Name: 细胞动力学在小鼠脊髓双光子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习双光子成像技术观察小鼠脊髓中神经前体细胞与轴突的实时相互作用。该方法利用GFP和YFP荧光标记，可维持细胞活性长达10小时，为研究脊髓损伤修复机制提供重要工具。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 R01 GM-41514（资助 M.D.C.）、R39 GM-048071（资助 I.P.）和 R01 NS-074987（资助 T.E.L.），以及美国国家多发性硬化症协会（NMSS）协作中心研究奖 CA1058-A-8（资助 C.M.W.、T.E.L. 和 M.D.C.）、NMSS 基金项目 RG4925、NIH 培训基金 T32-AI-060573（资助 M.L.G.）、NMSS 博士后奖学金 FG 1960-A-1（资助 J.G.W.）和乔治·E·休伊特医学研究基金会（M.P.M.）的资助。

注意：伦理声明：动物操作方案已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，方案编号 #2010-2943。
1. 脊髓的摘除
<ol>
	<li>在安乐死容器中放置用约100%液态异氟烷（USP）浸湿的纸巾，并在上方覆盖干燥的纸巾。将小鼠置于干燥纸巾上，确保小鼠不直接接触异氟烷，并盖好容器。呼吸停止后至少等待一分钟，以确认小鼠已安乐死。</li>
	<li>进行颈部脊髓横断以确保小鼠死亡。不要采用颈椎脱位法，以免损伤脊髓。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠体表，使毛发湿润。</li>
	<li>使用锋利的精细剪刀去除小鼠背部的毛发和皮肤，暴露从大约第一颈椎椎板（C1）至第四骶椎椎板（S4）的脊柱区域。</li>
	<li>使用带有#10刀片的解剖刀，在脊柱左右两侧做切口，分离肌肉和脂肪组织，以便更易于取出脊髓。</li>
	<li>可选：可使用弯头卢尔咬骨钳刮除多余的软组织。</li>
	<li>用带齿的Graefe镊子夹住脊柱上端，在C1处将弯曲面朝上的钛制弯头Vannas剪刀插入暴露的脊柱内，注意避免触碰脊髓。</li>
	<li>将钛制弯头Vannas剪刀完全滑至右侧并进行一次小幅度剪切，剪断椎骨时应能听到并感受到轻微的“咔嚓”声。在脊髓最左侧重复此剪切操作。注意动作不宜过快或剪切幅度过大，以免剪刀损伤脊髓。</li>
	<li>当椎骨两侧被剪断后，可用镊子将单个椎板轻轻提起。重复此步骤，逐个处理每个椎板直至S4，持续夹持并后拉脊柱椎骨。 
	注：移植部位上方的椎骨在切割至移植部位时通常会自然脱落。请从移植部位稍下方开始继续操作。</li>
	<li>可选：将椎骨平放，观察并确定移植部位位置，测量并在移植部位头侧和尾侧各截取约20 mm的脊髓段。 
	注：若移植神经前体细胞（NPCs），通常无需更长的组织，因为移植的NPCs迁移距离一般不超过15 mm。所需脊髓长度取决于实验设计及所移植细胞类型的迁移特性。在移植部位头侧和尾侧进行等距切割有助于在成像过程中更易定位移植位点。</li>
	<li>使用带有#11刀片的解剖刀，从头端开始，小心地切除脊髓腹侧左右两侧的神经节，以便更顺利地将脊髓从腹侧椎骨中取出。 
	注：若快速完成步骤1.7–1.11，脊髓不会干燥。但也可向脊髓滴加1×PBS以保持其湿润。</li>
	<li>将小鼠翻转并提起，使脊髓朝下。用闭合的带齿Graefe镊子小心地将脊髓剥离取出。在不划伤脊髓的前提下，剪断任何残留的神经节，使脊髓能够完整无损地被整体取出。</li>
	<li>确保脊髓置于RPMI-1640培养基中，并将其放置于冰上，以便运输至双光子显微镜进行成像。</li>
</ol>
2. 成像用脊髓的制备
<ol>
	<li>将脊髓包埋于琼脂糖中
	<ol>
		<li>成像前，将分离的脊髓置于冰上预冷的RPMI-1640培养基中保存。</li>
		<li>称取琼脂糖（低凝胶温度），用5 ml 1× PBS配制5%溶液。将5%琼脂糖溶液放入微波炉加热15秒以溶解琼脂糖，随后让溶液冷却至37 °C。</li>
		<li>将脊髓腹侧朝上放置于一片Parafilm膜上，进行脊髓样品准备。</li>
		<li>用移液器将约5 ml的5%琼脂糖溶液覆盖在脊髓腹侧表面。通过冷却至室温使琼脂糖凝固，完全凝固约需5分钟。</li>
		<li>在一块22 mm见方的盖玻片表面薄薄涂上一层组织粘合剂。</li>
		<li>将包埋好的脊髓翻转，使腹侧朝下贴于Parafilm膜上，此时背侧朝上。将盖玻片粘附于脊髓背侧，并将琼脂糖包埋的脊髓与盖玻片整体浸入RPMI培养基中，以固化粘合剂。使用刀片去除多余的已凝固琼脂糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脊髓安装至显微镜载物台上
	<ol>
		<li>在盖玻片底部涂抹一层凡士林，以在灌流过程中稳定样品。</li>
		<li>将脊髓样品置于显微镜载物台的成像槽中，腹侧朝上，正对25倍浸入式物镜。定制的成像槽深度约为20 mm，长50 mm，宽50 mm。</li>
		<li>在持续灌流温热（37 °C）、充氧（95:5 氧气:二氧化碳混合气—碳酰气）且不含血清的RPMI-1640培养基的条件下进行成像。
		<ol>
			<li>将培养基在水浴中预热至37 °C，并通过将管路插入培养基瓶中连接至蠕动泵。</li>
			<li>在管路与成像槽连接处使用加热装置维持培养基温度为37 °C。通过连接至蠕动泵的管路以3 ml/min的流速向成像槽内持续灌流培养基（图1B）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腹侧脊髓的双光子成像
<ol>
	<li>显微镜设置
	<ol>
		<li>使用调谐至900 nm的Chameleon Ultra Ti: Sapphire激光器获取Thy1-eYFP脊髓的图像。将样品处的激光功率衰减至&#60;5%，以确保光毒性最小化16。通过单个串联溶液加热器持续灌注含氧RPMI-1640培养基，并维持恒定的37 °C温度，以保证成像稳定，并防止组织漂移和细胞损伤。</li>
		<li>为分离eGFP和eYFP荧光信号，将520 nm单边二向色镜和560 nm单边二向色镜分束器串联放置，将双光子发射分为三个通道，有意拆分绿色发射以增强可见性。 
		注意：这些通道分别称为蓝绿色（发射波长&#60;520 nm）、绿黄色（520–560 nm）和红色（发射波长&#62;560 nm）。每个通道的发射光由光电倍增管检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位感兴趣成像区域
	<ol>
		<li>使用目镜和明场光源，将浸入式物镜聚焦于脊髓腹侧边缘，以设定参考点。</li>
		<li>确保环境光源关闭，并通过打开激光快门切换至双光子激发模式。</li>
		<li>如条件允许，在搜索组织中的感兴趣区域时，应采用比最终图像采集时更低的分辨率、更大的成像体积（无数字放大）和更高的扫描速率。本系统在搜索感兴趣区域时的典型设置为：分辨率：256像素；成像体积：x = 600 μm，y = 600 μm，z = 0–300 μm。</li>
		<li>观察脊髓腹侧边缘附近的eYFP轴突。胶原蛋白产生的二次谐波信号（蓝色）在脊髓组织边缘最明亮。eYFP轴突位于胶原蛋白二次谐波信号背侧稍远处，其信号在绿黄色通道中可见。</li>
		<li>在脊髓标本的纵向中心定位移植部位14。对于移植eGFP-NPC后1天的小鼠，通过将光路在z轴方向深入组织内部聚焦来定位移植部位。不同动物间移植部位略有差异，但通常位于距腹侧边缘约200 μm处。在移植后第1天以后的小鼠中，可在白质纤维束中观察到eGFP-NPC的细胞簇，位置更靠近腹侧和外侧边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集最终图像
	<ol>
		<li>使用Slidebook 6软件采集分辨率为512像素、成像体积为x = 270 μm、y = 212 μm、z = 100 μm的图像。以2.5 μm为步长连续采集焦平面，构建z轴层扫图像堆栈。</li>
		<li>采用适当的交错偏移进行双向扫描，以快速量化脊髓中迁移物体的运动情况。确保用于测定脊髓内细胞运动速度的理想采集帧率约为每秒1帧。 
		注意：可根据用户个人偏好调整成像参数，例如采集帧率、成像分辨率和成像体积。在给定分辨率下，较大的成像体积通常需要更长的采集时间。</li>
		<li>使用图像分析软件（如Bitplane Imaris 7.7）对Slidebook图像文件进行分析、裁剪、平滑和伪彩处理。通过Slidebook和Imaris中的自动化流程整合连续的成像体积，生成最终的延时视频。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+model+of+MS%3A+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li>
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</ol>

作者没有竞争利益。

为了研究神经前体细胞（NPC）在移植到脱髓鞘小鼠脊髓后其动力学行为和相互作用，需要对完整组织进行实时双光子（2P）成像。活体双光子成像通常用于在活体小鼠中检测脊髓背侧的细胞动态，并已被用于研究脱髓鞘疾病中的背侧脱髓鞘过程17-19。然而，由于移植的NPC会迁移至腹侧白质，而该区域过深，无法通过双光子显微镜在体内原位成像，因此需要采用离体（ex vivo）制备方法。本实验室已使用该方法来确定移植到受损和未受损脊髓中的NPC的迁移能力及再髓鞘化动力学6。离体制备技术不仅允许对脊髓进行纵向扫描，还可从腹侧进行横向扫描6,20，从而能够分析细胞在移植部位、邻近移植部位以及距离移植部位不同位置处的运动差异（速度与方向）及其相互作用6。尽管我们最初设计该制备方法是为了成像移植至脊髓腹侧的eGFP标记NPC，但通过调整脊髓的安装方向，该方法也可用于对腹侧、背侧或侧方的任何荧光标记或染色细胞进行成像。与活体成像相比，该制备方法的优势在于可实现腹侧成像，并且无需麻醉和存活手术——而使用“玻璃窗”装置的新一代活体成像技术仍需进行麻醉和...

脱髓鞘疾病的小鼠模型，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和神经适应性小鼠肝炎病毒（MHV）颅内感染，是研究与疾病相关的分子通路和细胞相互作用的优秀工具。这些模型已推动并支持了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物疗法的有效性，主要靶向抑制自身免疫和炎症反应1。然而，一旦内源性再髓鞘化失败，目前获批的疗法无法有效修复中枢神经系统中的脱髓鞘病灶。因此，在疾病这一阶段，以修复为导向的治疗对于缓解慢性症状和改善生活质量至关重要。近年来，神经前体细胞（NPCs）作为一种潜在的再生治疗手段，逐渐成为研究热点，可用于靶向炎症和脱髓鞘区域。多项研究已证实，NPCs 能够诱导内源性再髓鞘化，并直接参与再髓鞘化过程2-8。由于 NPCs 参与直接再髓鞘化，因此必须深入了解其在移植后与内源性细胞的动力学行为及相互作用。移植后，NPCs 会向腹侧迁移至白质损伤区域，随后相对于移植位点向头端和尾端扩散5,9。迁移动力学因环境信号的不同而有所差异；移植到未受损脊髓中的 NPCs 迁移速度高于移植到受损脊髓中的 NPCs6。在迁移阶段之后，移植的 NPCs 会广泛增殖，在受损脊髓中的增殖速率高于完整脊髓中的增殖速率6。最终，大多数 NPCs 分化为少突胶质细胞，并启动直接再髓鞘化4,6,9。
脱髓鞘病灶结构复杂，可能包含处于不同活化阶段的多种细胞群体。例如，活动性多发性硬化（MS）病灶中可能含有大量活化的T细胞、M1型小胶质细胞和M1型巨噬细胞，而慢性静止性MS病灶则主要由反应性星形胶质细胞构成，炎症细胞较少10-13。由于效应细胞种类多样，利用脱髓鞘小鼠模型进行双光子（2P）成像成为研究病灶内局部细胞间相互作用的极为有用的工具。在MS及许多广泛使用的MS研究模型中，大多数病灶位于脊髓腹侧，该区域因病灶深度较大以及脊髓富含脂质，无法通过活体双光子成像进行观察。为克服这些问题，并研究脊髓腹侧病灶内的细胞间相互作用，我们建立了一种简便的离体（ex vivo）双光子成像制备方法6。
本研究延续了之前的一项方法学发表，该研究展示了在JHMV株鼠肝炎病毒（MHV）诱导脱髓鞘后，将表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的神经前体细胞（NPCs）移植至小鼠脊髓的操作步骤14。五周龄小鼠感染JHMV后，在感染后第14天于胸椎第9节水平移植eGFP-NPCs。本文所述方案详细介绍了如何提取脊髓、制备脊髓的离体琼脂糖标本，并对移植的eGFP-NPCs与表达增强型黄色荧光蛋白（eYFP）的轴突之间的相互作用进行成像。本实验中使用了在神经元特异性Thy1启动子驱动下表达eYFP的小鼠15。仅部分轴突表达eYFP，因此适用于对单个轴突进行成像观察。本文展示的是移植后7天取出的脊髓样本；然而，脊髓可在移植后的任意时间点取出。尽管本文主要展示NPCs与受损轴突之间的相互作用，但本方案也可与其他细胞类型的遗传荧光标记联合使用，以研究小鼠脊髓内发生的多种细胞间相互作用。

<table><tbody><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>锋利</td></tr><tr><td>10号手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>格拉费镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>11号手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>帕拉菲尔膜（Parafilm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td> Vetbond（组织粘合剂）</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 方形盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25倍浸入式物镜，1.1 数值孔径</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>单通道可调速管路泵</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm 单边二向色分光镜</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm 单边二向色分光镜</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>光电倍增管</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L 可变速蠕动泵</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire 激光器&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 软件</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 软件</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

双光子（2P）显微技术被用于揭示活体完整组织深层的细胞动态及其相互作用。本文介绍一种在小鼠脊髓中进行活细胞成像的方法。该技术特别适用于分析神经前体细胞（NPC）在移植后，于发生神经炎症性脱髓鞘疾病脊髓中的动态行为。移植的NPC可迁移至轴突损伤部位，增殖并分化为少突胶质细胞，直接参与髓鞘再形成，因此在治疗慢性脱髓鞘疾病方面具有良好的治疗前景。由于移植的NPC会迁移至脊髓腹侧的损伤区域，传统的活体双光子成像难以实现，以往仅能通过组织化学染色方法获得静态相互作用的信息。尽管本方法最初旨在对脊髓腹侧移植的NPC进行成像，但它也可广泛应用于整个脊髓中移植细胞及内源性细胞的多种研究。本文中，我们展示了对表达增强型黄色荧光蛋白的轴突以及表达增强型绿色荧光蛋白的移植NPC的脊髓样本进行制备与成像的全过程。

尽管离体脊髓成像方案可用于观察脊髓内的任何荧光信号，但我们展示的结果重点呈现了表达eGFP的神经前体细胞（NPC）与表达eYFP的轴突之间的相互作用。图1A展示了包埋后的腹侧脊髓组织制备样本。接着，图1B展示了双光子显微镜的装置及其关键组件。图2显示了在腹侧脊髓单个z轴层扫图像中eGFP与eYFP的荧光信号。连续采集的多个z轴层扫图像可整合生成延时视频，用于分析完整组织内细胞动态的实时变化。根据本方案所述，使用520 nm单边二向色镜和560 nm单边二向色分光镜，可有效分离eGFP与eYFP信号。通过成像软件，可将各个通道分别伪彩为绿色和黄色。
<img alt="用于蛋白质研究的显微镜装置，包括光学组件、样品制备和浴槽设备。" src="/files/ftp_upload/52580/52580fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图...

一种用于小鼠脊髓成像的新型ex vivo制备方法。该方案可实现对整个脊髓内活细胞相互作用的双光子成像。

双光子（2P）显微镜被用于揭示活体完整组织深层的细胞动态与相互作用。本文介绍一种方法……

以下实验的总体目标是实时成像荧光标记的移植神经前体细胞（NPC）与小鼠脊髓中荧光轴突之间的相互作用。该目标通过仔细取出并将其移植了NPC的小鼠脊髓嵌入5%琼脂糖中，然后将其附着于盖玻片上来实现。可通过调整脊髓的方向，观察脊髓任意区域的荧光信号。第二步中，将脊髓标本置于双光子成像台上，用温暖的含氧RPMI培养基持续灌流，对存活的神经前体细胞（NPCs）进行长达10小时的成像。采用合适的单边二向色镜分束器分离YFP和GFP的发射光。最终，双光子成像可实现实时观察表达GFP的神经前体细胞与损伤脊髓中表达YFP的轴突之间的相互作用。该方法有助于回答神经再生领域中的关键问题，例如：移植的神经前体细胞（NPC）对受损轴突进行再髓鞘化所需的分子和细胞信号提示是什么？这些再髓鞘化事件的动力学特征又是怎样的？与现有方法（如只能用于背侧脊髓成像的双光子潮间成像）相比，该技术的主要优势在于，它能够对已迁移至脊髓腹侧深部区域的移植NPC进行成像。在通过脊髓横断确认安乐死后，用70%乙醇润湿小鼠，然后使用锋利的精细剪刀去除动物背部的毛发和皮肤，暴露从大约颈椎第一椎板（C1）至骶椎第四椎板（S4）的脊柱部分。接着，使用带有10号刀片的解剖刀，在脊柱左右两侧做切口，将其与周围的肌肉和脂肪组织分离，并切除脊柱周围及上方多余的组织。这将有助于更轻松地取出椎骨。然后，用锯齿状灰色镊子夹住脊柱顶端的椎骨，将弯曲面朝上的钛制弯头剪刀插入暴露的C1段脊柱内，注意避免触碰脊髓。将剪刀一直滑至右侧，进行一次小切口。当剪刀剪断椎骨时，应能听到并感觉到轻微的碎裂声。在脊髓左侧远端重复此切口操作，注意不要操作过快或切口过大，以免损伤脊髓。当椎骨两侧被切断后，单个椎板应能用镊子抬起。对每一块椎板重复左侧和右侧的切割，直至达到骶骨第四节（S4）。持续夹住并向后牵拉脊髓椎骨。在切断至移植部位时，移植部位上方的椎骨可能会脱落。当椎骨被切除至S4时，将椎骨平放以帮助确定移植部位的位置，并在移植部位的头端和尾端各切除约20毫米。现在使用带有11号刀片的手术刀，从头端开始，仔细切开脊髓腹侧左右两侧的神经节。然后将动物倒置并提起，使脊髓朝下，使用闭合的锯齿状持骨钳从尾端小心剥离出脊髓。在不损伤脊髓的前提下，仔细剪断任何残留的神经节，使脊髓能够完整地以单一片段被取出，并将脊髓放入冰上预冷的培养基中，以准备进行成像。将神经组织转移至一张置于背侧向上的帕拉膜（param）片上。然后用移液器吸取约五毫升新配制的37摄氏度、5%琼脂溶液，覆盖在脊髓组织上，在室温下使其凝固。约五分钟后，取一块22毫米见方的盖玻片，表面薄薄涂上一层组织粘合剂，将包埋的脊髓腹侧朝下倒置贴附于一张新的滤膜上。将盖玻片粘附于暴露的背侧，并将整个标本浸入新鲜培养基中，使粘合剂完全固化。然后使用剃刀刀片去除多余的凝固琼脂糖。接下来，将连接至蠕动泵的管路插入培养基瓶中，该培养基瓶置于水浴中并预热至37摄氏度。以每分钟3毫升的流速，将预热后的培养基通过显微镜载物台上的定制成像孔进行灌注。然后将脊髓标本放入孔板中，腹侧朝上，朝向25倍浸入式物镜。使用双光子显微镜对脊髓腹侧进行成像时，采用调谐至900纳米的超快钛宝石激光器，并将样品处的激光功率衰减至低于5%，以确保光毒性最小。随后，通过目镜和明场光源，将浸入式物镜聚焦于脊髓腹侧边缘。为设定参考点，请确保环境光源已关闭。然后打开激光快门，以切换两个光子激发信号（如果可用）。在寻找组织中的感兴趣区域时，应使用较低的分辨率设置、较大的视野范围（不使用数字放大）以及比最终图像采集时更高的扫描速率。为找到细胞，最好首先在明场照明下聚焦于组织边缘的移植部位，然后切换至荧光观察。可使用大范围的 X 和 Y 轴视野并采用低分辨率，以便在将焦距逐渐移向组织深层时快速查看较大区域。观察脊髓腹侧边缘附近的 EYFP 轴突。此处观察到的胶原蛋白产生的蓝色二次谐波信号在脊髓组织边缘将最为明亮。现在，使用适当的图像采集软件，以2.5微米为步长，在连续的焦平面上采集最终的高分辨率图像，以生成Z轴图像序列。在此图示中，GFP标记的神经前体细胞呈蓝色，受损的YFP标记轴突呈黄色；伪彩着色可在后期使用图像编辑软件完成。随后，采用双向扫描并设置适当的层间偏移，以确保快速定量分析脊髓中任何迁移物体，并将理想的图像采集帧率设定为约每秒1.7帧，以准确测定脊髓内细胞的运动速度。最后，使用适当的软件对图像文件进行裁剪平滑和伪彩处理，并利用自动化流程对连续的成像体积进行筛选，以生成最终的延时视频。尽管这种离体脊髓成像方案可用于观察脊髓内任何荧光信号，但这些图像展示了腹侧脊髓单个Z轴层面上EGFP标记的神经前体细胞与EYFP标记的轴突之间的代表性相互作用。通过连续采集Z轴层面图像，可整合生成延时视频，用于分析完整组织中细胞的实时动态过程。实际上，使用520纳米单边二向色镜和560纳米单边二向色镜分光器可以分离EGFP和EYFP信号，从而在成像软件中将各个通道分别伪染为绿色和黄色，如本示例所示。在进行此操作时，重要的是要注意在去除小鼠脊髓时，应确保不对外周神经组织造成过度拉伸、挤压或意外切割。通过该方法，可实时成像任何荧光标记的细胞或轴突组合，以回答更多科学问题，例如：在不同药物处理或条件下，细胞迁移或再髓鞘化的动力学特征如何？

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细胞动力学在小鼠脊髓双光子成像

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体内 使用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像

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本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

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