号持续5分钟，以使样品达到平衡。

应产生一条稳定且近乎平坦的基线。然后在 pH 7 条件下加入 3 µL 100 mmol/L 的氯化镁 ATP 储备液。为激活 CFTR 通道，让样品再平衡 5 分钟，以达到新的基线。

接着，加入 3 µL 的 2 µmol/L 原液缬氨霉素，以消除由 CFTR 活性产生的电化学梯度。记录至少五分钟内由 CFTR 介导的碘化物 FLX 活性引起的电压下降。

然后向样品中加入3 µL 10% Triton X-100溶液，作为对照以释放蛋白脂质体腔内的碘化物。若检测到显著的碘化物释放，表明囊泡中捕获的碘化物浓度并未限制CFTR活性。测定样品后，在缓冲液9中配制从微摩尔至纳摩尔浓度的碘化钾系列稀释液。

从最稀释的溶液开始，记录电极在每种碘离子浓度下的毫伏响应值，以生成标准曲线。对野生型CFTR进行了碘离子检测。重组后测得的F流活性单位为每秒阿摩尔。

在存在CFTR和ATP的情况下，碘离子外流显著高于缺乏CFTR的对照组，且通过添加ATP可进一步增强。当CFTR被环磷酸腺苷（cAMP）依赖性蛋白激酶A的催化亚基（PKA）磷酸化时，碘离子外流增加；相反，预先使用强效抑制剂CFTR抑制剂172处理，则会降低碘离子外流速率。VX-770增强野生型CFTR介导的碘离子外流能力的实验在有或无PKA磷酸化的情况下进行测试，结果显示VX-770仅在磷酸化CFTR存在时增加相对碘离子外流。该效应通过CFTR的一种突变体ΔF508-CFTR进行验证。作为阴性对照，无活性类似物V091188不能增强磷酸化ΔF508-CFTR的活性，而VX-770可提高其相对碘离子外流。一旦掌握该技术，从CFTR纯化到功能活性检测的全过程可在典型的八小时工作日内完成：CFTR纯化约需四小时，重组耗时约一小时，随后即可开始eFlex检测。

采用此方案后，还可利用同一份CFDR蛋白样品进行其他方法检测，包括T PS测定法以及在para脂质S中进行单通道电导测量，以进一步表征小分子与蛋白的相互作用。通过这些方法，囊性纤维化研究人员将能够回答CFTR调节剂领域中的关键问题，即：该调节剂是否直接与CFTR蛋白相互作用，以及该调节剂的作用机制是什么。