Name: 正常和恶性肌细胞移植到免疫受损成年斑马鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习正常和恶性肌细胞移植技术，使用免疫缺陷rag2突变斑马鱼研究肌肉再生与肿瘤生长。该方法可在10天内观察细胞植入，为再生医学和癌症研究提供可靠平台。

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本工作由 Alex’s Lemonade Stand 基金会（D.M.L.）、美国癌症协会（D.M.L.）、麻省总医院 Howard Goodman 研究员项目（D.M.L.）以及美国国立卫生研究院基金 R24OD016761 和 1R01CA154923（D.M.L.）资助。CNY 流式细胞术核心实验室及流式图像分析获得共享仪器基金 1S10RR023440-01A1 资助。I.M.T. 由葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia – FCT）提供的研究员项目资助。Q.T. 由中国国家留学基金管理委员会资助。我们感谢 Angela Volorio 提出的宝贵意见和建议。

所有动物实验程序均经麻省总医院研究动物护理小组委员会批准，批准编号为 #2011N000127。
第1节. 骨骼肌细胞移植至成年rag2E450fs纯合突变型斑马鱼
1. 成年斑马鱼供体骨骼肌细胞的制备
<ol>
	<li>获取肌肉组织带有荧光标记的转基因成年斑马鱼。本实验中，使用了30条α-actin-RFP供体鱼25，每条受体鱼移植1 × 106个细胞。</li>
	<li>将供体斑马鱼置于1.6 mg/ml的三卡因甲磺酸盐（MS222）中处死，持续10分钟，或直至鳃盖无任何运动。</li>
	<li>将供体鱼放置在吸水性纸巾上，使用洁净的剃刀片切取背部肌肉。切割位置应靠近肛门，呈45°角，以最大化组织采集量（如图1A所示）。将解剖所得组织放入洁净的10 cm培养皿中。</li>
	<li>向解剖组织中加入500 μl悬浮缓冲液（预冷的0.9×磷酸盐缓冲液（PBS），添加5%胎牛血清（FBS））。最多可将10条供体斑马鱼的组织共同置于该体积中。</li>
	<li>使用剃刀片将组织切碎&#62;20次，直至细胞形成均匀悬浮液。整个背部肌肉组织（包括皮肤、骨骼和鳍）均需均质化。加入2 ml悬浮缓冲液。使用5 ml移液管反复吹打细胞悬液≥20次，以充分解离细胞。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 μm滤网过滤至置于冰上的50 ml锥形管中。</li>
	<li>用额外的2.5 ml悬浮缓冲液冲洗培养皿，以收集残留组织，并通过同一滤网和锥形管过滤，最终体积为5 ml（每次分离最多可使用10条供体鱼）。 
	注意：皮肤、骨骼和鳍在过滤后将被去除。</li>
	<li>如适用，可将相似的悬浮液合并至同一锥形管中。</li>
	<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞总数。</li>
	<li>如需进行流式细胞术分析，可保留500 μl细胞悬液（可选步骤，见步骤2）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于0.9× PBS + 5% FBS中，浓度为3.33 × 105个细胞/μl。每条受体鱼注射3 μl，共移植1 × 106个细胞（见步骤3）。 
	注意：移植入受体鱼的细胞悬液体积应少于3 μl。若细胞数量有限，每条受体鱼移植低至5 × 104个细胞仍可实现成功植入（表1）。</li>
</ol>
2. 供体骨骼肌细胞制备的流式细胞术分析（可选）
<ol>
	<li>按照步骤1.1所述，从wild type非转基因鱼中分离肌肉组织。该样本作为阴性对照，有助于设定流式细胞术的门控参数。</li>
	<li>加入适当的活细胞染料。例如，向500 μl肌肉悬液中加入5 μl储存液DAPI溶液（500 ng/μl）。分析前轻微涡旋混匀。采集5 × 103至1 × 104个事件。先分析wild type对照样本以设定门控，随后分析从转基因鱼中分离的肌肉细胞。 
	注意：流式细胞术分析通常在肌肉组织解离后1小时内进行，此时解离细胞的存活率可保持在60%以上（图2）。细胞在操作过程中应始终置于冰上。移植前可使用台盼蓝染色液和血细胞计数板重新评估总细胞存活率。</li>
</ol>
3. 成年rag2纯合突变型斑马鱼骨骼肌细胞的肌肉内移植
<ol>
	<li>用10 μl 26S G微量注射器，依次吸入并推出10%漂白液（5次）、70%乙醇（5次），最后用悬浮缓冲液（0.9x PBS + 5% FBS，10次）清洗注射器。</li>
	<li>将2–4月龄的纯合rag2突变型斑马鱼或野生型受体鱼（作为对照）置于盛有养殖用水的培养皿中，逐滴加入三卡因甲磺酸盐（MS222，4 mg/ml 储备液），直至鱼鳃盖运动减缓且鱼体静止不动，以实现麻醉。 
	注意：三卡因麻醉剂量需根据受体斑马鱼的年龄和体型进行调整。</li>
	<li>将已麻醉的受体斑马鱼放置在湿润的纸巾或海绵上，使其左侧朝上。</li>
	<li>将注射针头插入鱼体侧背肌（参见图1A），确保以45°角进行注射。每条鱼注射3 μl细胞悬液（按步骤1.12制备），总计注入1 × 106 个细胞。</li>
	<li>使用塑料勺小心地将注射后的斑马鱼转移至洁净的养殖缸中，使其恢复。</li>
	<li>在移植后第10、20、30天，通过明场和落射荧光显微镜观察已麻醉的受体斑马鱼，评估其细胞植入率。</li>
</ol>


第2节. 胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）移植至成年纯合rag2突变型斑马鱼
4. 斑马鱼胚胎的DNA显微注射
<ol>
	<li>通过使用XhoI在37 °C下消化10 μg的DNA，持续6小时或过夜，将rag2-kRASG12D质粒线性化7。</li>
	<li>采用标准的酚:氯仿抽提法纯化DNA，并用乙醇沉淀。将DNA重悬于20 μl去离子水中（也可使用商品化的DNA片段纯化柱）。</li>
	<li>将未消化和已消化的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，通过分光光度计读数测定DNA浓度。或者，将样品按1:1、1:5和1:10稀释后在1%琼脂糖凝胶上电泳，与DNA Marker比较进行定量。</li>
	<li>制备注射混合液，终浓度为15 ng/μl的线性化rag2-kRASG12D DNA，溶于0.1 M KCl和0.5x Tris-EDTA中。在2 nl的注射体积中，最终注入的DNA量为30 pg。 
	注意：每枚胚胎最多可高效共注射三种不同的DNA构建体，总DNA量不超过60 pg。这些转基因将整合到基因组中，并在发育中的肿瘤内共表达26。</li>
	<li>将线性化的rag2-kRASG12D DNA注射至单细胞期胚胎中，基本操作如文献所述27，注射至目标斑马鱼品系中（图1B）。为提高效率，注射应直接进入细胞而非卵黄。本实验中使用了双转基因AB品系：myf5-GFP, mylpfa-mCherry。按照标准饲养方案培育斑马鱼28。 
	注意：注射后胚胎的存活率通常取决于所使用的斑马鱼品系。平均而言，约30%的注射胚胎会发展为ERMS。每次实验应注射300–600枚胚胎，以确保获得足够数量的GFP阳性及mCherry阳性的原发肿瘤，用于后续移植与分析。</li>
</ol>
5. 斑马鱼幼鱼中初级胚胎型横纹肌肉瘤的筛选
<ol>
	<li>在注射后10至30天内观察注射的斑马鱼，检测体表可见的原发性胚胎横纹肌肉瘤（ERMS）的出现。</li>
	<li>在注射后第30天，通过向含有养殖系统水的培养皿中逐滴加入三卡因甲磺酸盐（MS222，4 mg/ml 储液）对受体斑马鱼进行麻醉，直至鳃盖运动减缓且鱼体静止。 
	注意：三卡因麻醉剂的剂量取决于受体斑马鱼的年龄和大小。携带原发性肿瘤的斑马鱼需要较低剂量的三卡因。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜，筛选 myf5-GFP 阳性和 mylpfa-mCherry 阳性的原发性ERMS携带鱼。</li>
</ol>
6. 胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）肿瘤制备
<ol>
	<li>在 1.6 mg/ml 三卡因甲磺酸盐（MS222）溶液中处死选定的携带原发性 ERMS 的斑马鱼，持续 10 分钟，或直至观察不到鳃盖运动。</li>
	<li>对每条携带肿瘤的斑马鱼单独处理。将鱼置于洁净的培养皿中，使用刀片和精细镊子围绕肿瘤进行解剖（如图 1B所示）。将解剖出的肿瘤组织转移至另一个洁净的培养皿中。</li>
	<li>加入 100 μl 预冷的含 5% 胎牛血清（FBS）的 0.9x 磷酸盐缓冲液（PBS）。用洁净的刀片切碎组织，切&#62;20 次，直至细胞呈均匀悬浮状态。</li>
	<li>加入 900 μl 相同的缓冲液（0.9x PBS + 5% FBS），使用 1000 μl 滤芯吸头反复吹打数次以解离细胞。通过 40 μm 滤网过滤至对应的 50 ml 锥形管中。置于冰上保存。</li>
	<li>用额外的 2–4 ml 缓冲液冲洗培养皿，并将冲洗液通过同一滤网滤入对应的锥形管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 1,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 100 μl 缓冲液中。</li>
	<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞总数。</li>
	<li>用相同的缓冲液（0.9x PBS + 5% FBS）将细胞稀释至所需浓度。用于移植时，应将细胞稀释至 5 × 103 个细胞/μl，每条受体斑马鱼注射 5 μl，即总共移植 2.5 × 104 个细胞。</li>
	<li>也可取第 6.5 步所得少量细胞悬液进行流式细胞术分析，以定量样本中荧光标记细胞的相对比例。 
	注意：在第 3.5 步过滤后，保留 100 μl 细胞悬液，加入 400 μl 含 5% FBS 的 0.9x PBS 缓冲液，用于流式细胞术分析。为确保正确的设门，需额外使用来自成年wild type、myf5-GFP 和 mylpfa-mCherry 斑马鱼的单转基因肿瘤组织或肌肉组织进行对照分析。流式细胞术操作基本按照第 1 节第 2 步所述方法进行。</li>
</ol>
7. 将胚胎横纹肌肉瘤移植到成年 rag2 纯合突变型斑马鱼中
<ol>
	<li>用10 μl 26S G微量注射器，吸取并推出10%次氯酸钠溶液（5次），然后用70%乙醇（5次），最后用悬浮缓冲液（0.9x PBS + 5% FBS，10次）清洗注射器。</li>
	<li>将受体纯合rag2突变型斑马鱼置于培养皿的系统水中，逐滴加入三卡因甲磺酸盐（MS222，4 mg/ml 储存液），直至鳃盖运动变慢且鱼体静止不动，以实现麻醉。</li>
	<li>将麻醉后的受体斑马鱼腹面朝上放置在湿润的纸巾或海绵上。</li>
	<li>向腹腔内注射5 μl细胞悬液（每条受体鱼注射2.5 × 104个细胞）。 
	注意：不同肿瘤之间注射时，应按照步骤4.1所述方法清洗注射针。根据受体鱼的大小，可有效进行5–10 μl的腹腔移植。每条受体鱼注射1 × 104至5 × 105个未分选细胞即可完成肿瘤移植（表1）。</li>
	<li>用塑料勺小心地将受体斑马鱼转移至洁净的养殖缸中。</li>
	<li>在移植后第10、20和30天，通过明场和落射荧光显微镜观察麻醉后的鱼体，评估受体斑马鱼的移植率。</li>
	<li>将成功移植的斑马鱼用于后续实验应用，包括荧光激活细胞分选（FACS）以评估分化状态（图3H）、标准组织学分析（图3F）、治疗反应成像15，以及包括极限稀释分析在内的连续移植实验11。</li>
</ol>

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作者不存在相互竞争的经济利益。

通过一种极为简单的细胞制备方法，随后将细胞注射至rag2 homozygous突变型斑马鱼的背部骨骼肌中，成功实现了成年背部骨骼肌细胞高效且稳定的移植。总体而言，肌肉内注射操作具有良好的稳健性，尽管在移植操作后立即出现一定程度的死亡，死亡率在不同实验中约为10%至35%。进一步的优化可能集中在使用更细规格的注射针头，以及开发基于显微镜和显微操作仪的固定式注射装置，以提高细胞移植的便捷性。本研究方法采用未经分选的供体动物肌肉细胞，其中肌肉前体细胞的比例仅约为30%。若使用可标记干细胞的转基因报告品系并结合流式细胞分选（FACS）技术进行细胞分离，有望获得更高纯度的细胞悬液，从而提高在受体鱼中的移植效率。此外，骨骼肌细胞也可在移植前进行富集与体外培养，方法如先前文献所述29。值得注意的是，我们的结果还表明，供体肌肉组织的微环境建立及其分化过程在移植后10天内即已完成，这确立了该模型作为一种稳定且快速的实验平台，可用于评估肌肉移植与再生能力。此外，本实验与小鼠模型中的研究形成鲜明对比：在小鼠中，通常需在移植前两天使用 cardiotoxin 或氯化钡对肌肉进行预损伤处理30,31。而在本模型中，移植过程中针头造成的机械损伤可能通过激发受体动物体内再生微环境的形成，从而促进移植细胞的定植32,33。我们还预计，本方法可轻松拓展应用于更年轻阶段斑马鱼的骨骼肌组织移植，从而实现对影响早期骨骼肌发育但导致幼体致死的遗传突变进行功能评估。
我们还提供了一种详细的斑马鱼ERMS移植方案，通过腹腔注射将肿瘤移植至未经预处理的受体斑马鱼体内， rag2 纯合突变鱼。该方法可用于扩增双转基因原发性肿瘤，而无需在同源转基因品系中诱导肿瘤。我们近期的研究表明，细胞移植方法为评估胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）药物敏感性提供了新的实验模型。 体内 其中单个肿瘤可扩增至数千只动物，用于评估其对生长、自我更新及新生血管形成的影响15此外，我们已成功将多种肿瘤移植到 rag2 包括T细胞急性淋巴母细胞白血病、黑色素瘤和胚胎性横纹肌肉瘤的纯合突变鱼23展望未来，我们设想这些细胞系将有助于评估癌症的重要功能特性 体内 包括评估肿瘤内异质性、侵袭、转移、血管生成及治疗耐药性。此外，生成 rag2 Casper品系斑马鱼中的纯合突变体，该品系具有光学透明特性34 有望促进对癌症众多特征的直接成像。
我们总共提供了详细的实验方案，用于将荧光标记的正常和恶性骨骼肌成功移植到成年rag2纯合突变型免疫缺陷斑马鱼中。

斑马鱼是研究再生的优良模型，因为它们能够再生被截断的鳍以及受损的脑、视网膜、脊髓、心脏、骨骼肌和其他组织1。成年斑马鱼的干细胞与再生研究主要集中于损伤后再生过程的表征，而通过细胞移植鉴定来自不同组织的干细胞和前体细胞则直到最近才开始探索2。此外，斑马鱼也越来越多地被用于癌症研究，通过构建模拟人类疾病的转基因癌症模型来开展相关研究3–10。
在癌症研究中，细胞移植技术已被广泛采用，可动态评估多种重要的癌症生物学过程，包括自我更新11、功能异质性12,13、新生血管形成14、增殖、治疗反应15以及侵袭16,17。然而，由于宿主免疫系统会攻击并清除移植物，移植的细胞常在受体鱼体内被排斥18。已有多种方法用于克服移植物排斥问题。例如，可在移植前通过低剂量γ射线照射短暂清除受体动物的免疫系统18,19。但受体的免疫系统通常在照射后20天内恢复，进而清除供体细胞18。另一种方法是使用地塞米松处理以抑制T细胞和B细胞功能，从而实现更持久的免疫抑制，支持多种人类肿瘤在受体鱼体内移植并维持长达30天14。然而，该方法需持续给药，且仅适用于实体瘤的研究。长期移植实验曾采用遗传背景完全相同的同系品系20–22，其中供体与受体细胞具有免疫相容性。但此类模型需将目标转基因品系与同系背景杂交超过四代，才能获得完全同系的品系。为避免受体鱼发生免疫排斥，本课题组近期开发了一种免疫缺陷型rag2E450fs 纯合突变体品系（ZFIN等位基因命名为rag2fb101），该品系T细胞和B细胞功能显著降低，可支持多种组织的移植23。类似的免疫缺陷型小鼠模型已被广泛用于小鼠及人类组织的细胞移植研究24。
本文介绍了骨骼肌和胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）的移植方法。ERMS 是一种具有骨骼肌特征的儿童肉瘤。我们将这些组织移植至新近报道的 rag2 纯合突变型斑马鱼体内。免疫缺陷型成年斑马鱼的建立，拓展了我们开展大规模细胞移植研究的能力，可直接可视化观察并评估正常与恶性组织中干细胞的自我更新能力。利用该方法，将来自成年 α-actin-RFP25 转基因斑马鱼的荧光标记肌肉细胞移植至 rag2 纯合突变型斑马鱼的背部肌组织后，细胞能够有效植入并定植。此外，我们还证明了将原发性 myf5-GFP; mylpfa-mCherry 转基因 ERMS 细胞通过腹腔注射移植至 rag2E450fs 纯合突变型斑马鱼后，肿瘤细胞能够成功植入并扩增。这些实验方案的应用价值超越了本文所展示的示例，可便捷地推广至其他斑马鱼再生组织及癌症研究中。

<table><tbody><tr><td>1× Tris-EDTA 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283-100ML</td><td>显微注射。注射混合液。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Science Education</td><td>S77375-1</td><td>显微注射。注射混合液。</td></tr><tr><td>XhoI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>显微注射。质粒线性化。</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104 (50) 或 28106 (250)</td><td>显微注射。用于纯化长度不超过 10 kb 的线性化质粒。</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1753I-100</td><td>显微注射。用于纯化线性化质粒。</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖，500&amp;nbsp;g</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>显微注射。线性化质粒定量。</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td><td>显微注射。线性化质粒定量。</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>流式细胞术/FACS</td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底试管</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td>流式细胞术收集管</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>特殊订单研究产品（SORP）项目</td><td>FACS</td></tr><tr><td>5 ml 聚丙烯圆底试管</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>FACS 收集管</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td>特殊订单研究产品（SORP）项目</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（1×）</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>移植</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td>移植</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS-222）</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td><td>移植。麻醉剂。注意：具有刺激性。对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激作用。</td></tr><tr><td>VWR 吸水性实验台垫巾</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td>移植。可使用普通纸巾或海绵作为替代品。</td></tr><tr><td>单刃工业剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>移植</td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯一次性无菌</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>移植</td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m 尼龙</td><td>Falcon-Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>移植</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Corning Incorporated</td><td>430828</td><td>移植</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液（0.4%）</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>移植</td></tr><tr><td>血细胞计数板套装&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>移植</td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器，固定针头，容积 10 &amp;micro;l，针头规格 26s 号（斜面针尖）</td><td>Hamilton</td><td>80366</td><td>移植</td></tr><tr><td>Austin's A-1 商用漂白剂</td><td>James Austin Company</td><td></td><td>移植。可使用任何市售溶液。</td></tr><tr><td>190 证明酒精</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>DSP-MD.43</td><td>显微注射（线性化质粒纯化）和移植。可使用任何市售&amp;nbsp;溶液。</td></tr><tr><td>高速微型离心机，300D 数字微型离心机</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C0265-24</td><td>移植</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004539&amp;nbsp;</td><td>移植。适用于 120 V、60 Hz（美国）的目录号。</td></tr><tr><td>5 ml 刻度移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357529</td><td>移植</td></tr><tr><td>Corning Stripettor Plus 移液控制器</td><td>Corning Incorporated</td><td>4090</td><td>移植。可使用任何自动移液控制器。</td></tr><tr><td>无粉检查手套</td><td></td><td></td><td>所有步骤。可使用任何市售品牌。</td></tr><tr><td>带滤芯移液吸头和微量移液器</td><td></td><td></td><td>所有步骤。可使用任何市售品牌。</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11205-20</td><td>移植</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>评分。可使用任何合适的荧光体视显微镜。</td></tr><tr><td>Olympus DP72 显微镜数字相机</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>评分。可使用多种适用于所选成像系统的相机。</td></tr></tbody></table>

正常与恶性肌肉细胞移植入免疫缺陷的成年斑马鱼

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

斑马鱼已成为评估发育、再生和癌症的有力工具。近年来，异体细胞移植技术的发展使得正常细胞和恶性细胞能够成功植入经辐照、同源或免疫缺陷的成年斑马鱼体内。这些模型结合优化的细胞移植方案，可快速评估干细胞功能、损伤后的组织再生以及肿瘤发生过程。本文介绍了一种将成年斑马鱼骨骼肌细胞及胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）——一种具有胚胎肌特征的儿童肉瘤——移植到免疫缺陷的成年rag2E450fs 纯合突变斑马鱼体内的方法。重要的是，这些动物缺乏T细胞，且B细胞功能减弱，有利于来自非相关供体动物的多种组织成功植入。我们优化的实验方案显示，来自α-actin-RFP转基因斑马鱼的荧光标记肌肉细胞制剂，植入rag2纯合突变鱼背部肌肉后能高效定植。我们还展示了基于细胞分化状态限制荧光表达的荧光转基因ERMS的植入效果。具体而言，ERMS在AB品系的myf5-GFP; mylpfa-mCherry双转基因动物中诱导产生，并将肿瘤细胞注射至成年免疫缺陷鱼的腹腔内。该移植技术的应用范围广泛，适用于多种正常和恶性供体细胞，这些细胞可被植入成年斑马鱼的背部肌肉或腹腔中。

一种骨骼肌细胞的制备与移植操作流程 α-肌动蛋白-RFP 将转基因供体植入免疫缺陷的纯合rag2突变型斑马鱼 已在方案第1节中展示（ 图1A 和 图2）。骨骼肌组织从 α-肌动蛋白-RFP 转基因供体所获得的单细胞悬液经流式细胞分析及DAPI排除法评估，活细胞比例为84.3%图 2B)。RFP阳性细胞占该单细胞悬液的35.3%（图2C). 将细胞移植至背侧骨骼肌中 rag2 纯合突变型受体鱼表现出稳定且强烈的移植效果，通过单个细胞分化为多核纤维进行评估（1 x 106 每条鱼注射的细胞数， 表1, 图2D-I). 野生型 受体 在30天的实验期间，鱼类未能成功植入肌纤维（n = 13）。移植后10天，14条中有9条 rag2 纯合突变型斑马鱼在注射部位附近含有RFP阳性肌纤维（64.3%） 图2E,F）。重要的是，移植后30天时，植入的RFP阳性肌肉仍持续存在（图2G-I），其中部分动物在移植后被追踪观察达115天，显示出强健且持续的肌肉移植效果（数据未显示）。这些结果与本课题组先前报道的结果相似。23 采用相同的实验方案（表1).
我们还介绍了一种将ERMS肿瘤细胞生成、制备并移植到rag2纯合突变型受体鱼腹腔中的方法（方案第2部分，图1B和图3）。ERMS在双转基因myf5-GFP；mylpfa-mCherry鱼中产生，该模型已被证明可在移植后实现肿瘤内异质性的可视化以及对肿瘤细胞亚群的功能分析11。然而，由于鱼类在出生后10至30天发生ERMS时体型较小，且可用于下游应用的肿瘤细胞数量有限，因此对各亚群进行进一步分子表征较为困难。一种解决方案是通过将ERMS移植到成年受体斑马鱼体内以扩增肿瘤细胞数量。迄今为止，类似实验已使用CG1品系的同源性斑马鱼完成，但需经过超过4代的回交才能建立携带myf5-GFP; mylpfa-mCherry转基因的同源性品系。为避免上述问题，我们证明了免疫缺陷型rag2纯合突变型受体斑马鱼可用于移植AB品系斑马鱼的原发性ERMS。所有原发性ERMS均成功移植至rag2纯合突变型动物体内，实现了肿瘤的扩增（表1）。近期也有类似报道显示，在27只rag2纯合突变型斑马鱼中，有24只成功移植ERMS，而在7只野生型同胞鱼中无一例成功移植疾病23。在图3E中展示了移植后30天的一个代表性ERMS实例。移植后的ERMS在组织学特征上与胚胎型横纹肌肉瘤相似，与原发肿瘤一致（图3B和图3F）。FACS分析证实，ERMS包含功能上不同的肿瘤传播细胞以及表达myf5-GFP和/或mylpfa-mCherry的分化细胞。腹腔注射操作后的存活率超过95%。受体斑马鱼通常在移植后30天时间点之后因肿瘤负荷而死亡。
<img alt="Muscle and ERMS transplantation diagram; tissue preparation, centrifuge, flow cytometry in zebrafish." src="/files/ftp_upload/52597/52597fig1highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. （A）正常与（B）恶性骨骼肌细胞移植的实验流程示意图 rag2 纯合突变体 斑马鱼. 可选步骤以 (*) 标注。
<img alt="表达α-肌动蛋白-RFP的斑马鱼转基因品系、流式细胞术结果及移植率柱状图分析。" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 骨骼肌细胞移植至rag2纯合突变型斑马鱼中的嵌合情况。（A）α-actin-RFP转基因供体斑马鱼。（B）通过DAPI染料排除法和流式细胞术评估分离的肌肉细胞悬液的细胞活力。（C）在来自α-actin-RFP供体（红色）的肌肉细胞悬液中检测到的RFP阳性细胞比例，与野生型对照（灰色）相比。（D-E）移植后30天的野生型动物（D）或rag2纯合突变型鱼（E）的明场与荧光图像叠加图。（F）随时间变化的移植率。红色表示成功移植的动物数量，灰色表示未成功移植的鱼类。各时间点分析的动物数量已标明。（G-I）图E中标注框区域在移植后10天（G）、20天（H）和30天（I）的高倍放大图像，显示分化肌纤维随时间的保留情况（箭头所示）。比例尺为2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Zebrafish ERMS analysis, histological images, flow cytometry data, tumorigenesis study chart." src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 移植 myf5-GFP; mylpfa-mCherry 横纹肌肉瘤（ERMS）进入 rag2 纯合突变体 斑马鱼 (A-D) rag2-kRASG12D AB品系中诱导产生的原发性横纹肌肉瘤 myf5-GFP；mylpfa-mCherry 斑马鱼在出生后30天。E-H) rag2 纯合突变型斑马鱼移植ERMS后，在移植后第30天进行分析。A, E原发性和移植性ERMS的明场与荧光图像合并图。肿瘤区域已标出，箭头指示注射部位 E. (B, F) 原发性（经苏木精和伊红染色的石蜡切片B）以及移植的ERMS（胚胎性横纹肌肉瘤）F) 显示与癌症相关的细胞密度增加区域。C, G通过DAPI染料排除法和流式细胞术评估细胞活力。D, H) 通过流式细胞术评估的荧光标记肿瘤细胞亚群。比例尺为 2 mm（A, E）和 50 μm (B, F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="移植数据表：组织类型、供体年龄、注射部位和植入率。" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 肌肉和胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）细胞移植的植入结果。 (*) 表示使用相同技术先前已报道的数据23。数据经《自然方法》（Nature Methods）许可重印。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>

本文介绍了一种将斑马鱼骨骼肌及胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）细胞移植到成年免疫缺陷的 rag2E450fs 纯合突变型斑马鱼体内的实验方案。该方案可有效用于分析肌肉细胞的再生能力及恶性转化过程。

斑马鱼已成为评估发育、再生和癌症的有力工具。最近，同种异体细胞移植方案已……

本实验的总体目标是演示如何准备并移植正常和恶性肌肉组织，从转基因供体斑马鱼移植到rag2免疫缺陷型斑马鱼受体中。肌肉移植首先通过解剖背部肌肉组织，分离出荧光标记的肌肉。斑马鱼肌肉细胞经匀浆处理后过滤并制成单细胞悬液，随后将细胞直接移植到rag2突变型斑马鱼的肌肉内。利用表观荧光显微镜，可在移植后最早第10天开始追踪受体动物中的组织植入情况。类似地，可获取原发性胚胎横纹肌肉瘤，将其制备成细胞悬液后，移植到rag2突变型斑马鱼的腹腔内。然后利用显微镜观察组织移植情况，扩增的肿瘤细胞可用于后续应用。使用成年免疫缺陷型斑马鱼进行细胞移植的主要优势在于，它为多种组织和肿瘤类型的同种异体移植提供了一个通用平台。可以从不同遗传背景的供体中移植组织，而无需对受体鱼进行免疫抑制处理。该方法有助于回答干细胞与再生生物学中的关键问题，例如前体细胞的自我更新能力。我们还可以利用这些方法将肿瘤植入 rag2 突变型斑马鱼中，进而筛选出能够抑制肿瘤生长的新型化合物。接下来将由 LAL 实验室的两名优秀研究生——chin、tang 和 anes 演示正常与恶性肌肉细胞的制备及移植过程。首先，处死带有荧光标记肌肉的供体斑马鱼。典型的成年α-肌动蛋白RFP标记供体鱼可获得50万至200万个肌肉细胞。在本示例实验中，我们使用30条供体鱼，将细胞移植到20条受体鱼中，每条受体鱼移植100万个细胞。在处死供体鱼后，将其放置在一次性纸巾上，使鱼体干燥。使用剃刀刀片采集背侧肌组织。切割位置应在肛门区域后方呈45度角，包含骨骼和皮肤组织，将10个采集到的背侧肌肉组织片段转移至洁净的培养皿中。然后加入500 µL预冷的含5% FBS的0.9倍PBS悬浮缓冲液。接着，将组织切碎，直至获得均匀的悬液，使用5毫升血清移液管充分匀浆组织，向匀浆液中加入2毫升悬液缓冲液，然后用移液管吹打悬液20次。随后，使用40微米细胞筛过滤悬液，并将细胞收集至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上。在后续操作过程中保持细胞处于低温状态。用 2.5 毫升悬浮液和缓冲液冲洗滤器中的剩余组织，并将滤液收集至 50 毫升锥形管中。随后，使用台盼蓝计数活细胞总数，并在 4°C 下以 1000 ×g 离心 10 分钟浓缩细胞。然后将细胞重悬于含 5% FBS 的 0.9 倍 PBS 中，细胞浓度为每微升 333,000 个细胞。如果供体细胞数量有限，注入低至50,000个细胞也可能成功实现移植。首先用三卡因麻醉2至4月龄的rag2缺陷型斑马鱼。当观察到鳃盖运动变慢且鱼体不再活动时，将鱼转移至湿润的毛巾上，使鱼体左侧朝上。现在使用一支预先清洁的10微升26号规格微量注射器，将3微升制备好的肌肉细胞悬液注入受体鱼的背侧肌群。注射时应以45度角进行，并直接将细胞悬液注入受体鱼的背外侧肌组织。需要注意的是，在进行肌肉内移植时，注入受体鱼体内的总体积应少于3微升。随后，小心地将受体鱼转移至含有洁净循环水的恢复缸中。继续注射剩余的鱼，并将它们放入一个恢复缸中。之后，分别处理每个肿瘤，使用明场和落射荧光显微镜在移植后第10、20和30天评估移植率。处死一条患有胚胎型横纹肌肉瘤的鱼。将鱼置于一个洁净的培养皿中，使用刀片和精细镊子将肿瘤从非恶性组织中分离出来。仔细地在肿瘤周围进行解剖，可获得较高纯度的细胞悬液，并最大程度减少周围肌肉组织的污染。将解剖出的肿瘤转移至新的培养皿中，加入100 µL预冷的含5% FBS的0.9 X PBS悬浮缓冲液。然后用剃刀片切碎组织，直至获得均匀的悬液。接着使用1毫升移液器加入额外的900微升缓冲液，随后用移液器反复吹打悬液数次，以解离细胞。现在通过40微米的细胞筛过滤细胞。通过加入额外的2至4毫升悬浮液缓冲液，并通过同一细胞筛过滤，冲洗培养板。按之前的方法浓缩细胞。将细胞置于冰上。然后用100微升缓冲液重悬细胞，并用台盼蓝计数活细胞。将细胞悬液浓度调整至每微升5,000个细胞。接下来，将两条免疫缺陷的受体斑马鱼麻醉，并将其腹部朝上放置在干净的纸巾上。使用一支已消毒的26号针头注射器，将所需体积的液体注入受体斑马鱼的腹腔内。将25,000个细胞注入五微升（5 µL）中。然而，最多可成功注入10微升（10 µL）。注射后的鱼应先置于恢复缸中恢复，再放回主系统。随后，使用落射荧光显微镜追踪受体鱼的细胞植入情况，并收获细胞用于后续研究。采用所述方法，将来自α-肌动蛋白RFP转基因供体的骨骼肌细胞移植到免疫缺陷的纯合rag2突变型斑马鱼中。所获得的骨骼肌组织经处理后得到单细胞悬液，经DPI排斥法评估，细胞活力为84.3%。流式细胞术分析显示，该供体细胞悬液中 RFP 阳性细胞占 35.3%。将细胞移植至 RAG2 纯合突变型受体鱼的背部骨骼肌后， consistently and strong and graftman。这一点通过受体鱼体内形成多核荧光肌纤维得到证实，而野生型受体鱼则未能成功植入肌纤维。然而，在移植后10天，14条突变型斑马鱼中有9条在注射部位附近出现了RFP阳性肌纤维。重要的是，移植的RFP阳性肌肉至少在移植后30天仍持续存在。同样，在将携带胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）的RAG2突变型斑马鱼进行移植后，也获得了显著的移植效果。移植的胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）在组织学特征上与原发性ERMS肿瘤相似，通过荧光分析评估，肿瘤细胞的异质性得以维持。观看本视频后，您应能够充分理解如何对受体成年免疫缺陷斑马鱼进行正常组织和恶性组织的肌肉移植及腹腔内移植。在此基础上，还可进一步开展其他方法，如荧光激活细胞分选、有限稀释移植分析和实时PCR，以评估不同肿瘤亚群之间的功能和分子差异。总体而言，我们的方法能够实现荧光标记的肌肉组织和恶性组织在免疫缺陷的 RAG 二号突变型斑马鱼体内稳定且长期的移植。该方法的优势在于，移植过程无需对受体鱼进行预先的免疫抑制，也无需供体与受体动物之间的免疫匹配。

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科研

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