Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

该程序的总体目标是确定感兴趣的 HIV 1 菌株的相对复制适应性。这是通过首先构建病毒分子克隆或包含全长 HIV 目标序列的 DNA 质粒来实现的。第二步是通过 DNA 转染为每个分子克隆生成病毒储液。

接下来，通过对单一感染细胞培养物进行纵向取样来建立每个 HIV 一种菌株的生长动力学和指数生长期。最后一步是在细胞培养物中进行成对生长竞争或双重感染。最终，使用逆转录、定量实时 PCR 和 DNA 序列色谱图峰高从 Sanger DNA 测序中获得来确定病毒比率，然后用于计算相对病毒复制适应性。

与现有方法（如 paraminol 感染或 DU 感染）相比，该技术的主要优点是它为两种病毒株之间的复制精细差异提供了更灵敏和稳健的测量。本文中提出的方案包括构建 HIV one 重组克隆、通过定点诱变引入感兴趣的突变、制备病毒储备和进行适应性测定以建立病毒生长动力学并确定相对病毒适应性。该视频将向增长竞赛演示两种不同的方法。

要确定用于计算适应性的病毒比率，请参阅所有其他程序的方案文本，以准备生长竞争测定种子的 3 乘以 10 至第 5 个 PHA 刺激的外周血单核细胞或 P BMC，总体积为每孔 500 微升在 48 孔平底板中。将板保持在 37 摄氏度，在 5% 二氧化碳气氛中直至接种。接下来，为每种病毒准备 3 毫升含有 6， 000 IU 的接种物。

在典型的实验中，测试了多个突变体，但出于此演示的目的，将只针对原型病毒测试一个突变体。在明矾中正确制备病毒是此过程的关键步骤。可能需要对具有非常高感染性标题的病毒茎进行连续稀释 转移，将每种病毒接种物 1.5 毫升放入无菌管中，以产生双重感染接种物。

将 500 微升双重接种物添加到 PHA 刺激的 PBMC 中。在 48 孔板的每个孔中。最终培养体积为每孔等分试样 1 毫升，双接种物每孔 200 微升至 2 96 孔板中。

对于 RNA 分离，请保存一个板作为备份。将接种的细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳气氛中孵育 16 至 24 小时。接种后 16 至 24 小时，洗涤培养物，去除并丢弃 750 微升培养物上清液，加入 750 微升新鲜完整 IS 围巾、改良 docos 培养基或 C-I-M-D-M。

用保鲜膜包裹板并旋转 10 分钟。在 300 g 时，去除并丢弃 750 微升上清液，加入 750 微升新鲜 C-I-M-D-M，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳气氛下孵育板。应选择采样时间，以包括病毒指数生长阶段中的至少三个时间点。

要收集样品，请将 500 μL 培养上清液转移到 1.8 mL离心管中，并离心 1 分钟。在 3000 Gs 下，将 200 μL 无细胞上清液转移至 2 96 中。用于 RNA 分离的孔样品板，再次保存一个板作为备用，将超级纳坦储存在零下 80 摄氏度，直到 RNA 分离。

向每种培养物中加入 500 微升新鲜的 C-I-M-D-M，并将板放回培养箱中，直到下一次采样时间。随后，从样品中分离 RNA，然后进行 CDNA 合成。将演示两种确定病毒比率的方法。

第一种使用逆转录、定量实时 PCR 或 R-T-Q-P-C-R，第二种使用色谱峰高。对于 QPCR，制备质粒 PNL 一式三份的标准连续稀释系列，每步稀释 4 次 3 次 VIFA 稀释 10 倍，从 3 次乘以 10 次稀释至每微升 6 个拷贝至每微升 30 个拷贝。设置 96 孔 QPCR 反应板。

每个板应包含至少一个阴性对照、标准稀释系列、每个 CD NA 样品一式三份和一式两份。使用 A-V-I-F-A 引物探针检测标准稀释系列中阴性对照中的信号，并使用 CDNA 样品的一个副本。将 VIFB 引物探针与 CD NA 样品的另一个副本一起使用，对于每个 QPCR 反应，使用 12.5 微升 QPCR 预混液。

0.2 微摩尔的 QPCR 探针。标准稀释系列各 0.8 微摩尔的正向和反向引物以及 1 微升 CD NA，加入 PNL 四三个 VIFA 的连续稀释液，而不是 CDNA，使用水或缓冲液代替 CDNA，按照制造商的说明设置 PCR 循环参数，以作 QP qPCR R 机器。使用来自标准稀释系列的扩增数据计算标准曲线。

将 CD NA 样品的扩增数据与标准曲线进行比较，以确定拷贝数。使用病毒生长速率计算或 GRC 网络工具计算相对病毒适应性输入。从 RT qPCR R 步骤中以指定格式获得的 CDNA 拷贝数。

显示选择计算将输出两种竞争病毒之间的净生长速率差异，以使用色谱图峰高确定病毒比率。使用 VIF 正向和 VIF 反向引物对含有 VIF AB 序列标签的 HIV ONE VIF 片段进行 PCR 扩增。对于每个 PCR 反应，使用一微升 CDNA、一个 XNH 四缓冲液、1.5 毫摩尔的 M gcl、两个 0.2 毫摩尔的 DTP、2.5 U 的 TAC 聚合酶和 0.45 微摩尔的每种引物。

加水至最终体积为 50 μL。将 PCR 循环参数设置为 94 摄氏度下的三个循环，每次 1 分钟。55 摄氏度 1 分钟，70 摄氏度 1 分钟，然后在 94 摄氏度下循环 34 次，持续 15 秒。

58 摄氏度 30 秒，70 摄氏度 1 分钟。最后，保持在 4 摄氏度。随后使用市售试剂盒纯化 PCR 产物，并将纯化的 PCR 产物提交给 DNA 测序服务提供商进行 Sanger 测序。

检查测序服务提供的平均读取质量分数。如果平均碱基检出准确度低于 85%，则重复 PCR 扩增纯化 PCR 产物和 Sanger 测序。使用 Chromat 定量 Web 工具计算每个时间点的病毒比率。

所需的输入是前导序列和序列色谱图文件。AB one 格式。该工具可测量指定位点的峰强度。

峰强度的比率对应于两种病毒的比率。使用 GRC 网络工具计算相对病毒适应性。输入是使用 Chromat 定量 web 工具以指定格式获得的序列色谱图峰高。

显示 GRC 网络工具将计算两种竞争病毒株之间的净生长速率差异，构建了一个原型和三种 HIV 突变病毒，并表征了它们在 PBMC 中的生长。TCID 50 的范围从每毫升 10 到 4 到 10 到 5 IU。所有病毒在第 2 天和第 4 天之间呈指数级增长。

在指数生长阶段，所有三个突变体的生长速度都比原型病毒慢。在生长竞争试验中，每个突变体以 0.005 的总 MOI 与原型病毒竞争，双重感染培养物中的病毒生长动力学与单一感染相似。病毒指数生长期在第 2 天到第 4 天之间，病毒生长在第 5 天左右达到平台期。

病毒生长速率的差异来自病毒比率随时间的变化。根据参考病毒和突变病毒的 CDNA 拷贝数使用 R-T-Q-P-C-R 计算病毒比率，并通过比较核苷酸位点序列色谱图中的峰高，区分两种病毒，将 T 2 42 N 突变体与原型进行比较。在这个例子中，使用两种方法确定的生长速率差异产生了相似的结果。

所有三个突变体的复制适应性都低于原型病毒，其中 I 2 56 V 突变体的适应性最低。看完这个视频，你应该对如何进行 PWIs 生长竞赛论文以确定 HIV 的相对复制适应性有一个很好的了解。一。