Name: 细菌，昆虫细胞和植物系统：重组蛋白表达在不同的生物工厂的比较分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解重组蛋白表达方法，比较发酵罐培养与植物系统的产量差异及优缺点。本研究为优化蛋白质生产效率提供重要参考依据。

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本工作得到了COST行动“分子农业：植物作为高价值蛋白质生产平台”FA0804的支持。作者感谢Anatoli Giritch博士和Yuri Gleba教授为研究目的提供MagnICON载体。

1. 表达载体的构建
<ol>
	<li>商业化重组克隆系统：
	<ol>
		<li>使用适当的引物扩增目的基因（hGAD65mut）的全长序列，引物设计需允许在基因5’端添加CACC接头，具体方法如前所述2。</li>
		<li>根据定向克隆试剂盒说明书，将经凝胶纯化的扩增产物克隆至入门载体（与拓扑异构酶结合）中。反应体系总体积为6 µl，插入片段与载体的摩尔比为1.5:1，并加入1 µl盐溶液（0.2 M NaCl 和 0.01 M MgCl2）。室温（RT）孵育5分钟。</li>
		<li>将整个反应体系转化至化学感受态E. coli细胞中，按照定向克隆试剂盒说明书操作，并使用试剂盒提供的M13正向和反向引物通过菌落PCR3筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒DNA，按照质粒DNA提取试剂盒说明书操作，并使用M13正向和反向引物对插入片段进行测序，以确认无突变发生3。</li>
		<li>利用获得的入门克隆，通过Lambda重组酶Clonase II酶（LR）与特定的目的载体进行重组反应：用于在细菌细胞中表达重组蛋白的pDEST17（得到pDEST17.G65mut），用于植物（瞬时或稳定表达）的pK7WG2（得到pK7WG2.G65mut），以及用于杆状病毒/昆虫细胞系统的线性化病毒DNA（得到Baculo.G65mut）4。根据Clonase试剂盒说明书，将100 ng入门载体、150 ng目的载体与2 µl酶混合物混合，最终反应体积为10 µl。室温孵育1小时。</li>
		<li>将重组反应产物按照Clonase试剂盒说明书转化至化学感受态E. coli细胞中。使用以下特异性引物组合对所有转化获得的菌落进行PCR3筛选：反向引物统一使用GAD65mut特异的反向引物（5’-CACACGCCGGCAGCAGGT-3’），正向引物则根据目的载体分别使用：pDEST17对应的正向引物为5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；pK7WG2对应的正向引物为5’-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3’；Baculo线性化载体对应的正向引物为5’-AAATGATAACCATCTCGC-3’。</li>
		<li>使用商业化的质粒小提DNA试剂盒提取质粒DNA，并使用上一步所述的相同特异性引物组合通过PCR3确认目标序列的存在。</li>
		<li>将PCR验证为阳性的质粒用于转化不同的目标生物体，具体取决于后续步骤中选择的重组蛋白表达平台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MagnICON系统5-7：
	<ol>
		<li>将目标基因克隆至3’-模块pICH31070中，具体操作如前文详细描述7，获得pICH31070.G65mut。使用以下特定反应循环：37 °C孵育30分钟，50 °C孵育5分钟，随后80 °C孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 重组蛋白表达
<ol>
	<li>细菌细胞系统：
	<ol>
		<li>将 pDEST17.G65mut 转化入 E. coli 使用标准技术将BL21 (DE3)电转感受态细胞进行转化，并在含氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB培养基上培养，通过菌落PCR筛选菌落。PCR引物为转基因特异性引物：5’-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3’ 和 5’-CACACGCCGGCAGCAGGT-3’，退火温度为58 °C，延伸时间为20秒。在PCR管中用塑料枪头将细菌细胞溶解后，进行总反应体积为20 µl的PCR反应。</li>
		<li>在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的3 ml LB培养基中，接种单菌落，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>将细菌培养物按1:100比例接种于100 ml含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，于37 °C培养1–6小时，直至达到目标OD600 0.8</li>
		<li>通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mM，诱导重组蛋白表达，并在37 °C下剧烈振荡培养3小时。</li>
		<li>4,000 × g 离心 20 分钟收集细胞，用细菌沉淀进行蛋白质提取（步骤 3.1.1.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杆状病毒/昆虫细胞系统
	<ol>
		<li>种子 草地贪夜蛾 (Sf9) 细胞接种至 6 孔板（8 x 105 每孔细胞数）用 2 ml 无添加的 Grace 昆虫培养基洗涤两次。</li>
		<li>逐滴移除并更换为转染混合液（5 µl LR 重组反应液、6 µl Celfectin 溶液和 200 µl 无添加的 Grace’s 昆虫培养基）。</li>
		<li>在27 °C下孵育平板5小时。</li>
		<li>移除转染混合物，并替换为 2 ml 新鲜 Sf-900 培养基，培养基中添加 10% 胎牛血清、10 µg/ml 庆大霉素和 100 µM 更昔洛韦，以筛选重组杆状病毒克隆。</li>
		<li>在27 °C培养96小时后，收集培养基（V1病毒原液），在4,000 × g离心以去除细胞和大颗粒碎片，避光保存于4 °C。</li>
		<li>接种 1 × 106 每孔加入2.5 ml含10%胎牛血清、10 µg/ml庆大霉素和100 µM更昔洛韦的Sf-900培养基，接种Sf9细胞，并在每孔中加入100 µl V1病毒原液进行感染。</li>
		<li>在27 °C下培养细胞3天。</li>
		<li>收集培养基并在 4,000 x g 离心。</li>
		<li>将上清液（V2 高滴度病毒液）于 4 °C 保存。</li>
		<li>接种 1 × 106 每孔加入2.5 ml含10%胎牛血清、10 µg/ml庆大霉素和100 µM更昔洛韦的Sf-900培养基，接种Sf9细胞，并在每孔中加入25 µl V2病毒原液进行感染。</li>
		<li>在27 °C下培养细胞3天。</li>
		<li>以 4,000 × g 离心收集细胞，并用昆虫细胞沉淀进行蛋白质提取（步骤 3.1.2）1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nicotiana benthamiana 瞬时表达系统
	<ol>
		<li>培养 N. benthamiana 在18–23 °C温度范围内、自然光照的温室中种植植物。用于农杆菌侵染实验时，使用4–5周龄的植物。</li>
		<li>将农杆菌侵染的植物置于22 °C、光照周期为13小时光照/11小时黑暗的气候室中培养。</li>
		<li>商业重组克隆系统：
		<ol>
			<li>引入 pK7WG2.G65mut Agrobacterium tumefaciens 如前所述制备EHA105感受态细胞8 在28 °C培养2天后，从含有利福平（50 µg/ml）、链霉素（300 µg/ml）和壮观霉素（100 µg/ml）的LB培养基上挑取菌落，进行菌落PCR筛选8 使用以下转基因特异性引物：5’-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3’ 和 5’-CACACGCCGGCAGCAGGT-3’，退火温度为 58 °C，延伸时间为 50 秒。PCR 反应在总体积为 20 µl 的体系中进行。</li>
			<li>在含有利福平（50 µg/ml）、链霉素（300 µg/ml）和壮观霉素（100 µg/ml）的30 ml LB培养基中接种细菌，于28 °C培养两天。</li>
			<li>4,000 × g 离心 20 分钟收集细菌，将菌体沉淀重悬于 10 ml 浸润缓冲液（10 mM MES，10 mM MgCl₂，200 μM 乙酰丁香酮）中2，100 µM 乙酰丁香酮，pH 5.6）。测量OD600 值，然后用相同缓冲液稀释至0.9。 
			注意：浸润三片所需的总体积 N. benthamiana 植物的体积为30 ml。</li>
			<li>使用2.5 ml无针头注射器进行渗入 农杆菌 悬浮于 N. benthamiana 叶片。用注射器将悬浮液小心且缓慢地注入叶片组织。每株植物注射三片展开的叶片，并以三株植物作为三个重复。 
			注意：出于健康和安全考虑，在渗透过程中需佩戴护目镜。</li>
			<li>接种后2天（dpi）收集农杆菌浸润的叶片，并在液氮中速冻。将植物组织储存于-80 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>MagnICON系统：
		<ol>
			<li>引入 MagnICON 载体——5’模块（pICH20111）、3’模块（pICH31070.G65mut）以及整合酶模块（pICH14011） A. tumefaciens 使用标准技术对GV3101菌株进行操作。在含有50 µg/ml利福平及相应载体特异性抗生素的LB培养基上培养菌落（pICH20111和pICH14011使用50 µg/ml羧苄青霉素，pICH31070使用50 µg/ml卡那霉素），并通过针对各载体的特异性引物进行菌落PCR筛选。</li>
			<li>分别接种三种 A. tumefaciens 在含有50 µg/ml利福平和相应载体特异性抗生素的5 ml LB培养基中，于28 °C振荡培养过夜。</li>
			<li>离心（4,000 × g，20 分钟）沉淀过夜培养的细菌，用初始菌液体积两倍的含 10 mM MES（pH 5.5）和 10 mM MgSO₄ 的溶液重悬4.</li>
			<li>将含有三种载体的细菌悬浮液等体积混合，并用混合后的悬浮液进行注射式侵染 N. benthamiana 叶片。每株植物浸润三片展开的叶片。</li>
			<li>在农杆菌浸润后4天收集叶片，并用液氮速冻。</li>
			<li>将植物组织在 -80 °C 下保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nicotiana tabacum 稳定表达系统
	<ol>
		<li>培养与维持 体外 植株 N. tabacum (变种 Sr1在气候室的受控条件下，于固体植物培养基（4.4 g/L Murashige和Skoog—MS—培养基，含维生素，30 g/L蔗糖，pH 5.8，7 g/L植物琼脂）中，25 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养。</li>
		<li>开始预培养 A. tumefaciens 在含有适当抗生素（利福平 50 µg/ml、链霉素 300 µg/ml、壮观霉素 100 µg/ml）的 5 ml 液体 YEB 培养基中培养含有表达载体 pK7WG2.G65mut 的 EHA105，于 28 °C、200 rpm 恒温振荡培养过夜。</li>
		<li>使用1 ml预培养物接种50 ml 农杆菌 在YEB培养基中加入抗生素（利福平50 µg/ml、链霉素300 µg/ml、壮观霉素100 µg/ml）进行培养，培养24小时，直至菌液达到饱和（OD600 0.5–1.0）的值。</li>
		<li>在4,000 × g离心20分钟收集细菌，将菌体沉淀重悬于50 ml液体植物培养基中。重复此步骤两次，以彻底去除抗生素。</li>
		<li>取生长健壮、完全展开的初生叶片 体外 将烟草植株切成约1厘米见方的小块。</li>
		<li>将叶片片段转移至含有细菌悬浮液的深型培养皿中，避光放置20分钟。</li>
		<li>从悬浮液中取出叶片碎片，并用无菌滤纸吸干。</li>
		<li>将叶片小块（近轴面朝上）放置于含有1.0 µg/ml 6-苄氨基嘌呤（BAP）和0.1 µg/ml 萘乙酸（NAA）的固体植物培养基上，置于气候培养箱中，在控制条件下（25 °C，16小时光照/8小时黑暗）培养两天。</li>
		<li>将叶片小片转移至固体培养基上（含1.0 µg/ml BAP、0.1 µg/ml NAA、500 µg/ml 头孢噻肟、100 µg/ml 卡那霉素），使叶片的远轴面（叶片下表面）与培养基接触。</li>
		<li>在气候箱中于25 °C、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养平板2-3周，以诱导芽的形成。每2周将叶片外植体转接至新鲜的固体植物培养基中进行继代培养，培养基含有1.0 µg/ml BAP、0.1 µg/ml NAA、500 µg/ml 头孢噻肟和100 µg/ml 卡那霉素。</li>
		<li>当芽出现后，将其转移至含有固体培养基的Magenta盒中，培养基包含500 µg/ml头孢噻肟和100 µg/ml卡那霉素，以诱导生根。将幼苗置于25 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养1–2周。</li>
		<li>当根形成后，将植株移栽至温室中的土壤中。</li>
		<li>采集每株植物的叶片样品，使用 commercial kit 提取基因组DNA。</li>
		<li>通过特异性PCR检测转基因的存在。以30 ng基因组DNA为模板进行PCR扩增，使用以下转基因特异性引物：5’-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3’ 和 5’-CACACGCCGGCAGCAGGT-3’，退火温度为58 °C，延伸时间为20秒。PCR反应总体积为50 µl。</li>
		<li>在Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA）中，通过1%琼脂糖凝胶电泳分析220 bp的产物。</li>
		<li>筛选含有目的基因的转基因植株。</li>
		<li>从每株选定的转基因植物上采集一片叶片组织，立即放入液氮中速冻。</li>
		<li>从植物叶片组织中制备总蛋白提取物（步骤 3.1.3），并按照先前所述方法通过蛋白质印迹分析对每个样品进行检测2 筛选表达最佳重组蛋白的烟草植株。</li>
		<li>在选定的优良植株开花前套袋，以防止异花授粉。</li>
		<li>开花后，待果实成熟并种子干燥，收集袋子。</li>
		<li>将种子与颖壳分离，并在温度可控的干燥房间（20–24 °C）中储存。</li>
		<li>播种干燥的种子以获得第二代转基因植株，随后选择表现最佳的植株进行自花授粉。</li>
		<li>重复执行步骤 2.4.19–2.4.21 中所述的相同操作流程，用于后续各代。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重组蛋白表达分析
<ol>
	<li>总蛋白提取：
	<ol>
		<li>细菌细胞：
		<ol>
			<li>将按步骤2.1.5所述收集的细菌细胞沉淀重悬于半倍培养体积的Tris缓冲盐水（TBS - 2 mM Tris/HCl，500 mM NaCl）pH 7.4中，其中添加1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。</li>
			<li>将重悬的细胞沉淀置于冰上，以半功率超声处理三次，每次40秒。</li>
			<li>在4 °C下以14,000 × g离心20分钟，澄清裂解液。</li>
			<li>将上清液转移至洁净离心管中，上清液和沉淀物分别于 -80 °C 保存。</li>
			<li>将沉淀中收集的包涵体溶于含6 M尿素的TBS缓冲液（pH 8.0）中，体积为细胞裂解液体积的一半，于室温下剧烈振荡过夜。</li>
			<li>在室温下以10,000 × g离心25分钟，收集上清液至洁净离心管中。</li>
			<li>将上清液和沉淀物均于 -80 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>昆虫细胞：
		<ol>
			<li>用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4pH 7.4</li>
			<li>将细胞重悬于 200 µl 裂解缓冲液（20 mM Tris/HCl pH 8.0，0.5 M NaCl，3 mM β-巯基乙醇和 1% Tween-20）中，冰上孵育 30 分钟。</li>
			<li>4 °C 条件下，14,000 × g 离心溶解后的细胞 20 分钟。</li>
			<li>收集上清液，于 -80 °C 保存，弃去沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>植物叶片组织：
		<ol>
			<li>研磨 N. benthamiana 或 N. tabacum 在液氮中使用研钵和研杵将组织研磨成细粉。</li>
			<li>将100 mg研磨组织在300 µl提取缓冲液（40 mM Hepes pH 7.9，5 mM DTT，1.5% CHAPS）中匀浆，加入3 µl蛋白酶抑制剂混合物，冰上解冻。 
			注意：所选植物组织重量（g）与缓冲液体积（ml）的比例为 1:3。</li>
			<li>在 4 °C 条件下，以 30,000 x g 离心提取物 30 分钟。</li>
			<li>将上清液收集至洁净离心管中，并于 -80 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考马斯亮蓝凝胶染色：
	<ol>
		<li>制备总蛋白提取物的适当稀释液（例如， 将2 µl植物提取物、5 µl细菌和昆虫提取物加入提取缓冲液中，调至终体积为10 µl，再加入5 µl 3x上样缓冲液（1.5 M Tris/HCl pH 6.8，3% SDS，15%甘油，4% β-巯基乙醇），使终浓度为1x。</li>
		<li>将样品煮沸10分钟。</li>
		<li>使用10% SDS-PAGE分离蛋白质。</li>
		<li>电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝溶液A（0.05% 考马斯亮蓝R-250，25% 异丙醇，10% 乙酸）中，在微波炉中加热约两分钟至沸腾。</li>
		<li>轻轻摇动使凝胶冷却至室温。</li>
		<li>弃去考马斯亮蓝染色液A。</li>
		<li>在加热条件下，依次使用考马斯亮蓝溶液B（0.05% Brilliant Blue R-250，25%异丙醇）、溶液C（0.002% Brilliant Blue R-250，10%乙酸）和溶液D（10%乙酸）对凝胶进行脱色，每次均遵循与染色相同的实验步骤。</li>
		<li>最后一次用溶液D加热后，继续脱色至背景清晰9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western印迹分析：
	<ol>
		<li>电泳后，采用标准技术将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并在室温下用含4%脱脂奶粉的PBS缓冲液（pH 7.4）封闭1小时。</li>
		<li>在含有1:10,000兔抗目标蛋白一抗及0.1% Tween-20的封闭液中，4 °C孵育过夜或室温孵育4小时。</li>
		<li>一抗孵育后，用含0.1% Tween-20的封闭液洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
		<li>以1:10,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体孵育1.5小时。</li>
		<li>用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液（PBS-T）洗涤膜5次，每次5分钟。</li>
		<li>使用化学发光过氧化物酶底物进行 Western 印迹检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>放射免疫分析法（RIA）：
	<ol>
		<li>让试剂（抗血清、示踪剂和蛋白A Sepharose）恢复至室温，然后将20 µl不同浓度的蛋白提取样品和标准品（含300-2,400 ng/ml商品化重组hGAD65）加入12 x 75 mm聚苯乙烯试管中。</li>
		<li>加入20 µl抗血清，该抗血清由糖尿病患者血浆置换所得血清以1:30比例稀释制备。</li>
		<li>加入50 µl示踪剂（125-I-GAD65），室温孵育2小时。设置仅含示踪剂的管以估算总放射活性。</li>
		<li>加入50 µl蛋白A Sepharose，室温孵育1小时。</li>
		<li>向每支试管中加入1 ml冷的PBS缓冲液，在4 °C、1,500 × g条件下离心30 min。</li>
		<li>将试管倒置以去除上清液，并轻轻敲击试管，使残留液体被吸水纸吸收。</li>
		<li>使用γ计数器对所有试管中的免疫沉淀物放射性进行计数，每管计数1分钟。</li>
		<li>以对数坐标绘制校准品的结合率（B/T %）与总放射活性的关系，建立标准曲线，并根据校准曲线读取样品的GAD浓度10. 
		注意：应设置限制区域，用于放射性物质的储存、操作和处置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
<li>Sambrook, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual.+Second+Edition%22">Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
<li>Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+the+expression+of+proteins+in+plants%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for the expression of proteins in plants).</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system.</a> Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

作者声明，本文发表不存在利益冲突。

本研究比较了三种不同平台表达一种重组人源蛋白的效果：细菌细胞、杆状病毒/昆虫细胞和植物。进一步利用三种广泛应用的植物表达技术对基于植物的表达平台进行了深入探索（即，瞬时表达系统（基于MagnICON和pK7WG2）和稳定表达系统。本实验选用的目标蛋白hGAD65mut此前已在不同表达系统中进行过表达13，其产生和功能易于检测和测量14.
细菌细胞不是一种有效的生产平台，因为即使在低温培养条件下，hGAD65mut 仍会形成包涵体，因此需要繁琐的溶解和复性步骤才能获得其天然构象。事实上，该平台在表达复杂重组蛋白时的主要缺陷在于最终产物的正确构象难以形成。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统可实现免疫反应性重组蛋白的高效表达，但该表达系统的主要局限在于培养昆虫细胞所需的培养基成本较高。据估算，在此生产平台上生产1克hGAD65mut的总成本可达700欧元（按需使用9升昆虫细胞培养基计算）。该表达系统的另一局限是昆虫细胞培养需在无菌条件下进行，要求操作人员具备无菌操作技能。为确保...

利用新兴的生物技术工具，重组蛋白可在异源表达系统中进行商业化大规模生产。选择异源表达系统时需考虑的关键因素包括：蛋白质量、功能活性、工艺速度、产量和成本。
在重组蛋白领域，药品市场正在迅速扩张，因此目前生产的大多数生物制药均为重组蛋白。蛋白质可在细菌、酵母、霉菌、哺乳动物、植物和昆虫的细胞培养体系中表达，也可在植物系统（通过稳定转化或瞬时转化）以及转基因动物中表达；每种表达系统都有其固有的优势和局限性，针对每一种目标重组蛋白，都必须仔细评估其最优的生产系统。
基于植物的表达平台正作为一种重要替代方案，用于安全且经济高效地生产重组蛋白，以取代传统的基于发酵罐的系统。尽管其下游加工成本与微生物和哺乳动物细胞相当，但植物系统在商业化生产中所需的前期投资较低，且通过大面积种植可实现规模经济效益，这是其关键优势。
我们评估了植物作为生物反应器表达人源谷氨酸脱羧酶65 kDa亚型（hGAD65）的可行性，hGAD65是1型自身免疫性糖尿病（T1D）的主要自身抗原之一。hGAD65目前被广泛用作疾病分类和监测疾病进展的标志物，其在T1D预防中的作用正在临床试验中进行研究。如果这些试验取得成功，全球对重组hGAD65的需求将急剧增加。
本文重点研究人谷氨酸脱羧酶65（hGAD65）的酶失活突变体hGAD65mut的表达，该突变体是通过将结合辅因子PLP（磷酸吡哆醛）的赖氨酸残基替换为精氨酸残基（K396R）而产生的1。
hGAD65mut 保留了其免疫原性，并且在植物细胞和昆虫细胞中的积累量比其野生型对应物 hGAD65 高达十倍。人们推测，hGAD65 的酶活性会严重干扰植物细胞的代谢，从而抑制其自身的合成；而无酶活性的 hGAD65mut 则可在植物细胞中积累至更高水平。
为了表达hGAD65mut，本文探索并比较了植物生物技术中广泛使用的不同技术与传统表达平台（Escherichia coli 和杆状病毒/昆虫细胞系统）。
本研究综述并比较了用于表达hGAD65mut的重组表达平台，包括传统系统和基于植物的系统，比较依据为工艺速度、产量以及最终产品的质量和功能。

<table><tbody><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>细菌级琼脂</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM 培养基</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫培养基（未添加补充物）</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>含维生素的 MS 培养基</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>植物琼脂</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>有毒</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td>有毒</td></tr><tr><td>更昔洛韦</td><td>Invitrogen</td><td>I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>有毒</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>有毒</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>有毒 &amp;ndash; DMSO 中 25 mg/ml 储存液</td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td>有毒</td></tr><tr><td>盐酸双氢链霉素</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷）</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td>有毒</td></tr><tr><td>MES 水合物</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biochemical</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>有毒 &amp;ndash; DMSO 中 0.1 M 储存液</td></tr><tr><td>注射器（1 ml）</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP（6-苄氨基嘌呤）</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>有毒</td></tr><tr><td>NAA（萘乙酸）</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>头孢噻肟</td><td>Mylan Generics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>用 1 N HCl 调节 pH 以制备 Tris-HCl 缓冲液</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M 储存液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF（苯甲基磺酰氟）</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>腐蚀性，有毒</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>有毒</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>有毒 &amp;ndash; 1 M 储存液，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td>有毒</td></tr><tr><td>植物蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>避免反复冻融</td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>易燃，有毒，腐蚀性 &amp;ndash; 10% 储存液</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>易燃</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>抗谷氨酸脱羧酶 65/67 抗体</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>避免反复冻融</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>避免反复冻融</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>蛋白 A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>放射免疫分析试剂盒</td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>放射性物质</td></tr></tbody></table>

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

基于植物的系统因其在灵活、低成本地生产高质量、具有生物活性的重组蛋白方面已得到充分证实的潜力，而被视为一种重要的生产平台。
本研究中，我们比较了目标人源重组蛋白在基于传统发酵罐的细胞培养系统（细菌和昆虫）与基于植物的表达系统（瞬时和稳定表达）中的表达情况。
针对每种平台，我们描述了其建立、优化及生产过程所需时间，最终产品的质量、产量，并评估了针对所选目标重组蛋白的初步生产成本。
总体而言，我们的结果表明，由于目标蛋白会在细菌中形成不溶性包涵体而积累，因此细菌不适合用于该蛋白的生产。相比之下，基于植物的表达系统是一种多功能平台，其生产所选蛋白的成本低于杆状病毒/昆虫细胞系统。特别是，稳定转基因品系表现出最高的终产物产量，而瞬时表达植物则具有最快的过程开发速度。然而，并非所有重组蛋白都适用于基于植物的表达系统，最佳生产平台应通过经验确定，采用逐案分析的方法，如本文所述。

本文描述了一种在不同生产系统中异源表达目标重组蛋白的实验设计。首先重点建立了各个平台，通过确定目标蛋白在每种系统中表达的最优条件来完成平台的构建。
在三份重复的 E. coli 培养物中诱导表达目标蛋白 hGAD65mut。在 37 °C 条件下表达 3 小时后，通过离心收集菌体，并采用超声破碎法裂解细胞。经过一次离心步骤后，将可溶性蛋白与不溶性包涵体分离，初步分析表明 hGAD65mut 主要积累于不溶性包涵体中（数据未显示）。重组蛋白的溶解需要使用 6 M 尿素，但由于尿素具有强烈的变性作用，会干扰放射免疫分析（RIA），从而无法对 hGAD65mut 进行准确定量。已有多种策略被报道可用于减少包涵体的形成，其中包括在低温条件下培养微生物细胞11。本实验中，将培养物分别在 15 °C 和 20 °C 下生长，并在相同温度下诱导重组蛋白表达。如图 1A所示，在这两个温度下产生的 hGAD65mut 的溶解仍需依赖尿素（泳道 S2）。因此，在本实验条件下，低温并不能阻止 hGAD65mut 形成不溶性聚集体。...

本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。

基于植物的系统因其在重组蛋白生产方面已有充分记录的潜力，被视为一种重要的生产平台。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的通用方案

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在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。...

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

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利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

了解重组蛋白表达方法，比较发酵罐培养与植物系统的产量差异及优缺点。本研究为优化蛋白质生产效率提供重要参考依据。

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

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