Name: 在组织变性/再生和癌症的研究利用小鼠诱导端粒酶等位基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解利用小鼠诱导端粒酶等位基因研究组织变性、再生与癌症的方法。通过羟基他莫昔芬激活端粒酶，可缓解衰老表型并促进神经发生，为衰老与肿瘤研究提供新思路。

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J.H. 受美国国立卫生研究院（NIH）K99/R00 独立之路奖（5K99CA172700）和国家癌症研究所（NCI）脑癌SPORE职业发展奖（2P50CA127001）资助。

注意：本方案中的所有步骤均已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心的批准。
1. 生成 mTERT-ER 等位基因
<ol>
	<li>通过电穿孔将包含 ERT2-LBD（配体结合域）的基因敲入靶向载体导入小鼠 ES 细胞，该载体位于 mTERT 基因组序列（外显子 1 至内含子 2）的上游且阅读框一致，并携带一个 Lox-pgk-Neo-Lox 片段（图 1A）。</li>
	<li>在含有新霉素的培养基中培养 ES 细胞 6–10 天。挑选具有新霉素抗性的克隆，转移至 48 孔板中扩增。使用 commercial kit 提取基因组 DNA，并通过 Southern 印迹法确认基因敲入等位基因。</li>
	<li>在倒置显微镜下，使用显微操作试剂盒将两个核型正常比例超过 95% 的 ES 细胞系注射入 C57BL/6 囊胚中。将囊胚植入假孕母鼠子宫内23。将高嵌合率（70–90%）的雄性嵌合鼠与 C57BL/6 雌鼠交配。</li>
	<li>通过 Southern 印迹法确认杂合子 mTERT-ERneo 动物的基因型。</li>
	<li>将杂合子 mTERT-ERneo 动物与 EIIa-Cre 动物交配，以删除 NeoR 盒式结构。将杂合子动物与 C57BL/6 动物连续回交至少三次，并进一步将杂合子 mTERT-ER 动物相互交配，以获得纯合子个体。</li>
</ol>
2. LSL-mTERT 等位基因的构建
<ol>
	<li>通过电穿孔法将包含LoxP-三重终止子-Neo-LoxP片段及mTERT基因组序列（位于外显子1与内含子2之间，图1B）的基因敲入靶向载体导入小鼠胚胎干细胞（ES细胞）23。</li>
	<li>在含有新霉素的培养基中培养ES细胞6–10天。挑选具有新霉素抗性的克隆，转移至48孔板中扩增。使用 commercial kit 提取基因组DNA，并通过Southern印迹法确认基因敲入等位基因23。</li>
	<li>在倒置显微镜下，使用显微操作试剂盒将两个核型正常比例超过95%的ES细胞系注射入C57BL/6囊胚中。将囊胚植入假孕母鼠子宫内23。将高嵌合率（70–90%）的雄性嵌合鼠与C57BL/6雌鼠交配。</li>
	<li>通过Southern印迹法确认杂合型LSL-mTERT动物的基因型。</li>
	<li>将杂合型动物与C57BL/6动物交配至少三次，随后进一步将杂合型LSL-mTERT动物相互交配以获得纯合子个体。</li>
</ol>
3. 端粒酶的再激活 mTERT-ER 和 LSL-mTERT 小鼠 体内
 对于 mTERT-ER
<ol>
	<li>在注射前对所有手术器械进行灭菌。</li>
	<li>使用异氟烷麻醉舱（诱导浓度4%，维持浓度2%），以50%（v/v）氧气和50%（v/v）一氧化二氮的混合气体麻醉小鼠。或者使用氯胺酮-赛拉嗪混合物（100 mg/kg体重 + 10 mg/kg体重）进行麻醉。</li>
	<li>当小鼠达到深度麻醉状态后，将其从诱导舱中取出，并使其头部保持在连接异氟烷麻醉舱（2%）的管路中。</li>
	<li>轻捏小鼠足垫以确认其处于深度麻醉状态。在双眼涂抹眼膏，防止角膜干燥。用聚维碘酮溶液擦拭小鼠背部皮肤。</li>
	<li>使用精密套管针（10 G）将缓释型4-OHT药丸植入小鼠背部皮下，并将药丸完全推至两肩之间的中线位置。</li>
	<li>使用伤口夹闭器封闭切口，并监测小鼠从麻醉中恢复的情况。10天后移除伤口夹。&#160;由于操作时间较短，无需额外提供保温措施。</li>
	<li>4-OHT药丸的处理时间应根据研究目的进行优化。</li>
</ol>
对于 LSL-mTERT
<ol>
	<li>他莫昔芬（10 mg/ml，溶于玉米油）连续两天腹腔注射（200 µl/25 g/天）。
	</li>
</ol>
4. 神经干细胞的分离与端粒酶的重新激活 体外
<ol>
	<li>使用二氧化碳处死小鼠并取出脑组织。&#160;按照商业神经组织解离试剂盒制造商提供的方案进行操作。&#160;</li>
	<li>将标有“Solution 4”的小瓶中的冻干粉末用1 ml细胞培养基重悬，用于配制Solution 4。不要涡旋震荡。此溶液应分装后于–20 °C保存，以备后续使用。</li>
	<li>使用前将混合液在37 °C预热15分钟。</li>
	<li>配制酶混合液1：Solution 1（50 µl）和Solution 2（1,900 µl）。配制酶混合液2：Solution 3（20 µl）和Solution 4（10 µl）。</li>
	<li>每处理不超过400 mg组织，需准备1,950 µl酶混合液1，并进行涡旋震荡。使用前在37 °C预热15分钟。</li>
	<li>取出出生1天的小鼠脑组织，去除嗅球和小脑，保留前脑。自取出后即将前脑组织置于1 ml冷培养基中，并保存于4 °C。确保在1小时内完成神经组织的处理。</li>
	<li>称量组织重量，确保每次消化的组织量不超过400 mg。将脑组织置于直径35 mm培养皿的皿盖上，用解剖刀碾碎脑组织。</li>
	<li>使用1 ml移液枪头，加入1 ml不含Ca/Mg的HBSS，并将组织碎片吹打转移至15 ml离心管中。用不含Ca/Mg的HBSS冲洗。室温下以300 × g离心2分钟，小心吸除上清液。</li>
	<li>每处理不超过400 mg组织，加入1,950 µl预热的酶混合液1（Solutions 1和2）。将15 ml离心管置于37 °C孵育15分钟，每隔5分钟轻轻颠倒或振荡混匀一次。</li>
	<li>每份组织样本加入20 μl Solution 3和10 μl Solution 4，配制成30 µl酶混合液2，然后加入样本中。轻轻颠倒混匀，禁止涡旋震荡。</li>
	<li>使用宽口、火焰抛光的巴斯德移液管，通过缓慢吹打10次进行机械性组织解离。避免产生气泡。</li>
	<li>在37 °C孵育10分钟，每隔3分钟轻轻颠倒一次离心管。</li>
	<li>如果组织质量超过200 mg，则重复步骤4.11和步骤4.12。</li>
	<li>将细胞悬液通过置于50 ml离心管上的70 μm细胞筛网过滤。用10 ml PBS冲洗筛网。弃去细胞筛网，将细胞悬液在室温下以300 g离心20分钟，彻底吸除上清液。</li>
	<li>用干细胞培养基将细胞重悬至所需体积，用于后续实验。</li>
	<li>为激活LSL-mTERT NSCs中的端粒酶，用100 µM 4-OHT处理细胞两天。为激活mTERT-ER NSCs中的端粒酶，将细胞维持在含100 µM 4-OHT的培养基中培养。</li>
</ol>
5. 端粒荧光原位杂交（Telomere FISH）
<ol>
	<li>从培养的细胞中制备中期染色体。</li>
	<li>对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，使用二甲苯脱蜡，并依次用乙醇系列（100%、90%、70%、50%乙醇）各5分钟进行水化，再用PBS处理5分钟。</li>
	<li>在甲醇:乙酸（3:1）中后固定1-2小时。用冷乙醇系列脱水，每次5分钟（70%、90%、100%乙醇），然后空气干燥。在37 °C下用1x PBS洗涤5分钟。</li>
	<li>在37 °C下用4%甲醛变性染色体2分钟。用冷乙醇系列脱水，每次5分钟（70%、90%、100%乙醇），然后空气干燥。</li>
	<li>向每张载玻片上加入12至25 µl的PNA杂交混合液。（杂交液组成：70%甲酰胺，0.06x SSC，0.2% BSA，0.5 ng/µl tRNA，0.5 ng/µl端粒或着丝粒探针）</li>
	<li>用橡胶胶水密封盖玻片。在80 °C下对染色体标本和组织切片进行后变性处理4分钟。在湿盒中于室温或37 °C下杂交2-4小时。</li>
	<li>在室温下用洗涤缓冲液洗涤2次，每次15分钟。（洗涤缓冲液：70%甲酰胺，0.06x SSC，pH 7.2）。在室温下用PBST洗涤3次，每次5分钟。用DAPI或远红荧光复染载玻片，用于显微镜观察。</li>
</ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
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<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
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<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们报道了两种可诱导小鼠端粒酶等位基因的构建以及如何重新激活端粒酶 在体 和 体外. 重新激活mTERT-ER活性的关键步骤是维持他莫昔芬的持续浓度，因此我们选择使用美国Innovative Research of America公司生产的4-OHT缓释颗粒。这些颗粒可持续释放4-OHT，维持其在血液中的稳态水平为1&#8201;ng/ml，持续长达60天。在之前的一项研究中，我们发现，通过该策略重新激活端粒酶活性，能够改善由G4代端粒功能障碍所诱导的多种器官退行性表型，例如干细胞耗竭、组织损伤应答能力下降以及器官衰竭。mTERTER/ER 小鼠20.
除了研究端粒酶在衰老中的功能外，这两种可诱导的端粒酶等位基因还可用于癌症研究。先前的研究利用这些等位基因探讨了端粒缩短以及端粒酶再激活在T细胞胸腺淋巴瘤21和前列腺癌22基因组形成及其生物学行为中的作用。这两项研究表明，在晚期第4代G4 Atm-/- mTERTER/ER 小鼠和G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L 小鼠中，端粒功能障碍为肿瘤起始过程中早期致突变事件的积累提供了机制支持，但同时抑制了完全恶性肿瘤的进展。当在端粒功能障碍引起的基因组不稳定的背景下重新激活端粒酶时，DNA损伤检查点被抑制，染色体不稳定性显著降低，从而允许恶性肿瘤充分进展，并获得新的生物学特性，例如前列腺癌的骨转移21和胸腺淋巴瘤的脑浸润21。类似现象也在其他癌症类型中被观察到，包括结肠癌和胰腺癌（与Haoqiang Ying博士、Adam Boutin博士和Ronald DePinho博士的个人交流）。
由于TERT-ER蛋白的活性状态可根据动物是否接受他莫昔芬或溶剂处理而在“开启”和“关闭”之间轻松切换，因此利用mTERT-ER等位基因构建的肿瘤模型可用于测试抗端粒酶治疗策略。在先前的研究中，G4 Atm-/- mTERTER/ER动物体内产生的肿瘤在撤除4-羟基他莫昔芬（4-OHT）后，随着端粒酶的耗竭，最终因端粒功能障碍诱导的检查点重新激活而缩小21。然而，部分肿瘤通过激活端粒替代延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）来应对端粒酶失活，从而获得耐药性。对这些ALT阳性耐药肿瘤的进一步表征显示，其线粒体生物学和氧化防御相关基因的转录出现异常，其中包括线粒体合成与氧化防御的主要调控因子PGC-1β。敲低PGC-1β或SOD2（另一种氧化防御调控因子）可显著清除ALT阳性肿瘤细胞，而端粒酶阳性肿瘤细胞则相对保持完整21。
这两种基因敲入等位基因的一个局限性在于，由于它们位于端粒酶基因的天然位点，因此只能实现端粒酶在内源性水平上的重新激活。而在大多数人类癌症中，端粒酶的实际表达水平要高得多。为了提高端粒酶的表达水平，我们可以考虑的一种改进方案是将带有更强启动子（如PGK（磷酸甘油酸激酶）启动子）的mTERT-ER构建体插入到Rosa26位点。
总之，这两种新型的可诱导小鼠端粒酶等位基因提供了前所未有的遗传工具，可用于研究端粒酶在衰老和组织稳态以及肿瘤进展中的功能，尤其是在已存在端粒功能障碍所导致的基因组不稳定的背景下。通过与其它易发肿瘤的小鼠模型杂交，mTERT-ER 等位基因还可用于研究抗端粒酶治疗。

端粒酶是一种负责维持端粒的酶。端粒是位于染色体末端的重复序列，可保护染色体的完整性。端粒酶全酶的核心组分包括一个具有逆转录酶活性的催化亚基（TERT）和一个作为合成端粒重复序列模板的RNA亚基（TERC）1,2。端粒酶在分化成熟的体细胞中通常处于抑制状态，但在生殖细胞、癌细胞和干细胞中表现出显著的活性，并发挥重要作用。
mTERC 和 mTERT 基因敲除小鼠提供了极大的帮助 体内 用于研究端粒酶在干细胞和癌症中功能的模型系统。该 mTERC 和 mTERT 基因敲除小鼠（G1）由于小鼠端粒具有较长的储备，未表现出任何明显的表型3然而，连续互交 mTERC 和 mTERT 敲除小鼠至晚期世代（G5-G6）导致端粒进行性缩短，最终引发高度增殖组织的严重退化4晚期代次（G5-G6） mTERC-/- 小鼠由于睾丸中高水平的细胞凋亡及生殖细胞耗竭而不育。G5-G6 mTERC-/- 小鼠由于组织干细胞/祖细胞区室中凋亡率较高且自我更新能力缺陷，也在高增殖性组织（包括骨髓、肠道和皮肤）中表现出退行性表型。4. 晚期世代骨髓中的造血干细胞 mTERC-/- 小鼠表现出增殖潜能下降、自我更新能力受损、凋亡增强，并最终导致功能耗竭5,6同样，在G1至G6各连续世代的肠隐窝中均观察到逐渐增加的凋亡小体 mTERC-/- 小鼠7,8. 功能失调的端粒的有害影响似乎不仅限于高更新率的组织，因为成年神经干细胞的增殖也受到同样影响 体外 以及神经发生 体内 在晚期世代（G4-G5）中严重受损 mTERC-/- 小鼠9端粒酶在干细胞中的作用进一步得到了一种罕见的人类遗传病——先天性角化不良症（dyskeratosis congenita, DKC）研究发现的支持，该疾病在某些方面类似于早衰。10,11DKC 由基因突变引起 TERC, TERT以及编码端粒酶核心亚基——角化不良蛋白（dyskerin）和其他与角化不良蛋白相关蛋白的基因12平均而言，DKC 患者的端粒长度短于99%的同龄对照人群。该疾病的主要临床表现为再生障碍性贫血，其病因是造血干细胞的维持功能缺陷。疾病的其他表现，如口腔白斑、指甲营养不良、智力障碍、睾丸萎缩以及肺部并发症，均提示组织干细胞和前体细胞功能受损。10，这些发现与端粒酶基因敲除小鼠在晚期世代中的结果高度一致。DKC患者易患骨髓增生异常综合征，并且恶性黏膜肿瘤的发生率升高。因此，人类患者中端粒酶的缺陷重现了晚期世代端粒酶基因敲除小鼠中所观察到的干细胞功能障碍及肿瘤易感性表型。
端粒缩短和端粒酶活性升高是癌症的典型特征。当正常或癌前细胞分裂时，由于端粒酶活性较低或缺失，端粒最终会逐渐磨损，并激活类似于DNA双链断裂（DSBs）所引发的细胞检查点机制13。与经典的DSBs类似，端粒功能障碍已被证实可诱导p53及其相关的细胞反应，例如细胞衰老和/或凋亡14,15。当p53发生突变失活后，端粒功能障碍的细胞其增殖周期和存活能力增强，从而提供了一种促癌性的突变机制，其特征为染色体易位以及局部扩增和缺失16,17。与此同时，持续的端粒功能障碍及相关的大范围染色体不稳定性（即使在p53缺失的细胞中）似乎会限制此类癌症向完全恶性进展。例如，与Ink4a/Arf缺失小鼠相比，晚期世代（G4-G5）的mTERC-/- Ink4a/Arf-/-小鼠由于端粒严重缩短，淋巴瘤发生率显著降低。在另一项研究中，由于明显的生长停滞和细胞凋亡，G4代mTERT-/- APCmin小鼠中更晚期的腺瘤样病变也较APCmin小鼠显著受到抑制18,19。端粒功能障碍引起的基因组不稳定性反而抑制肿瘤进展这一现象提示：端粒酶的激活可能部分通过抑制基因组不稳定性至肿瘤细胞可耐受的水平，或中和p53依赖性或非依赖性的检查点机制，从而促进恶性肿瘤的发展。
为了研究端粒酶再激活是否能够停止甚至逆转干细胞的衰老，以及在基因组不稳定的背景下端粒酶再激活是否会促进肿瘤发生，我们构建了两种可诱导的小鼠端粒酶等位基因。第一种是4-羟基他莫昔芬（4-OHT）可诱导的TERT-雌激素受体（mTERT-ER）融合基因敲入等位基因。在无4-OHT的情况下，携带mTERT-ER纯合子（记为mTERTER/ER）的小鼠缺乏端粒酶活性，表现出与传统的mTERT或mTERC基因敲除模型相同的细胞遗传学和细胞表型。经4-OHT处理后，TERT-ER蛋白的活性可恢复至与天然TERT蛋白相当的水平20, 21。第二种等位基因是一种新型的可诱导TERT敲入等位基因，包含一个内含子中的LoxP-终止序列-LoxP盒（LSL-mTERT）；在Cre介导的LSL序列切除后，mTERT可在内源性表达调控机制下重新表达22。

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 显微操作套件</td><td>Leica</td><td>按报价</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B 倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>按报价</td><td></td></tr><tr><td>新霉素</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮-赛拉嗪混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT 缓释丸</td><td>Innovative Research of America</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>精密穿刺针（10 号规格）</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹施加器</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>夹子</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>神经组织解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA 端粒探针</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA 着丝粒探针</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>橡胶胶水</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠可诱导端粒酶等位基因研究组织退变/再生与癌症

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

端粒功能障碍引起的基因组完整性丧失及其相关的DNA损伤信号传导和检查点反应是导致衰老过程中组织退化的明确驱动因素。癌症的发病率随年龄显著增加，其特征表现为端粒缩短和端粒酶活性升高。为了研究端粒功能障碍和端粒酶再激活在衰老与癌症中的作用，本实验方案展示了如何构建两种可诱导的小鼠端粒酶基因敲入等位基因 4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导型端粒酶逆转录酶-雌激素受体（mTERT-ER） 和 Lox-终止子-LoxTERT (LSL-mTERT）。该方案描述了诱导端粒功能障碍并重新激活端粒酶活性的实验步骤 mTERT-ER 和 LSL-mTERT 小鼠 体内代表性数据表明，端粒酶活性的重新激活可改善由端粒功能障碍引起的组织退行性表型。为了确定端粒酶重新激活对肿瘤发生的影响，我们构建了前列腺肿瘤模型G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L 以及胸腺T细胞淋巴瘤模型G4 Atm-/- mTERT内质网/内质网代表性数据表明，在端粒功能障碍引起的基因组不稳定性背景下，端粒酶的再激活可显著增强肿瘤发生。本方案还描述了从神经干细胞（NSCs）中分离的实验步骤 mTERT-ER 和 LSL-mTERT 小鼠并重新激活神经干细胞中的端粒酶活性 体外代表性数据显示，端粒酶的再激活可增强自我更新能力及神经发生 体外最后，本方案描述了在小鼠福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）脑组织以及培养细胞的中期染色体上进行端粒荧光原位杂交（FISH）的操作步骤。

小鼠模型的构建策略 mTERT-ER 和 LSL-mTERT 基因敲入等位基因的描述见于 图1A 和 1B。具体而言，一个 LoxP-三重密封塞-Neo-LoxP 片段被插入到第1个外显子和第2个外显子之间 mTERT 位点以生成 LSL-mTERT 等位基因。为了生成 mTERT-ER 等位基因，ERT2-LBD 结构域与之同框 mTERT 基因被插入到第1个外显子的N端。我们发现，当通过给予4-OHT缓释丸处理4周，在端粒功能障碍小鼠中短暂重新激活端粒酶时，可在多个器官（如脑）中改善退行性表型图2A）以及睾丸（图2B). 为了确定端粒酶再激活对培养细胞的影响 体外我们从晚期传代的G4中分离出神经干细胞（NSCs） LSL-mTERT 和 G4 mTERT-ER 小鼠。我们发现，当端粒酶在端粒功能失调的神经干细胞（NSCs）中被重新激活时，NSCs的自我更新能力显著增强（图3A）和 体外 神经发生也显著增强（图3B）。为了确定端粒酶再激活在端粒功能障碍背景下对肿瘤发生的影响，我们构建了 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L （前列腺肿瘤模型）和 Atm-/- mTERT内质网/内质网 （胸腺T细胞淋巴瘤模型）晚期世代群体。通过他莫昔芬处理并在小鼠体内注射以重新激活端粒酶后图 4A）或植入4-OHT缓释颗粒持续8周（图4B)，在前列腺肿瘤模型中，肿瘤发生显著增强（图4A）和胸腺T细胞淋巴瘤模型（图4B最后，我们报道了在福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑组织上进行端粒荧光原位杂交（FISH）的实验方案（图5）以及中期染色体（图5（插图）。
<img alt="显示使用 LoxP、Neo 终止序列和分析探针位点靶向 mTERT 的基因编辑示意图。" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：(A) mTERT-ER 基因敲入策略。TV，靶向载体；WT，野生型等位基因；KI，敲入等位基因；LA，左臂；RA，右臂；E1，外显子 1；E2，外显子 2；neo，由 pgk 启动子驱动的新霉素抗性基因；ER，修饰的雌激素受体（ERT2）配体结合域；DT，白喉毒素基因。(B) LSL-mTERT 基因敲入策略。TV，靶向载体；WT，野生型等位基因；KI，敲入等位基因；LA，左臂；RA，右臂；E1，外显子 1；E2，外显子 2；neo，由 pgk 启动子驱动的新霉素抗性基因；STOPPER，三个重复的转录终止序列；DT，白喉毒素基因。
<img alt="Brains and testes histology comparison, placebo vs. 4-OHT treatment at G0 and G4 stages." src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：代表性数据展示端粒酶再激活可改善器官的退行性表型。 大脑的代表性图像（左） G0 和 G4 的睾丸（右侧） mTERT-ER 经安慰剂或4-OHT处理4周的小鼠。比例尺表示 50 µm. 经许可重新印刷自 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Cell microscopy comparing G4 mTERT-ER and LSL-mTERT effects with 4OHT; Tuj1/DAPI staining results." src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3：代表性数据展示端粒酶再激活可增强神经干细胞的自我更新能力与神经发生 体外. (AG4代分离的神经干细胞代表性图像 LSL-mTERT （上图） 和 G4 mTERT-ER （下图）在添加溶剂或4-OHT的干细胞培养基中培养。B代表性图像 体外 G4来源的神经干细胞的神经发生（Tuj1+） mTERT-ER 在含1% FBS的分化培养基中培养，分别用溶剂或4-OHT处理。比例尺表示 100 µm.
<img alt="Tumor growth in mTERT mouse models; tissue comparison; experiment results." src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4：代表性数据，显示在基因组不稳定性背景下，端粒酶再激活可增强肿瘤发生。 (A代表性图像：从G0代小鼠中分离的前列腺肿瘤 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERT+/-，G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERT-/-, 和 G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L 经他莫昔芬处理。转载自，经许可 22. (BG0代小鼠胸腺T细胞淋巴瘤的代表性图像 Atm-/- mTERT+/ER，G4 Atm-/- mTERT内质网/内质网 对照处理，以及 G4 Atm-/- mTERT内质网/内质网 经4-OHT处理8周。比例尺表示1 cm。
<img alt="脑组织横截面解剖结构及荧光成像；插图为显微细节。" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：小鼠福尔马林固定石蜡包埋脑组织及中期细胞（插图）端粒和着丝粒FISH的代表性图像。红色代表DNA，绿色代表端粒染色，青色代表着丝粒染色。比例尺表示1 mm。

端粒和端粒酶在衰老和肿瘤发生中发挥着关键作用。本实验方案的目标是展示如何构建两种可诱导的小鼠端粒酶敲入等位基因，并说明如何利用这些模型研究组织退化/再生以及癌症。

端粒功能障碍导致的基因组完整性丧失及其相关的DNA损伤信号传导与检查点反应是公认的驱动因素，其可……

以下实验的总体目标是通过体内和体外操作两种小鼠可诱导的mase基因敲入等位基因，用于组织退变与再生以及癌症研究。该目标通过将羟基他莫昔芬药片植入动物体内以在体内重新激活mase来实现。第二步是从动物中分离神经干细胞，随后用羟基他莫昔芬处理，以在体外重新激活mase。接下来，在培养的细胞以及福尔马林固定石蜡包埋的脑组织上进行端粒荧光原位杂交（C-鱼）检测，以评估mase的活性。结果显示，羟基他莫昔芬处理可显著重新激活mase活性，该活性既能缓解衰老表型，也能促进肿瘤形成，这基于组织病理学检查结果。该方法有助于回答衰老与癌症研究领域中的关键问题，例如：我们是否可以通过调控TH创伤活性来延缓衰老过程？或如何特异性靶向托马斯以治疗癌症？本实验操作将由本实验室的讲师Takashi Shingu博士和技术员April Un演示。首先，按照文字版实验方案中所述方法，获得Turt ER和lock stop locks turt等位基因；在注射前对所有手术器械进行灭菌处理，并按照文字版实验方案对小鼠实施麻醉。达到深度麻醉状态后，将麻醉小鼠从诱导室中取出，并使其头部保持在连接异氟烷麻醉装置的管路中。捏住小鼠的足垫以确认动物已深度麻醉。同时在两只眼睛上涂抹眼膏，以防止角膜干燥。用聚维酮碘溶液擦拭小鼠背部。接着，使用精密套管针在小鼠背部皮下植入一枚缓释型他莫昔芬颗粒。将沉淀物完全推至两个肩部之间的中线位置。使用伤口夹施加器封闭切口，并监测小鼠恢复情况。用于麻醉。取出一天龄小鼠脑组织，去除嗅球和小脑后保留四份脑组织。将四份脑组织置于一毫升冷培养基中，并于四摄氏度保存。确保在一小时内处理神经组织。称量组织重量，确保每次消化不超过400毫克的限制。将脑组织置于直径35毫米的培养皿盖上，使用解剖刀碾碎脑组织。用1毫升移液器吸头加入1毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）。然后用HBSS冲洗后，以300 × g在室温下离心两分钟，再用移液器将组织块转移回15毫升离心管中。小心吸除上清液后，加入1,950微升预热的酶溶液。每400毫克组织最多加入1份酶溶液，充分混匀。将样品置于15毫升离心管中，在37摄氏度下孵育15分钟。每5分钟通过倒置或振荡离心管混匀样品。然后通过将20微升溶液三与10微升溶液四混合，为每份组织样品配制30微升酶混合液二。然后，使用宽口火焰抛光的移液管，通过缓慢吹打10次，轻柔颠倒混匀样品，以机械方式解离组织，注意避免产生气泡。在37摄氏度下孵育10分钟，每隔3分钟颠倒一次离心管。接下来，将细胞悬液加入置于50毫升离心管上的70微米细胞筛中。通过细胞筛网加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后弃去细胞筛网，将细胞悬液在300 × g离心20分钟。离心结束后，置于室温，彻底吸除上清液。用干细胞培养基将细胞重悬至后续实验所需体积，以激活锁中的tele阵列，停止锁。Turt神经干细胞。用100微摩尔的羟基他莫昔芬处理细胞两天，以激活emase以及Turt er神经干细胞。将细胞置于含有100微摩尔羟基他莫昔芬的培养基中培养，以进行端粒FISH实验。首先，从培养的细胞中制备中期染色体，用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。用二甲苯脱蜡，然后依次通过乙醇系列（每步5分钟）进行再水化，最后在磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育5分钟。然后用甲醇与乙酸按3:1比例配制的固定液对切片进行后固定，处理1至2小时。将切片置于冷的梯度乙醇溶液中脱水，每级5分钟，随后在37摄氏度的1倍XPBS缓冲液中空气干燥并洗涤5分钟。接下来，在37摄氏度条件下，用4%甲醛溶液对染色体进行自然固定，处理2分钟。将切片按前述方法用冷乙醇系列脱水，干燥后，每个载玻片上滴加12至25微升肽核酸杂交混合液。用橡胶胶水密封盖玻片，将染色体标本和组织切片置于80摄氏度下4分钟。随后在湿盒中于室温或37摄氏度下杂交2至4小时。接下来，在室温下用洗涤缓冲液洗涤样品，每次15分钟，重复两次。然后在室温下用PBS加Tween洗涤5分钟，重复23次。最后，用DPI或远红荧光对玻片进行复染，以用于显微镜观察。当在端粒功能障碍的小鼠中短暂重新激活端粒酶时，多种器官（如大脑和睾丸）的退行性表型得以改善，从而可确定端粒酶重新激活对细胞的影响。体外培养的神经干细胞取自晚期第四代G4 LSL-TERT和G4 TERT ER小鼠。当在端粒功能障碍的神经干细胞中重新激活端粒酶时，其自我更新能力显著增强。体外神经发生也得到显著增强，以确定在端粒功能障碍背景下，mase再激活对肿瘤发生的影响。在前列腺肿瘤模型中，通过他莫昔芬处理实现mase再激活。内皮T细胞淋巴瘤模型。在两种模型中，该治疗均导致肿瘤发生显著增强。最后，在 FFPE 小鼠脑组织和中期染色体上进行了端粒 FISH 实验。在这些图像中，红色代表 DNA，绿色代表端粒染色，青色代表着丝粒染色。观看本视频后，您应能够充分理解如何在 mTOR ER 和停锁型 mTOR 动物及细胞系中激活创伤活性，并掌握如何利用这些模型研究癌症和衰老相关问题。

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在组织变性/再生和癌症的研究利用小鼠诱导端粒酶等位基因

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