膈神经运动神经元对膈肌支配的功能与形态学评估

本实验的总体目标是定量评估颈段脊髓膈神经运动神经元对膈肌的功能性和形态学支配情况。通过在麻醉动物中对同侧膈神经进行超强刺激，记录半侧膈肌的复合肌肉动作电位，从而实现功能性评估。下一步是进行膈肌全层铺片免疫组织化学染色，以形态学方法评估单个神经肌肉接头的支配状况。

最终，结合复合肌肉动作电位与神经肌肉接头分析，为在中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿类动物模型中定量研究膈肌神经支配提供了一种强有力的方法。该方法有助于回答脊髓损伤领域中的关键问题，例如：治疗性干预是否可用于成功恢复膈肌功能？该技术的意义延伸至创伤性脊髓损伤和先天性中枢性低通气综合征（ILS）等疾病的治疗，因为在这些致残性疾病中，膈肌呼吸功能在患者预后中起着关键作用。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Dr.Kali、Dr.Wright 实验室的本科生 Melanie Martin 以及本实验室的研究技术员 Tamara Holla 演示。

麻醉动物后，将其置于手术板上，背侧朝下，并将前肢固定在板上。然后沿中线两侧，从颅底向腹部方向剃除腹侧表面的毛发。皮肤清洁后，放置电极，将接地电极连接至尾部，并将参考电极皮下植入对侧下腹部。

应在记录电极的自粘部分涂抹导电凝胶，然后将其沿单侧肋缘贴附。现在将刺激电极置于气管外侧、锁骨上方的皮肤表面，两电极间距约半厘米。电极应垂直于皮肤插入，深度约为一厘米。

这些电极必须牢固固定，最好手动完成。将所有电极连接至相应的刺激器和放大器。采集的数据必须记录到计算机中。

用于分析时，将单极刺激的刺激参数设置为0.5毫秒、1赫兹的超强刺激脉冲，电压幅度范围为6至8伏。设定刺激时间为30秒，并对连续10次刺激的反应进行平均，每次记录采用基线到峰值的幅度，可根据需要每周每只动物记录一次。

动物操作详见文本方案。使用过量注射麻醉剂处死动物后，使用手术刀或剪刀进行剖腹手术。从剑突开始沿中线向下作切口。

然后使用手术刀和镊子，小心地将皮肤和结缔组织从肌肉组织上分离。提起剑突，将膈肌从周围骨骼中剪下，从而移除膈肌。注意不要损伤膈肌肌肉。

在体视显微镜下，将膈肌向上的一面转移至盛有含4%多聚甲醛PBS溶液的硅胶包被培养皿中。用镊子固定膈肌周围的组织，使膈肌绷紧。然后使用镊子和剪刀去除膈肌上表面的结缔组织。

固定液作用20分钟后，用PBS清洗三次，每次10分钟，去除固定液。接着，加入含2% BSA的0.1摩尔甘氨酸PBS溶液，作用30分钟。然后将膈肌置于含rod Domine偶联alpha bungalow toin溶液中孵育15分钟。

用 PBS 洗去组织上的巴豆毒素，步骤与去除固定剂相同。接着，将溶液更换为冷甲醇，并在 -20 °C 条件下冰浴组织 5 分钟。5 分钟后立即移除甲醇，并用 PBS 如前所述清洗组织。

现在，使用0.2% TBP溶液封闭一小时。随后更换为含0.2% TBP的初级抗体溶液，将组织在4°C条件下轻轻振荡孵育过夜。第二天，用0.2% TBP溶液洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的初级抗体，然后将组织在避光条件下于二抗溶液中振荡孵育一小时；之后用PBS溶液洗涤三次，以去除未结合的二抗，并将组织保持在避光环境中。

然后在体视显微镜下，去除肌肉上表面更多的结缔组织。清理完毕后，将组织置于正置式落射荧光显微镜下进行成像，并对染色的半侧膈肌形态进行定量分析。由于膈肌是以整体装片方式进行分析，因此使用 20 倍和 40 倍放大倍数。

大多数荧光染色处于失焦状态。使用普通显微镜时，最好实时进行分析。为了准确评估单个神经肌肉接头的形态，应根据脊髓的拓扑神经支配模式，将肌肉分为三个部分进行分析。

从最腹侧区域开始，沿肌纤维分析所有可见的神经肌肉接头（NMJ），但不要分析表面以下超过前三到四层肌纤维的结构，因为抗体的渗透从未完全穿透更深区域。完整的神经肌肉接头具有较粗的轴突前终末，且神经终末的所有区域均与下方肌细胞的乙酰胆碱受体完全重叠。部分去神经支配的神经肌肉接头则会存在部分下方乙酰胆碱受体未被占据的区域。

完全去神经支配的神经肌肉接头（NMJ）将不显示与神经末梢处的乙酰胆碱受体之间的对应关系。该区域内的其他神经肌肉接头应呈现另一种形态，或若多个神经末梢前轴突支配同一个神经肌肉接头，则抗体的穿透效果将受到质疑。该神经肌肉接头为多重支配。

在此病例中可能发生了神经支配后的去神经化，随后出现再神经支配。如果神经末梢与下方的乙酰胆碱受体存在重叠，且终末前轴突非常纤细，则表明神经肌肉接头（NMJ）处于稀疏神经支配状态。这也是再神经支配的一个指征。

在一项涉及成年Spra Dolly大鼠的实验中，对照组接受了椎板切除术，而其他大鼠则接受了单侧半横断性脊髓损伤（SCI）。在C4.5周后，记录了与椎板切除术或损伤部位同侧的半膈肌的峰值CMAP波幅。

与仅进行椎板切除术的对照组大鼠相比，在另一项涉及表达突变型人源 SOD1 蛋白的大鼠实验中，脊髓损伤大鼠的该指标显著降低，该模型用于模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在野生型对照动物中，半膈肌的神经肌肉接头（NMJ）形态完全正常。然而，在转基因大鼠中，神经肌肉接头显示出明显的病理变化，部分接头出现完全失神经支配，以箭头标示。

其他神经肌肉接头部分失神经支配，如箭头所示；从右侧的神经肌肉接头可见，部分神经肌肉接头存在多重神经支配，而另一些则具有较细的终末前轴突，此处以箭头标记。观看本视频后，您应能够充分理解如何对膈肌由膈神经运动神经元所介导的功能性及形态学神经支配进行定量评估。感谢观看，祝您的各项实验顺利成功。