利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

以下实验的总体目标是追踪白细胞在进展性肝炎性疾病中的迁移和相互作用过程，以更深入地理解这些细胞被募集到肝组织中的事件序列及其在免疫病理过程中的潜在作用。该目标首先通过实施气管切开术来实现，以控制小鼠的呼吸，这是确保动物长期存活的关键步骤。

第二步，对小鼠进行开腹手术，外科暴露肝脏，以便通过多光子显微镜接触该器官。接着，通过将肝脏嵌入琼脂糖中进行固定和定位，以最大限度减少运动伪影。成像可连续进行数小时，获得高分辨率的时间序列图像，用于追踪单个白细胞募集、定位及相互作用的动态变化。

在肝脏炎症的发展过程中，该方法有助于回答急性和慢性肝脏炎症领域的关键问题，例如白细胞募集、细胞间相互作用或免疫病理学机制。与传统显微镜技术相比，该技术的主要优势在于多焦点显微镜能够实现长期成像，几乎不对样品造成干扰，同时具有极低的荧光漂白和光毒性，并可获得深达100微米的光学切片，这得益于远红激光光源独特的激光物理特性。该方法可为肝脏疾病的研究提供深入见解。

该方法可轻松应用于其他系统。由于其组织稳定与固定技术，几乎适用于所有活体显微成像相关的问题，因此能够便捷地对脾脏、肾脏甚至皮下肿瘤等器官进行成像，尤其结合使用相关流动细胞时。此外，还可用于可视化所有白细胞亚群，并观察它们在肝脏炎症中的相互作用。

通常，初次接触该方法的研究人员会因小型动物手术的极端复杂性而遇到困难。然而，根据我们的经验，这一限制因素仅持续数周，只需通过一定量的实践操作即可克服。由于肝组织较为脆弱，制备步骤难以掌握，因此该方法的直观演示至关重要。在设置麻醉系统后，将3%的异氟烷以40度角倾倒入小鼠麻醉舱中。

然后确保手术工作区域以及所有所需器械等均已彻底消毒。接着，通过腹腔注射麻醉剂混合物对小鼠进行麻醉。5分钟后，检查动物的反射情况，然后对皮肤进行消毒，并将眼用软膏涂抹于眼睛上。

现在，将小鼠固定在解剖台上。使用胶带将其固定，轻轻拉伸颈部，使腹侧朝上暴露。可通过将橡皮筋钩住门齿来实现此操作。

现在，在下颌下方做一个长约0.5至1厘米的初始切口。然后仔细分离唾液腺之间的结缔组织，找到环绕气管的肌肉管。轻轻撕开肌肉以暴露气管。

在气管下方穿线，然后用显微剪刀在气管上做T形切口，切开气管。将通气管插入约半厘米。使用小型解剖镊子推进导管。

然后用缝线固定套管。为进一步确保稳固，将套管缝合至皮肤，并使用氰基丙烯酸酯封闭皮肤切口，再将套管固定在动物头部。使用胶带固定，并通过持续输送2%异氟烷维持麻醉状态。

在为小鼠做好手术准备后，在胸骨下方做一个小的皮肤切口，并向两侧沿肋骨下方延伸切口。在此过程中，烧灼所有暴露的血管。为减少出血，可在腹直肌处先做一个小的初始切口，以进入腹腔。

横向延长切口，结扎所有血管，并暴露肝脏。现在将小鼠转移至操作台，在动物两侧叠放载玻片以帮助固定其位置。这些载玻片的堆叠高度应与小鼠身体高度相匹配，以便后续放置肝脏时不会对腹部施加过大压力。

现在，利用胸骨处的缝线牵开肋骨。使用4-0缝线即可。牵开肋骨后，切断肝脏与膈肌之间的韧带，一直切至主动脉，但需格外小心，避免刺破或切断血管。同时切断连接肝脏与胃肠道的韧带。

将小鼠旋转45度，以更好地接触较大的肝叶。取一片标准盖玻片，用胶带沿其边缘固定，使其边缘不锋利。将其覆盖在腹腔上。

这将作为放置肝脏的平台。小心地将双球探针或带有缓冲垫的刮勺插入肝脏下方，并托住器官的顶部。使用湿润的组织会因机械压力而立即损伤肝组织，因此必须小心操作该器官。

然后将叶瓣转移到载玻片上，并轻轻拉拽使其就位。叶瓣通常会弯曲或轻微折叠，可尝试用薄的刮刀或湿润的拭子轻轻提起组织边缘，将其展开。接下来，用盖玻片或载玻片作为侧向支撑物进行固定。

将盖玻片堆叠至与肝叶相同高度。肝脏的定位和固定是本方案中最关键的步骤。任何机械应力、扭转或压力都会导致组织立即受损，或至少引起窦状血管内血流障碍。

现在，将一个边缘用胶带固定的大型盖玻片覆盖在由侧向支撑物托起的肝叶上。应尽可能使盖玻片保持水平，避免对肝脏造成挤压。

白色组织表明血流受损，除非成像过程非常迅速。现在需要插入两根独立的腹腔导管，以提供长期麻醉并施用G五。导管由27号针头和柔性硅胶管组装而成。

然后使用注射泵启动其流速。将导管插入后肢附近的下腹部。将生命体征监测仪连接至小鼠后，用一份 XPBS 配制 100 毫升 3% aros 溶液。

当琼脂糖冷却至41摄氏度时，使用带有18号针头的5毫升注射器将肝脏包埋其中。待琼脂糖冷却后，用海德曼刮匙去除多余的琼脂糖，暴露出足够大的视野以进行肝脏扫描。随后开始扫描。

视野准备完成后，将小鼠移至显微镜下，选择合适区域进行延时成像扫描。通过外部白光源目视扫描肝脏组织，识别血流充足且对样本干扰最小的代表性视野。本实验对 CXCR6 GFP 杂合小鼠进行了活体 TPLSM 成像，其中部分小鼠通过腹腔注射四氯化碳以诱导急性肝损伤。

通过视频追踪表达GFP的模式细胞，并将它们的运动轨迹叠加，以获得细胞运动能力的快照。随后对轨迹进行归一化处理。正常肝脏中的细胞呈现随机迁移模式。

注射CCI四的肝脏显示出细胞迁移能力受损。通过测量细胞从起源位置的总位移，可以明显看出，在CCI四处理后36小时，肝细胞损伤部位出现了细胞滞留现象。肝脏损伤导致的迁移能力受损还可通过绘制单个细胞随时间推移的迁移速度来显示，表明在18小时后出现部分迁移停滞，36小时后则完全停止迁移。

当将细胞作为群体进行比较时，迁移细胞速度的降低也显示出具有统计学显著性。因此，该方法适用于追踪肝脏疾病发展过程中细胞迁移和定位的变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何为小鼠肝脏活体多光子显微镜检查准备样本。

本文所提供的方法可实现动物的长期存活稳定，并通过温和的固定方法最大限度地减少运动伪影。一旦掌握技巧，若操作得当，该技术可在约一小时内完成。在该操作过程中，控制动物的生命体征至关重要，包括维持稳定的体温、心率、氧气和二氧化碳水平。通过调节麻醉深度和呼吸状态，可实现上述生理参数的控制。

还可以进行其他实验操作，例如流式细胞术分析或激光显微切割，以回答更多问题，如浸润性免疫细胞的表型特征，或组织及浸润细胞分泌的介质。该技术使研究人员能够深入了解肝脏中白细胞迁移动态及细胞间相互作用，从而解析导致炎症性肝病发生发展的事件序列。使用高能脉冲红外激光进行多光子显微成像时，请务必遵守激光安全操作指南。

进行本实验时，确保激光辐射的反射不会对眼睛和皮肤造成危害。