从小鼠皮肤不同区域制备用于流式细胞分析的单细胞悬液

本实验的总体目标是从小鼠皮肤制备单细胞悬液，通过流式细胞分析鉴定皮肤中不同类型的常驻免疫细胞群体，并实现其分离。利用该技术，研究人员可轻松消化小鼠皮肤不同区域的样本，同时不破坏目标免疫细胞表面标志物。

为了获取小鼠耳部皮肤样本，剪下耳部无毛部分，并用镊子分离器官的背侧和腹侧。然后轻轻刮除耳内侧，以去除残留的软骨。为了获得组织块皮肤样本，先用剪刀剃除动物全身所有毛发，再涂抹脱毛乳液。

数分钟后擦去乳液，在小鼠背部中央做一垂直切口，并沿小鼠身体周围剃毛区域的边界继续延伸切口。用镊子固定皮肤，同时用手术剪闭合的圆头端或解剖刀分离组织，轻轻将皮肤与腹膜及背部肌肉分开。随后将皮肤浸入含有10 mL冰冻PBS的100 mm细胞培养皿中，并用镊子刮除皮下脂肪。

为获取尾部皮肤样本，剪下尾巴，并使用手术剪从尾根部开始向尾尖做垂直切口。用镊子夹住尾根部切口边缘，再用另一把镊子夹住尾部主体，轻轻将皮肤向尾尖方向剥离。通过轻柔刮除皮肤样本上的多余脂肪组织，清除多余脂肪。

剪下小鼠的足部，然后为了从足垫获取皮肤样本，使用手术剪从踝关节到脚趾根部纵向剪开足部皮肤，注意避免剪到任何毛发。接着用镊子夹住踝骨，同时用另一只手抓住皮肤，像脱手套一样将皮肤向脚趾方向拉下。为了标记皮肤细胞，依次将每个样本转移至含有2毫升 freshly prepared digestion cocktail 的35毫米培养皿中。

使用剪刀将样品剪成小块，将组织碎片在37摄氏度下孵育90分钟，孵育期间轻柔振荡一至两次。接着，将消化后的皮肤组织倒入含有1毫升添加胎牛血清的RPMI 1640培养基的66毫米培养皿中的70微米细胞筛网上。用5毫升新鲜培养基冲洗筛网，然后使用注射器活塞将样品挤压通过筛网滤孔。

用20毫升新鲜培养基冲洗活塞、培养皿和滤网，并将组织悬液转移至50毫升锥形管中。待所有样品处理完毕后，离心细胞，并将沉淀重悬于每样品100微升含2微克/毫升抗CD16/CD32封闭抗体的PBS缓冲液（含1% FBS）中。在4摄氏度孵育15分钟后，避光条件下向相应样品中加入100微升抗体（具体抗体见表格说明），在4摄氏度继续孵育30分钟。

孵育结束后，用一毫升含FBS的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于300微升含FBS的PBS中。然后在避光条件下，于4摄氏度用每毫升2微克的DAPI对细胞染色10分钟。为分离白细胞，首先圈选DAPI阳性细胞群以去除死细胞。

然后通过前向散射面积与前向散射宽度图选择单细胞群体，并根据目标白细胞的大小和颗粒度对细胞设门。接着，选择CD45阳性细胞，随后根据CD11C和MHC II类分子的表达情况鉴定每个样本中的皮肤树突状细胞群体。通过CD64和F480的表达鉴定巨噬细胞，通过CD19和MHC II类分子的表达鉴定B细胞，通过CD4或CD8的表达鉴定T细胞。

如上所述，皮肤免疫细胞的分离可获得来自皮肤各区域、活力超过50%的细胞群体，每平方厘米皮肤可获得5,000至15,000个CD45阳性细胞。从小鼠皮肤一平方厘米组织中，还可获得足够数量的树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞，用于后续分析，如上所述。观看本视频后，您应充分掌握如何消化非炎症性皮肤组织，并分离白细胞用于流式分析。