正常与恶性肌肉细胞移植入免疫缺陷的成年斑马鱼

本实验的总体目标是演示如何准备并移植正常和恶性肌肉组织，从转基因供体斑马鱼移植到rag2免疫缺陷型斑马鱼受体中。肌肉移植首先通过解剖背部肌肉组织，分离出荧光标记的肌肉。

斑马鱼肌肉细胞经匀浆处理后过滤并制成单细胞悬液，随后将细胞直接移植到rag2突变型斑马鱼的肌肉内。利用表观荧光显微镜，可在移植后最早第10天开始追踪受体动物中的组织植入情况。类似地，可获取原发性胚胎横纹肌肉瘤，将其制备成细胞悬液后，移植到rag2突变型斑马鱼的腹腔内。

然后利用显微镜观察组织移植情况，扩增的肿瘤细胞可用于后续应用。使用成年免疫缺陷型斑马鱼进行细胞移植的主要优势在于，它为多种组织和肿瘤类型的同种异体移植提供了一个通用平台。可以从不同遗传背景的供体中移植组织，而无需对受体鱼进行免疫抑制处理。

该方法有助于回答干细胞与再生生物学中的关键问题，例如前体细胞的自我更新能力。我们还可以利用这些方法将肿瘤植入 rag2 突变型斑马鱼中，进而筛选出能够抑制肿瘤生长的新型化合物。接下来将由 LAL 实验室的两名优秀研究生——chin、tang 和 anes 演示正常与恶性肌肉细胞的制备及移植过程。首先，处死带有荧光标记肌肉的供体斑马鱼。

典型的成年α-肌动蛋白RFP标记供体鱼可获得50万至200万个肌肉细胞。在本示例实验中，我们使用30条供体鱼，将细胞移植到20条受体鱼中，每条受体鱼移植100万个细胞。在处死供体鱼后，将其放置在一次性纸巾上，使鱼体干燥。

使用剃刀刀片采集背侧肌组织。切割位置应在肛门区域后方呈45度角，包含骨骼和皮肤组织，将10个采集到的背侧肌肉组织片段转移至洁净的培养皿中。然后加入500 µL预冷的含5% FBS的0.9倍PBS悬浮缓冲液。

接着，将组织切碎，直至获得均匀的悬液，使用5毫升血清移液管充分匀浆组织，向匀浆液中加入2毫升悬液缓冲液，然后用移液管吹打悬液20次。随后，使用40微米细胞筛过滤悬液，并将细胞收集至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上。在后续操作过程中保持细胞处于低温状态。

用 2.5 毫升悬浮液和缓冲液冲洗滤器中的剩余组织，并将滤液收集至 50 毫升锥形管中。随后，使用台盼蓝计数活细胞总数，并在 4°C 下以 1000 ×g 离心 10 分钟浓缩细胞。然后将细胞重悬于含 5% FBS 的 0.9 倍 PBS 中，细胞浓度为每微升 333,000 个细胞。

如果供体细胞数量有限，注入低至50,000个细胞也可能成功实现移植。首先用三卡因麻醉2至4月龄的rag2缺陷型斑马鱼。当观察到鳃盖运动变慢且鱼体不再活动时，将鱼转移至湿润的毛巾上，使鱼体左侧朝上。

现在使用一支预先清洁的10微升26号规格微量注射器，将3微升制备好的肌肉细胞悬液注入受体鱼的背侧肌群。注射时应以45度角进行，并直接将细胞悬液注入受体鱼的背外侧肌组织。需要注意的是，在进行肌肉内移植时，注入受体鱼体内的总体积应少于3微升。随后，小心地将受体鱼转移至含有洁净循环水的恢复缸中。

继续注射剩余的鱼，并将它们放入一个恢复缸中。之后，分别处理每个肿瘤，使用明场和落射荧光显微镜在移植后第10、20和30天评估移植率。

处死一条患有胚胎型横纹肌肉瘤的鱼。将鱼置于一个洁净的培养皿中，使用刀片和精细镊子将肿瘤从非恶性组织中分离出来。仔细地在肿瘤周围进行解剖，可获得较高纯度的细胞悬液，并最大程度减少周围肌肉组织的污染。将解剖出的肿瘤转移至新的培养皿中，加入100 µL预冷的含5% FBS的0.9 X PBS悬浮缓冲液。

然后用剃刀片切碎组织，直至获得均匀的悬液。接着使用1毫升移液器加入额外的900微升缓冲液，随后用移液器反复吹打悬液数次，以解离细胞。

现在通过40微米的细胞筛过滤细胞。通过加入额外的2至4毫升悬浮液缓冲液，并通过同一细胞筛过滤，冲洗培养板。按之前的方法浓缩细胞。

将细胞置于冰上。然后用100微升缓冲液重悬细胞，并用台盼蓝计数活细胞。将细胞悬液浓度调整至每微升5,000个细胞。

接下来，将两条免疫缺陷的受体斑马鱼麻醉，并将其腹部朝上放置在干净的纸巾上。使用一支已消毒的26号针头注射器，将所需体积的液体注入受体斑马鱼的腹腔内。

将25,000个细胞注入五微升（5 µL）中。然而，最多可成功注入10微升（10 µL）。注射后的鱼应先置于恢复缸中恢复，再放回主系统。

随后，使用落射荧光显微镜追踪受体鱼的细胞植入情况，并收获细胞用于后续研究。采用所述方法，将来自α-肌动蛋白RFP转基因供体的骨骼肌细胞移植到免疫缺陷的纯合rag2突变型斑马鱼中。所获得的骨骼肌组织经处理后得到单细胞悬液，经DPI排斥法评估，细胞活力为84.3%。

流式细胞术分析显示，该供体细胞悬液中 RFP 阳性细胞占 35.3%。将细胞移植至 RAG2 纯合突变型受体鱼的背部骨骼肌后， consistently and strong and graftman。这一点通过受体鱼体内形成多核荧光肌纤维得到证实，而野生型受体鱼则未能成功植入肌纤维。

然而，在移植后10天，14条突变型斑马鱼中有9条在注射部位附近出现了RFP阳性肌纤维。重要的是，移植的RFP阳性肌肉至少在移植后30天仍持续存在。同样，在将携带胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）的RAG2突变型斑马鱼进行移植后，也获得了显著的移植效果。

移植的胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）在组织学特征上与原发性ERMS肿瘤相似，通过荧光分析评估，肿瘤细胞的异质性得以维持。观看本视频后，您应能够充分理解如何对受体成年免疫缺陷斑马鱼进行正常组织和恶性组织的肌肉移植及腹腔内移植。在此基础上，还可进一步开展其他方法，如荧光激活细胞分选、有限稀释移植分析和实时PCR，以评估不同肿瘤亚群之间的功能和分子差异。

总体而言，我们的方法能够实现荧光标记的肌肉组织和恶性组织在免疫缺陷的 RAG 二号突变型斑马鱼体内稳定且长期的移植。该方法的优势在于，移植过程无需对受体鱼进行预先的免疫抑制，也无需供体与受体动物之间的免疫匹配。