免疫细胞健康和疾病肝脏使用CXCR6.Gfp记者小鼠长期活体多光子显微镜成像
2015年3月24日
肝脏免疫细胞的稳定活体高分辨率成像具有挑战性。在这里，我们提供了一种高度灵敏和可靠的方法，通过活体多光子激光扫描显微镜结合重症监护监测来研究免疫细胞在小鼠肝脏中长时间（约 6 小时）的迁移和细胞-细胞-相互作用。
以下实验的总体目标是跟踪白细胞在肝炎性疾病进展中的迁移和相互作用。更好地了解这些细胞如何被募集到肝组织中的事件顺序以及它们可能参与免疫病理学。这是通过首先进行气管切开术来控制小鼠的呼吸来实现的，这是确保动物长期生存的关键步骤。
作为第二步，小鼠进行剖腹手术，通过手术暴露肝脏，从而使用多光子显微镜进入器官。接下来，通过将肝脏嵌入 arose 来固定和定位肝脏，以最大限度地减少运动伪影。成像可以在几个小时内进行，从而获得高分辨率的延时序列，这些序列跟踪单个白细胞的募集、定位和相互作用的变化。
在发生肝脏炎症的过程中，该方法可以帮助回答急性和慢性肝脏炎症领域的关键问题，例如白细胞募集、细胞相互作用或免疫病理学机制。与传统显微镜相比，该技术的主要优点是，多焦点显微镜允许长期成像，几乎没有样品扰动，马驹漂白或光毒性低，以及光学切片深入组织 100 微米，这是由于远红激光激光的独特物理特性。嗯，这种方法可以提供对肝病的见解。
它可以很容易地被其他系统采用。由于采用稳定和固定的方法，该组织几乎可以应用于活体显微镜检查的所有问题，因此它可以很容易地对脾脏、肾脏甚至皮下肿瘤等器官进行成像，使用流畅的相关细胞。还可以可视化所有白细胞亚群并发送它们的相互作用和肝脏炎症。
一般来说，由于小动物手术的极端复杂性，刚接触这种方法的人会很挣扎。然而，由于我们自己的经验，这只是几周的限制因素，只需要一些动手的日常作由于肝组织的脆弱性，准备步骤很难学习，该方法的视觉演示是必不可少的。设置麻醉剂后，用 3%aros 填充小鼠 aro 阶段，以 40 度角倒入。
然后确保手术工作区域已完全消毒，所有必需的器械等也已完全消毒。然后通过腹膜内注射麻醉剂混合物麻醉小鼠。五分钟后，检查动物的反射，然后对皮肤进行消毒，并在眼睛上涂抹眼药膏。
现在，将鼠标固定在准备台上。使用胶带将其定位，露出轻轻伸展颈部的腹侧。钩在门牙上的橡皮筋可以做到这一点。
现在，在下巴下方进行约 0.5 至 1 厘米长的初始切口。然后仔细解剖唾液腺之间的结缔组织，找到气管周围的肌肉管。轻轻撕开肌肉以露出气管。
在气管下方拉一根线，然后用微型剪刀在切口处划出 T 形切口打开气管。将通气管插入约半厘米。使用小解剖镊子推进管子。
然后用缝合线固定管子。然后，为了增加安全性，将管子缝合到皮肤上，用氰基丙烯酸酯密封皮肤上的切口，并将管子固定在动物的头部。使用胶带，使用 2% 异氟的连续流动保持麻醉。
为小鼠准备手术后，在胸骨下方做一个小的皮肤切口，并将切口横向延伸到两侧肋骨下方。在此过程中烧灼所有暴露的血管。为了尽量减少出血，请在线性肘部进行一个小的初始切口，以进入腹腔。
水平延伸切口，密封所有血管并进入肝脏。现在，将鼠标转移到农业阶段，并将载玻片堆放在动物的两侧，以帮助将其固定到位。这些堆栈应与鼠标的高度相匹配，以便稍后放置的肝脏载物台不会对腹部施加过大的压力。
现在，在胸骨中使用缝合线，缩回肋骨。四次零缝合就足够了 缩回肋骨后，切断连接肝脏和横膈膜的韧带，一直切到主动脉，但要格外小心，不要破裂或割伤血管。还要切断连接肝脏和胃肠道的韧带。
将鼠标旋转 45 度以改善对较大肝叶的进入。取一个标准的盖玻片，沿着它的边缘用胶带粘住，这样它就不会尖锐。将其放在腹腔上。
这将作为肝脏将肝脏定位到载物台上的舞台。小心地将双球形触针探头或带衬垫的刮刀滑到肝脏下方，并握住器官的顶部。使用湿组织机械压力会立即损伤肝组织，因此必须小心处理器官。
然后将凸轮抬到载玻片上，轻轻拉动它并使其就位。肺叶通常以弯曲或轻轻折叠结束，尝试用薄抹刀或湿纸巾提起组织来展开边缘。接下来，以盖玻片或滑轨的形式添加侧向支撑。
将盖玻片堆叠成与肝叶相同的高度。肝脏的分期和固定是方案中最关键的步骤。任何机械应力、扭转或压力都会导致组织立即损伤或至少受损窦状血管中的血流。
现在，在由外侧支撑支撑的肝叶上放一个带有胶带边缘的大盖玻片。将此盖玻片尽可能水平放置。它不应该挤压肝脏。
白色组织表明血流受损，除非成像进展迅速。现在有必要插入两个独立的腹膜内导管以提供长期麻醉并应用 G 5。它们由 27 号针头和柔性硅胶管组装而成。
然后使用注射泵开始流动。将导管插入后肢附近的下腹部。将重要监视器连接到鼠标后，在一个 XPBS 中准备 100 毫升 3%aros。
当 aros 冷却到 41 摄氏度时，使用带有 18 号针头的 5 毫升注射器将肝脏嵌入其中。一旦空气泵冷却，使用 heideman 刮刀去除多余的部分，并露出足够大的视野以扫描肝脏。然后继续扫描。
准备好视野后，将鼠标移动到显微镜下，为延时成像选择合适的扫描区域。使用外部白光源通过眼睛扫描肝组织，识别具有足够血流和最小样本扰动的代表性区域 CXCR 作为实验，对 6 只 GFP 杂合子小鼠进行活体 T-P-L-S-M 成像。一些患者接受腹膜内注射四氯化物以诱导急性肝损伤。
通过视频跟踪表达 GFP 的模态细胞，并将其轨迹叠加以获得细胞移动性的快照。然后对轨道进行标准化。正常肝脏的细胞具有随机迁移模式。
注射 CCI four 的肝脏显示细胞迁移受损。测量从其来源的总位移，很明显，在 CCI 4 处理后 36 小时，肝细胞损伤部位存在细胞捕获。也可以通过绘制单个细胞随时间推移的迁移速度来显示肝损伤导致的迁移受损，显示 18 小时后部分停滞和 36 小时后完全迁移停滞。
当将细胞作为群体进行比较时，迁移细胞速度的降低也可以显示具有统计学意义。因此，这种方法适用于跟踪发展中肝病中细胞迁移和定位的变化。观看此视频后，您应该对如何为活体内多照片显微镜检查准备小鼠肝脏有很好的了解。
我们在这里提供的方法使我们能够稳定动物以实现长期生存，并且由于我们提供的温和固定方法，可以最大限度地减少运动伪影。戴上口罩后，如果作得当，这项技术可以在大约一小时内完成 在此过程中，控制动物的重要参数稳定温度、心率、氧气和 CO2 水平非常重要。这可以通过调整坏死的深度和呼吸来实现 遵循这种技术。
可以执行其他程序，如流式细胞术分析或激光捕获显微解剖，以回答其他问题，例如浸润免疫细胞或组织分泌的介质的表型或浸润细胞发育后。这项技术使研究人员能够深入了解肝脏中白细胞运输和细胞相互作用的动力学，从而能够剖析导致炎症性肝病的事件序列。请遵循激光安全指南，使用用于多照片显微镜检查的高能脉冲红外激光器进行成像。
确保在进行此实验时，激光辐射的反射不会对您的眼睛和皮肤造成伤害。
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概述
本研究提出了一种稳定的活体肝脏免疫细胞高分辨率成像方法，使得可以长时间观察它们的迁移和相互作用。利用活体多光子激光扫描显微镜技术，这种方法允许在小鼠肝脏炎症疾病模型中详细监测白细胞的行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 活体成像
背景
- 理解肝脏炎症中的免疫细胞动态对于了解免疫病理学至关重要。
- 长期成像技术对于捕捉白细胞的行为是必要的。
- 先前的方法在长时间观察期内缺乏灵敏度和可靠性。
- 本研究通过一种新的成像方法应对这些挑战。
研究目的
- 研究肝脏中白细胞的迁移和相互作用。
- 阐明肝脏炎症期间免疫细胞的募集机制。
- 提供一种可靠的长期免疫反应成像方法。
使用的方法
- 为小鼠进行气管切开术以控制呼吸。
- 开腹以暴露肝脏以进行成像。
- 将肝脏嵌入介质中以减少运动伪影。
- 利用活体多光子激光扫描显微镜进行高分辨率成像。
主要结果
- 成功进行白细胞迁移和相互作用的长期成像。
- 高分辨率的时间序列捕捉了白细胞行为的变化。
- 关于肝脏炎症中免疫细胞募集动态的洞察。
- 证明了该方法在研究免疫反应中的可行性。
结论
- 开发的方法为研究免疫细胞动态提供了一个强大的工具。
- 它增强了我们对白细胞在肝脏疾病中的作用的理解。
- 这种方法可以应用于其他炎症和免疫反应模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Long-term intravital imaging of immune cell dynamics in the liver enables mechanistic de-risking of inflammatory liver disease targets by visualizing leukocyte recruitment, positioning, and interactions in real time. This approach supports target validation by linking CXCR6-expressing immune cell behavior to disease progression in preclinical models, improving predictive confidence in therapeutic hypotheses. The method provides a disease-relevant system for assessing immunomodulatory compounds under physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking CXCR6.gfp+ immune cell migration and positioning in healthy and diseased liver.
- Operational Value: Provides functional validation of leukocyte subsets involved in immunopathology through direct observation of cell-cell interactions.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by visualizing impaired migration and cell trapping in CCl4-induced liver injury models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements such as migration speed, total displacement, and interaction frequency for compound screening.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-resolution time-lapse data with minimal phototoxicity over 6-hour imaging windows.
- Operational Value: Enables standardized preparation and fixation protocols that reduce variability across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects immune cell dynamics to disease progression by correlating CXCR6+ cell behavior with acute and chronic liver damage.
- Operational Value: Facilitates preclinical model validation by enabling longitudinal assessment of leukocyte trafficking in intact tissue.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking imaging readouts to histopathological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing dynamic, quantitative readouts of immune cell behavior in a disease-relevant liver microenvironment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of leukocyte recruitment mechanisms and stromal interactions in inflammatory liver disease.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparation with stabilization of vital signs for consistent imaging conditions.
- Analytics: Provides track-based metrics including migration speed, displacement, and interaction maps for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects intravital observations to disease phenotypes through correlation with CCl4-induced hepatocellular damage.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organs and disease models via standardized surgical preparation and intravital imaging framework.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in leukocyte-driven immunopathology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized anesthesia, vital sign monitoring, and tissue embedding protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by visualizing target engagement and cellular response in intact tissue.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on direct observation of immune cell modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and intravital microscopy operation.
- Dependent on multiphoton laser scanning microscopes with tunable far-red excitation and sensitive detectors.
- Necessitates cross-team standardization of surgical preparation, vital sign monitoring, and image analysis pipelines.
- Adaptation to other models requires validation of tissue stabilization and reporter expression in target organs.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for specialized training to maintain animal viability during long-term imaging.
