Name: 隔膜的神经支配膈运动神经元的功能和形态评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解膈运动神经元对膈膜神经支配的功能与形态评估方法，采用复合肌肉动作电位记录和全膈膜免疫组织化学技术，适用于啮齿类脊髓损伤模型的呼吸功能研究。

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本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS，资助号 #1R01NS079702，授予 A.C.L.）以及托马斯·杰斐逊大学 SURP 项目（M.M.）提供支持。

实验操作已获托马斯杰斐逊大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU、86/609/EEC 和 87-848/EEC）、美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》以及神经科学学会关于动物在神经科学研究中使用的政策执行。
1. 复合肌肉动作电位（CMAPs）
<ol>
	<li>准备实验动物：
	<ol>
		<li>使用吸入麻醉剂（异氟烷），以1-2%浓度给予至起效，或通过注射给药（氯胺酮、赛拉嗪、乙酰丙嗪）进行麻醉。注射麻醉剂的剂量如下：氯胺酮95.0 mg/kg，赛拉嗪10.0 mg/kg，乙酰丙嗪0.075 mg/kg。 
		注意：在执行本CMAP记录方案时，我们成功使用了吸入和注射两种麻醉方法，无特定偏好。</li>
		<li>在手术开始前、手术过程中直至术后布托啡诺起效期间，必须维持动物适当的麻醉深度。通过短暂夹捏脚趾以确认无回缩反应，从而判断麻醉是否充分。此外，使用棉签测试角膜反射。在整个手术过程中，应确保心率和呼吸频率未升高，否则提示麻醉深度已变浅。</li>
		<li>在动物眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
		<li>术者应在手术开始前用消毒剂（洗必泰擦洗液）洗手。术者应穿戴无菌手套、口罩及无菌手术衣或洁净实验服。所有器械在手术前应清洗并高压灭菌。高压灭菌时，应在器械包内放置灭菌指示条，置于器械水平位置，以验证灭菌是否完成。术者应在手术开始前确认指示条整条变为黑色。同时，器械盒外部也应贴上灭菌指示胶带。若同一天需对多只动物进行手术，每次手术之间应对器械进行清洁，并使用玻璃珠灭菌器进行灭菌。如有必要，可通过将器械手柄端放入玻璃珠灭菌器中适当时间，用无菌止血钳取出，在无菌区域冷却后，再将器械功能端放入玻璃珠灭菌器中适当时间，从而实现器械两端的灭菌。</li>
		<li>动物麻醉后，将其置于手术板上，背侧朝下，腹部朝上，以便使用胶带将动物前肢固定于手术板上。</li>
		<li>从颅底开始向尾侧剃除腹部腹面毛发，并根据记录哪一侧半膈肌，确保中线两侧腹部区域均被剃净。在剃毛后的皮肤表面涂抹聚维酮碘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CMAP记录准备：
	<ol>
		<li>完成动物准备后，将接地电极皮下插入尾部（图1）。</li>
		<li>将参考电极皮下插入对侧下腹部区域。</li>
		<li>在自粘式条状或盘状记录电极的表面涂上导电凝胶（条状电极尺寸：0.5 × 3 cm），然后将表面电极横向置于单侧肋缘沿线。</li>
		<li>将刺激电极经皮插入气管外侧、锁骨上方，间距0.5 cm。将电极插入皮肤约1.0 cm深。用手固定电极，确保其位置在后续刺激过程中不发生移动。 
		注意：刺激电极插入部位应与皮肤呈90°角。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复合肌肉动作电位（CMAP）记录：
	<ol>
		<li>使用刺激器/放大器获取电生理记录，随后进行计算机辅助数据分析。</li>
		<li>单次拉刺激的刺激参数应为0.5毫秒、1.0 Hz的超最大脉冲。刺激幅度应在6.0至8.0 V之间（图2A）。 
		注意：在同一实验中，所有动物应使用相同幅度的刺激强度。目标是使用最小刺激幅度以最大化反应幅度。需注意，刺激瞬间出现的初始信号为刺激伪迹。此外，应确保获得的CMAP反应在刺激伪迹后具有稳定/平坦的基线，随后出现快速的CMAP反应。为获得此类反应，可能需要重新调整刺激和/或记录电极的位置。</li>
		<li>每次刺激间隔30秒，连续重复10次刺激以获得平均反应（图2B-C）。测量从基线到峰值的幅度（图2A）。在动物呼吸周期中膈神经/膈肌未激活的阶段进行膈神经刺激。可在同一只动物上重复该操作以记录对侧半膈肌。</li>
		<li>最后一次CMAP记录结束后，如需进行神经肌肉接头（NMJ）染色，则进行灌注。可在同一只动物上每周约一次（或按选定时间间隔）重复进行CMAP记录。</li>
		<li>在存活状态下完成CMAP记录后，将动物置于循环温水加热垫上恢复，并在恢复期间持续监测直至清醒且胸卧位稳定。动物未完全恢复前不得将其放回与其他动物同笼饲养。</li>
		<li>动物恢复至胸卧位后，前48小时内每12小时监测一次（之后每日一次）。若动物出现脱水迹象（皮肤松弛、精神萎靡），应给予液体治疗（乳酸林格液；皮下注射；每次1-2 ml，注射部位轮换；每日2次），直至术后体重和液体丢失趋于稳定。若动物无法触及金属栏杆式饲料盒，在急性术后阶段可根据需要在小碟中提供软化食物以促进进食。</li>
		<li>手术结束前以0.05 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺，之后在术后前24小时内每12小时注射一次（此后根据疼痛/应激表现决定是否继续使用），注射部位应轮换。若后续观察到疼痛或痛苦迹象，应再次给予布托啡诺治疗。疼痛/痛苦的迹象包括活动减少、发声、拒食或拒饮（脱水）、显著体重下降、保护性姿势、过度啃咬或抓挠切口部位。判断疼痛和痛苦的其他标准还包括对外界刺激无反应、短暂或无诱发声发、呼吸费力或异常、持续性红褐色鼻眼分泌物、明显竖毛现象。同时应监测动物卫生状况不良的迹象，提示其健康状态不佳。若动物在接受上述镇痛方案治疗72小时后仍持续表现出痛苦（依据上述疼痛/应激标准），应实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 膈肌神经肌肉接头（NMJ）分析
<ol>
	<li>动物解剖：
	<ol>
		<li>给予动物过量的注射麻醉剂（剂量为上述剂量的三倍：氯胺酮 285.0 mg/kg，赛拉嗪 30.0 mg/kg，乙酰丙嗪 0.225 mg/kg；腹腔注射）。在给予过量麻醉剂后，所有动物应采用第二种安乐死方法（开胸术）以确保死亡。应通过观察心脏和呼吸停止以及动物瞳孔固定且散大来确认死亡。</li>
		<li>使用手术刀或解剖剪沿腹中线从剑突向尾侧切开，进行剖腹手术。使用手术刀和镊子小心地将皮肤和结缔组织与下方的肌肉分离。</li>
		<li>在提起剑突的同时，使用解剖剪将整个膈肌完整移除，确保膈肌仍附着于周围骨骼。这一点非常重要，因为这可以防止膈肌肌肉受损，有助于成功完整地解剖整个膈肌，并有利于后续染色前的肌肉清理。 
		注意：此时如有需要，可对动物进行灌流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膈肌的清理与染色：
	<ol>
		<li>在玻璃培养皿（直径 100 mm）中，将完整解剖出的膈肌固定在硅橡胶上，腹侧朝上，置于含 4% 多聚甲醛（溶于 1% 磷酸盐缓冲液 PBS 中）的溶液中，使用体视显微镜在室温下固定 20 分钟。拉伸膈肌使其绷紧，并使用昆虫针将周围组织固定，避免直接刺入膈肌肌肉本身（图 3）。</li>
		<li>仅对肌肉腹侧表面，使用 #5 镊子和小剪刀小心清除结缔组织。 
		注意：本染色方案中所有后续步骤均需在室温下缓慢摇动进行，并避光处理，除非另有说明。确保膈肌肌肉始终完全浸没在液体中，防止干燥。</li>
		<li>染色前准备所有必要试剂：1× PBS、2% 牛血清白蛋白（BSA）/PBS、0.1 M 甘氨酸（溶于 2% BSA/PBS 中）、4% 多聚甲醛（PFA，溶于 1× PBS 中）以及 0.2% TBP（0.2% Triton X-100 溶于 2% BSA/PBS 中）。务必提前将甲醇预冷至 -20 °C。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在 0.1 M 甘氨酸（溶于 2% BSA/PBS 中）中孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 RBTX（罗丹明标记的 α-银环蛇毒素）溶液中孵育 15 分钟。RBTX 溶液配制如下：罗丹明标记的 α-银环蛇毒素以 1:400 比例稀释于 1× PBS 中。 
		注意：本方案中使用罗丹明，但也可选用其他任意荧光染料进行染色。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在 -20 °C 冰箱中，用甲醇（MeOH）孵育 5 分钟。 
		注意：将肌肉放入冰箱前不要加入甲醇，孵育结束后立即移除甲醇溶液。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在 0.2% TBP 中封闭 1 小时（0.2% Triton 溶于 2% BSA/PBS 中）。</li>
		<li>在 4 °C 下，于 0.2% TBP 溶液中加入一抗溶液，边摇动边孵育过夜。抗体稀释比例如下：SV2（1:10），SMI-312（1:1,000）。</li>
		<li>用 0.2% TBP 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>加入二抗溶液，使用 FGM1（FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG1，以 1:100 比例稀释于 0.2% TBP 中），边摇动边孵育 1 小时。 
		注意：从本步骤起，后续所有染色操作均需避光。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在封片前，再次清理肌肉腹侧（见上文）表面的周围结缔组织。 
		注意：建议在染色完成后立即进行清理和封片。但如有必要，样品可浸泡在 1× PBS 中，用 Parafilm 封口防止蒸发，并在 4 °C 下保存最多 1 周，期间需每日更换 PBS。</li>
		<li>将样品置于载玻片上，用非固化型 Vectashield 封片。用透明指甲油密封盖玻片边缘，防止干燥。长期保存时，将载玻片平放在纸板玻片盒中，置于 -20 °C 冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析与共聚焦成像：
	<ol>
		<li>使用正置落射荧光显微镜，在 20× 和 40× 放大倍数下对染色并封片的半膈肌进行形态学定量分析。 
		注意：由于膈肌以整体封片方式染色和分析，肌肉较厚。因此，若使用非共聚焦荧光显微镜拍摄静态图像，大部分荧光信号将完全失焦。因此，最佳方式是在显微镜上实时进行神经肌肉接头（NMJ）分析，以便持续在肌肉组织中上下调焦，准确识别每个 NMJ 的形态。通过该方法，可清晰追踪单个运动轴突在组织中的空间走向及其与突触后受体簇的空间关系。</li>
		<li>通过测量肌肉腹侧至背侧的长度，根据特定脊髓节段的拓扑支配模式，将肌肉分为三个独立区域进行分析（图 4H）。</li>
		<li>从肌肉腹侧区域开始向背侧移动，分析所有位于表面肌纤维上的正视 NMJ。不要分析表面以下第 3–4 层更深的肌纤维，因为抗体穿透性较差，可能导致结果难以解读（RBTX 因毒素分子较小，穿透深度远高于用于标记神经元的大分子抗体）。</li>
		<li>若神经元的终前端轴突直径较粗，且神经末梢所有区域均与下方肌肉的乙酰胆碱受体（AChRs）完全重叠，则将该 NMJ 判定为完整连接。</li>
		<li>若下方肌肉 AChRs 的任何区域未被对应的神经末梢占据，则将该 NMJ 判定为部分去神经支配。</li>
		<li>若肌肉 AChRs 完全无对应的神经末梢，则将该 NMJ 判定为完全去神经支配（同时需在同一视野中观察到其他带有标记神经元的 NMJ，以排除该区域抗体渗透不良所致的假象）。</li>
		<li>若单个 NMJ 由多于一条终前端轴突支配，则将该 NMJ 判定为多重支配（表明该接头处存在一定程度的去神经支配及可能的再支配尝试）。</li>
		<li>若 NMJ 的神经末梢与下方 AChRs 完全重叠，但终前端轴突较细，则将该 NMJ 判定为稀疏支配（这也提示存在一定程度的去神经支配及再支配尝试）。</li>
		<li>对每只动物的上述三种 NMJ 类型，在三个已定义区域中分别进行分析。将每只动物的数据与同实验组其他动物的结果取平均值。每个实验组应至少分析 3 只（理想为 5–6 只或更多）动物，大鼠半膈肌中约 200–300 个接头，小鼠半膈肌中约 150–200 个接头。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜获取用于发表的高分辨率共聚焦图像。</li>
		<li>以 0.3 μm 步长采集 20–40 μm 深度的 Z 轴层扫图像，并在每个接头上下额外采集光学切片，以确保包含完整的突触轮廓。</li>
		<li>使用图像采集软件将 Z 轴序列图像重建为最大强度投影图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
<li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li>
<li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoltz%2C+A+%22Spinal+Cord+Injury%22">Spinal Cord Injury</a>. , Oxford. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.alibris.com/
 ">http://www.alibris.com/
 </a> (2010).</li>
<li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li>
<li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration%2C+plasticity+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li>
<li>Gourévitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preB%C3%B6tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li>
<li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li>
<li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration%2C+diaphragm+compromise%2C+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li>
<li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li>
<li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li>
<li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

由于创伤性脊髓损伤（SCI）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）均会损害呼吸功能，因此开发针对呼吸功能、特别是膈肌神经支配的治疗方法在临床上具有重要意义5,6。为了全面研究呼吸功能，应采用综合性的研究方法。复合肌肉动作电位（CMAP）可通过体外刺激膈神经来评估膈肌的功能性神经支配程度，但无法反映内源性脑脊髓呼吸驱动8。此外，此类记录无法检测神经肌肉接头（NMJ）的形态学变化，尤其是单个运动轴突及突触后乙酰胆碱受体水平的变化。通过采用所述染色方案，可对膈肌单个神经肌肉接头处的相关形态学表型进行定量评估，例如完全失神经支配、部分失神经支配，甚至再生性出芽和重新神经支配9。
然而，这两种方案仍未能完全涵盖呼吸系统病理学的所有方面。例如，如果降行的延髓脊髓轴突受到损伤，而膈运动神经元池或膈神经本身未受损害，则由于膈神经接受了外部刺激，即使该神经回路存在显著功能障碍，复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅仍可能显示正常14。重要的是，CMAP 无法测量内源性脑干以上的呼吸驱动。此外，CMAP 也不能反映整体通气功能。...

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致残性的运动神经元疾病，与上下运动神经元的丧失以及随之而来的肌肉麻痹相关。患者在确诊后平均生存期仅为2至5年1。膈神经运动神经元（PhMN）的丧失是ALS发病机制中的关键环节。患者最终死于PhMN对膈肌——主要的吸气肌——支配的丧失2,3。创伤性脊髓损伤（SCI）也是一种严重的健康问题，常伴有呼吸困难。每年约有12,000例新的SCI病例发生4，其原因为脊髓受到创伤性损害。尽管SCI在损伤部位、类型和严重程度上存在异质性，但大多数病例涉及颈段脊髓损伤，常导致严重且持续的呼吸功能障碍。除ALS和SCI外，其他中枢神经系统（CNS）疾病也可能与膈肌呼吸功能障碍相关5,6。
膈神经是一种支配同侧半膈肌的传出运动神经，其神经元胞体位于同侧颈髓C3-C5节段的膈运动神经元（PhMN）区域。PhMN的输出活动受脑干中一个称为头端腹侧呼吸群（rVRG）区域的下行延髓脊髓输入调控。7rVRG-PhMN-膈肌环路在控制吸气呼吸及其他非通气性膈肌活动中起核心作用。该环路若受到各种创伤性损伤或神经退行性疾病的影响，可导致呼吸功能显著下降，严重影响患者生活质量。正常膈肌功能依赖于rVRG对PhMN的下行投射、PhMN的存活、膈神经的完整性以及膈肌神经肌肉接头（NMJ）处的正确神经支配。因此，采用能够对该环路进行定量评估的技术至关重要 体内 在肌萎缩侧索硬化症、脊髓损伤及其他中枢神经系统疾病的啮齿类动物模型中。
本方案旨在描述在电生理学和形态学水平上评估膈肌运动神经元（PhMN）支配情况的实验工具。通过刺激特定运动神经的所有传出运动神经元轴突，记录并分析靶向肌纤维产生的去极化反应，即可获得复合肌肉动作电位（CMAPs）。该技术可在麻醉的大鼠和小鼠中进行in vivo应用，用于量化PhMN对半侧膈肌的功能性支配8。由于CMAPs反映的是整个半侧膈肌全部（或至少是多数）肌纤维同步记录的总和反应，因此还需在膈肌神经肌肉接头（NMJ）处对单个运动轴突和肌纤维的表型进行观察，以追踪与疾病及治疗相关的形态学变化，例如部分或完全失神经支配、再生性出芽以及再神经支配等现象。这一目标可通过膈肌全层免疫组织化学（IHC）染色实现，随后对肌肉内各个NMJ进行详细的形态学评估9。结合CMAPs与NMJ分析，可为研究中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿动物模型中膈肌神经支配提供一种强有力的定量分析方法。

<table><tbody><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>T353-500</td><td>先用去离子蒸馏水配制10%溶液；再用1×PBS配制成4%溶液，并将pH调至7.4</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2%牛血清白蛋白（2% BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>将2 g BSA溶解于100 mL 1×PBS中</td></tr><tr><td>含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS（封闭缓冲液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100mL</td><td>将0.2 mL Triton X-100加入100 mL 2% BSA/PBS中溶解</td></tr><tr><td>0.1 M 甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>将0.185 g甘氨酸加入25 mL 2% BSA/PBS中</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-bungarotoxin</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>使用浓度1:400</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoclonals</td><td>SMI312</td><td>使用浓度1:1,000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>SV2-Supernatant</td><td>使用浓度1:10</td></tr><tr><td>FITC标记的山羊抗小鼠IgG1</td><td>Roche</td><td>3117731001</td><td>使用浓度1:100</td></tr><tr><td>硅橡胶</td><td>Sylgard, Dow Corning</td><td>Part # 184</td><td>按照试剂盒说明书操作：可根据需要使用不同尺寸的培养皿（30 mm、60 mm、100 mm）</td></tr><tr><td>Vectashield荧光封片剂</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td>此封片剂不会固化，需用透明指甲油固定盖玻片</td></tr><tr><td>小型弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>CMAP记录软件</td><td>Scope 3.5.6; ADI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盘状表面电极</td><td>Natus neurology</td><td>019-409000</td><td></td></tr><tr><td>皮下针电极</td><td>Natus neurology</td><td>019-453100</td><td></td></tr><tr><td>导电凝胶</td><td>Aquasonic</td><td>122-73720</td><td></td></tr><tr><td>CMAP记录用刺激/记录系统</td><td>ADI Powerlab 8SP stimulator</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMAP记录用放大器</td><td>BioAMP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

膈神经运动神经元对膈肌支配的功能与形态学评估

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

本方案重点介绍在电生理学和形态学水平上评估膈神经运动神经元（PhMN）对膈肌支配的工具。通过刺激膈神经后记录复合肌肉动作电位（CMAP），可对颈段脊髓PhMN的功能性膈肌支配进行定量评估。 体内 在麻醉的大鼠和小鼠中。由于复合肌肉动作电位（CMAP）代表了对整个半侧膈肌所有肌纤维同步活动的记录，因此进一步在膈肌神经肌肉接头（NMJ）水平上检测单个运动轴突和肌纤维的表型，对于追踪与疾病及治疗相关的形态学变化（如部分或完全失神经支配、再生性出芽及再神经支配）具有重要意义。该目标可通过膈肌全层组织免疫组织化学（IHC）染色，随后对肌肉内各个神经肌肉接头进行详细的形态学评估来实现。将CMAP记录与NMJ分析相结合，为在中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿类动物模型中定量研究膈肌神经支配提供了强有力的方法。

成年Sprague-Dawley大鼠接受仅椎板切除术（未损伤对照组）或在C4脊髓节段进行单侧半挫伤性脊髓损伤（SCI）10-12。术后5周时，与仅行椎板切除术的对照组大鼠（图2B）相比，SCI大鼠同侧半膈肌记录到的复合肌肉动作电位（CMAP）峰值振幅显著降低（图2C）。在对照组无疾病的野生型大鼠中，半膈肌的所有神经肌肉接头（NMJ）均完全完整（图4A,C）。相反，SOD1G93A大鼠（一种肌萎缩侧索硬化症ALS的啮齿类动物模型）在半膈肌神经肌肉接头处表现出显著的病理改变（图4B），包括完全失神经支配（图4G，箭头）、部分失神经支配（图4E，箭头；图4G，右侧NMJ）、多重神经支配（图4D）以及纤细的神经末梢前轴突（图4F，箭头）。
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复合肌肉动作电位记录可定量评估膈肌的膈神经运动神经元功能支配情况。全层膈肌免疫组织化学染色可用于评估单个神经肌肉接头处的形态学支配状况。本方案旨在展示这两种强大方法如何应用于多种脊髓疾病啮齿类动物模型中。

本方案重点介绍在电生理学和...水平上评估膈神经运动神经元（PhMN）对膈肌支配的工具。

本实验的总体目标是定量评估颈段脊髓膈神经运动神经元对膈肌的功能性和形态学支配情况。通过在麻醉动物中对同侧膈神经进行超强刺激，记录半侧膈肌的复合肌肉动作电位，从而实现功能性评估。下一步是进行膈肌全层铺片免疫组织化学染色，以在形态学上评估单个神经肌肉接头的支配状况。最终，结合复合肌肉动作电位与神经肌肉接头分析，为在中枢神经系统和周围神经系统疾病的啮齿类动物模型中定量研究膈肌神经支配提供了一种强有力的方法。该方法有助于回答脊髓损伤领域的一些关键问题，例如：是否可以利用治疗性干预成功恢复膈肌功能？该技术的应用前景可延伸至创伤性脊髓损伤和先天性中枢性低通气综合征（ILS）等疾病的治疗，因为在这些致残性疾病中，膈肌呼吸功能对患者的预后起着关键作用。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Kali博士、Wright博士实验室的本科生Melanie Martin以及我实验室的研究技术员Tamara Holla进行演示。麻醉动物后，将其置于手术板上，背侧朝下，并将前肢固定在板上。然后从颅底开始，沿中线两侧向腹部方向剃除腹侧表面的毛发。皮肤清洁后，放置电极，将接地电极连接至尾部，并将参考电极皮下插入对侧下腹部。应在记录电极的自粘部分涂抹导电凝胶，然后将其沿单侧肋缘贴附。现在将刺激电极置于气管外侧、锁骨上方的皮肤表面，两电极经皮相距约半厘米。电极应垂直于皮肤插入，深度约为一厘米。这些电极必须牢固固定，最好手动完成。将所有电极连接至相应的刺激器和放大器。采集的数据必须记录到计算机中。用于分析时，将单极刺激的刺激参数设置为0.5毫秒、1赫兹的超强脉冲，电压幅度范围为6至8伏。设定刺激观察时间为30秒，并对每次动物实验中连续10次刺激的反应进行平均，记录基线到峰值的幅度，可根据需要每周进行约一次。动物操作的详细步骤见文本方案。使用过量注射麻醉剂处死动物后，用手术刀或剪刀进行剖腹手术。从剑突沿中线向下作切口。然后使用解剖刀和镊子，小心地将皮肤和结缔组织从肌肉组织上分离。通过提起剑突并从周围骨骼中剪除膈肌，以移除膈肌。注意不要损伤膈肌肌肉。在体视显微镜下，将膈肌正面朝上转移至盛有含4%多聚甲醛PBS溶液的硅胶衬里培养皿中。用大头针固定膈肌周围的组织，将膈肌拉紧。然后使用镊子和剪刀去除膈肌上表面的结缔组织。固定液作用20分钟后，用PBS清洗3次，每次10分钟，去除固定液。接着加入含0.1摩尔甘氨酸和2% BSA的PBS溶液，室温孵育30分钟。然后将膈肌置于含rod Domine偶联alpha bungalow toin溶液中，孵育15分钟。用 PBS 洗去固定剂处理时产生的巴豆毒素。接着，将组织转移至预冷的甲醇中，并在 -20 °C 条件下冰浴 5 分钟。5 分钟后立即移除甲醇，并如前所述用 PBS 再次洗涤组织。现在，使用0.2% TBP溶液封闭一小时。随后更换为含0.2% TBP的初级抗体溶液，于4°C条件下轻轻振荡孵育过夜。次日，用0.2% TBP溶液洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的初级抗体，然后在避光条件下，将组织置于二抗溶液中振荡孵育一小时；之后用PBS溶液洗涤三次，以去除未结合的二抗，并始终保持组织处于避光状态。然后在体视显微镜下，去除肌肉上表面更多的结缔组织。清理完毕后，将组织置于正置荧光显微镜下进行封片和成像，并对染色的半侧膈肌形态进行定量分析。使用 20 倍和 40 倍放大倍数，因为膈肌是以整体组织片的形式进行分析的。大多数荧光染色图像失焦。使用普通显微镜时，最好实时进行分析。为了准确评估单个神经肌肉接头的形态，根据脊髓的拓扑神经支配模式，将肌肉分为三个部分进行分析。从最腹侧区域开始，沿肌纤维分析所有可见的神经肌肉接头（NMJ），但不要分析表面以下超过前三到四层肌纤维的结构，因为抗体的渗透从未完全充分。一个完整的神经肌肉接头具有较粗的轴突前终末，且神经末梢的所有区域均与下方肌细胞的乙酰胆碱受体完全重叠。部分去神经支配的神经肌肉接头则会存在部分下方乙酰胆碱受体未被占据的区域。完全去神经支配的神经肌肉接头（NMJ）将不显示与神经末梢处乙酰胆碱受体的对应关系。该区域内的其他神经肌肉接头应呈现另一种形态，或若多个终前轴突支配同一神经肌肉接头，则抗体的渗透效果将存疑。该神经肌肉接头为多重支配。在此病例中，可能发生了神经支配后的去神经化，随后又出现再神经支配。如果神经末梢与下方的乙酰胆碱受体存在重叠，且轴突末端前段非常细薄，则表明神经肌肉接头处神经支配稀疏。这同样也是再神经支配的迹象。在一项涉及成年Spra Dolly大鼠的实验中，对照组接受了椎板切除术，而其他大鼠则接受了单侧半横断性脊髓损伤（SCI）。在C4.5周后，记录了与椎板切除术或损伤部位同侧的半膈肌的峰值CMAP振幅。与仅进行椎板切除术的对照组大鼠相比，在另一项涉及表达突变型人源SOD1蛋白的大鼠实验中，脊髓损伤（SCI）大鼠的该指标显著降低，该模型用于模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在野生型对照动物中，半膈肌的神经肌肉接头（NMJ）形态完全完整。然而，在转基因大鼠中，NMJ表现出显著的病理变化，部分接头出现完全失神经支配，如箭头所示。其他神经肌肉接头部分去神经支配，如箭头所示；从右侧的神经肌肉接头可见，部分接头存在多重神经支配，而另一些则具有较细的终末前轴突，此处以箭头标记。观看本视频后，您应能够充分理解如何对膈肌由膈神经运动神经元所介导的功能性及形态学神经支配进行定量评估。感谢观看，祝您所有实验顺利成功。

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