Name: 成对增长竞争测定法测定人类免疫缺陷病毒的复制健身 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 了解成对增长竞争测定法用于测定HIV-1复制健身的技术。该方法通过构建重组病毒克隆、DNA转染制备病毒库，并利用实时定量PCR和Sanger测序色谱峰高分析病毒比例，为艾滋病病毒学研究提供灵敏可靠的复制健身评估工具。

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这些研究由美国公共卫生服务基金 P01AI057005、R01AI047734、R01AI111806 以及华盛顿大学艾滋病研究中心的功能分析与计算生物学核心（P30 AI027757）资助。

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
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<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。本文表达的观点仅为作者个人观点，不应被解释为美国国防部或美国陆军的官方立场，也不代表其观点。&#160;

本方案包含两个主要部分：重组HIV-1分子克隆的构建和生长竞争实验。为了在双重感染的细胞培养体系中区分两种病毒，至关重要的是竞争性分子克隆需包含可被RT-qPCR引物-探针检测或Sanger测序识别的序列标签。本方案采用VifA和VifB标签，它们位于HIV-1 NL4-3 vif 基因的相同区域，编码相同的氨基酸序列，但存在六个同义突变。已有研究表明，这些突变不会影响 病毒复制适合度20。与基于限制性酶切位点的克隆方法相比，本方案所使用的基于PCR的克隆方法在选择克隆位点方面具有更高的灵活性。然而，随着插入片段长度的增加，PCR克隆的效率会下降。目前插入片段长度的上限约为5 kb34。对于基于PCR的克隆和定点突变，使用高保真DNA聚合酶至关重要，以降低引入额外突变的可能性。同时建议使用最少的PCR循环次数，以获得足够量的产物。根据我们的经验，在完成本方案所述的基于PCR的克隆和定点突变步骤后，未检测到任何额外突变。尽管如此，仍应对PCR产物进行测序，以检查是否存在非预期突变。理想情况下，应重新测序整个HIV编码区。
在指数生长期应至少检测三个取样时间点9。必须首先通过每日取样确定病毒的生长动力学，以明确生长竞争实验所需的培养周期和取样时间点。影响病毒生长动力学的一个因素是感染复数（multiplicity of infection, MOI）。本方案对单一感染和生长竞争均采用总MOI为0.005，因为已有研究表明该条件比更低的MOI能获得更稳健的结果9。然而，若需要更长的指数生长期，也可使用更低的MOI，但会牺牲结果的一致性。本方案建议初始感染比例为50:50，前提是病毒之间的适应性差异通常在实验前未知。但是，当已有初步数据表明病毒复制动力学存在显著差异时，可采用不等的输入比例。在此类情况下，建议采用70:30的感染比例，以便在较弱适应性的病毒过量存在时仍能检测到较大的适应性差异9。
测定TCID50的实验方案50病毒生长动力学以及竞争性生长实验的条件，均使用HIV-1 B亚型NL4-3 COTB-p24及来自单一供体的外周血单个核细胞（PBMC）进行优化，该供体的PBMC对HIV-1感染表现出稳定易感性 体外本方案中提供的培养周期和取样时间点可能适用于在人外周血单个核细胞（PBMCs）中研究HIV-1 M组病毒。建议使用单一来源的PBMCs以获得一致的结果，因为病毒复制在不同供体的细胞中可能存在差异。35尽管效果较差，但可使用来自多个供体的PBMC混合物作为替代，前提是所有实验中使用相同的混合样本。另一种替代方案是使用细胞系。本方案已成功应用于T细胞系CEMx174。23,36然而，必须重新优化接种细胞的数量，以获得稳定的细胞生长。此外，病毒生长动力学也需重新确定，因其在不同细胞系中可能存在差异，从而确定生长竞争步骤中的合适取样时间点。
本方案中包含两种用于计算适合度的病毒比例测定方法。第一种方法采用RT-qPCR，在每个采样时间点测定病毒cDNA拷贝数，并基于cDNA拷贝数计算病毒复制适合度。另一种方法则基于VifAB标签位点处测序色谱图峰高的比例来确定病毒比例。这两种方法所得结果具有可比性（图4）。色谱图峰高法可应用于无工程化序列标签的其他HIV-1毒株。对于RT-qPCR方法，必须首先仔细评估引物或探针区分病毒变异体的能力（见20）。然而，RT-qPCR对病毒RNA含量较低的样本具有更高的灵敏度，例如指数生长期首个时间点的样本。直接测定病毒cDNA还可检测RNA提取和cDNA合成过程中可能出现的技术问题。使用带有序列标签的分子克隆为RT-qPCR方法提供了成本效益较高的解决方案，因为只需两对引物和探针即可研究多种病毒。该策略还可避免由于邻近碱基影响导致测序色谱图中峰高变异的问题37，因为所有病毒的测序均在同一位置进行。RT-qPCR和Sanger测序所产生的PCR产物也可用于其他病毒比例测定方法，例如单个克隆的大规模测序12,13、HTA4,7,17,19或寡核苷酸连接检测（OLA）38。

病毒复制适合度被定义为病毒在特定环境中产生具有感染性子代病毒的能力1，是决定病毒变异株在群体水平上随时间推移流行程度的重要影响因素2。由于对HIV-1等致病性人类病毒难以开展in vivo适合度研究，目前已开发出多种in vitro和ex vivo复制适合度检测方法，用于研究药物耐药性和免疫逃逸突变、上位性以及病毒群体进化对适合度的影响3-6。在各类适合度检测方法中，生长竞争实验因其更高的敏感性和有效性而被广泛认可，因为在该实验中，两种或多种病毒变异株在完全相同的环境条件下竞争同一细胞群体，类似于in vivo的情况1,7,8。在开展生长竞争实验前，需确定多个变量，包括不同的感染复数（MOI）、病毒接种比例以及采样分析的时间点。我们已研究了这些参数对病毒生长动力学及竞争实验结果的影响，并确定了在细胞培养中准确测定HIV-1适合度所需的关键因素9。
除了检测变量外，还有多种方法可用于定量生长竞争实验中的病毒变异体。可通过群体测序10,11或克隆测序12,13，根据目标位点的核苷酸频率来确定竞争病毒之间的比例。相对适应度则通过该比例随时间的变化推导得出。由于DNA测序服务广泛可得，该方法较为便捷。平行等位基因特异性测序（PASS）方法可实现多个位点的测序并检测重组子14，但需要专门开发的试剂和检测系统。总体而言，这些方法主要用于研究在目标区域内仅有少量核苷酸差异的病毒株。其他方法则使用小型报告基因15或同义突变4,16-18作为标签，通过测序、异源双链追踪分析（HTA）4,7,17,19或逆转录-定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）15,16,18,20来区分竞争病毒，这些方法均可适用于研究无论序列相似性如何的病毒株。然而，这些方法需要额外步骤将标签引入病毒基因组，而RT-qPCR检测还需特定试剂和仪器。我们发现，群体Sanger测序可获得类似的结果9。
经过生长竞争后，病毒复制适合度以相对适合度表示，即两种病毒变异株之间的适合度比率。病毒的相对适合度可定义为病毒变异株在感染接种物中最终比例与其初始比例的归一化值，或定义为两种竞争病毒之间净生长速率的差异。我们发现，后一种方法仅使用指数生长期内的纵向数据点，可获得最稳健的结果9,20。
体外 适合度检测主要用于研究生物克隆6-8 和 HIV-1 的感染性分子克隆。后者易于进行遗传操作，因此常被用于研究特定突变或目标序列对适合度的影响3-5,21,22。以下方案描述了一个完整的工作流程，包括利用含有序列标签的 HIV-1 载体构建新的全长感染性 HIV-1 分子克隆、引入目标突变、制备病毒储备液、建立病毒生长动力学，直至开展生长竞争实验并计算相对适合度（图 1）。
通过优化后的实验流程，我们构建了三种重组HIV-1突变体，并测定了它们的复制适应性。首先，通过将含有HIV-1实验室毒株NL4-3全长感染性基因组的质粒pNL4-3中的HIV-1 gag-p24基因区域替换为合成的COTB（树中心，B亚型）gag-p24序列23，构建出重组分子克隆，即原型病毒。随后引入单个氨基酸替换（T186M、T242N和I256V），构建出三种突变克隆。每种突变体均与原型病毒进行竞争实验，以评估在特定遗传背景下各突变对适应性的影响。三种突变体表现出不同程度的复制适应性，均低于原型病毒，差异从轻微到显著不等。T242N突变此前已被报道具有中等程度的适应性代价24-26，本研究结果与其一致。其余两种突变的适应性代价此前尚未见报道。

<table><tbody><tr><td>重组克隆的构建</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>嵌合引物/突变引物/测序引物</td><td>IDT</td><td></td><td>定制DNA寡核苷酸</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA 和 pNL4-3VifB 质粒</td><td></td><td></td><td>请联系 James I Mullins 博士 (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>高保真缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>应用生物系统公司&amp;reg; GeneAmp&amp;reg; PCR System 9700</td></tr><tr><td>DNA上样染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA 标准品</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 化学感受态细胞 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria肉汤基础粉末</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>研究产品国际公司</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>转染</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂</td><td>罗氏</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr><tr><td>0.22 &amp;#956;m 滤膜上层管</td><td>VWR International</td><td>89220-716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>艾斯科夫&amp;prime;s 改良杜尔贝科培养基&amp;prime;s Medium（IMDM）</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>植物血凝素（PHA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素-2</td><td>罗氏</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微型离心管</td><td>贝克山生物</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>带O形圈的1.5 ml离心管</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 一次性塑料离心管</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>酶联免疫吸附测定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>兔抗HIV-1 SF2 p24抗血清</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB 微孔板过氧化物酶底物</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>经任何途径接触均可引起严重灼伤。使用个人防护装备。仅可在化学通风橱中操作。立即用大量水冲洗至少15分钟。</td></tr><tr><td>HIV p24 标准品</td><td>艾滋病与癌症病毒项目（NCI-Frederick）</td><td></td><td>有关订购详情，请联系 Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov)；http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax 动力学 ELISA 微孔板读板仪</td></tr><tr><td>RNA提取与cDNA合成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp病毒RNA小型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>上标III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>第一链缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>罗氏</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR仪</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&amp;reg; 基因表达预混液</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>正向引物、反向引物</td><td>IDT</td><td></td><td>定制订单</td></tr><tr><td>探针</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>定制订单</td></tr><tr><td>光学96孔反应板</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+测序</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶（Biolase）</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>测序引物</td><td>IDT</td><td></td><td>定制订单</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>DNA测序服务提供商</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRC 网络工具</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChromatQuan 网络工具</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

体外 适合度测定是确定HIV-1等病毒复制适合度的重要工具。已有多种测量方法用于推断病毒复制适合度，包括每感染单位的病毒颗粒数、细胞培养中的生长速率，以及通过多周期生长竞争实验得出的相对适合度。生长竞争实验能够提供尤为敏感的适合度测量结果，因为病毒在完全相同的生长条件下竞争细胞靶点。在进行生长竞争实验时，需考虑若干实验因素，如感染复数（MOI）、取样时间以及病毒检测和适合度计算方法。每个因素都可能影响最终结果，因此必须在实验设计阶段仔细考量。本文提供的实验方案涵盖了从构建新的重组HIV-1克隆，到开展生长竞争实验并分析实验结果的完整步骤。本方案采用此前已被证实可获得一致且可靠结果的实验参数值。同时讨论了可选方案，因为某些参数需根据所研究的细胞类型和病毒种类进行调整。本方案包含两种可选的病毒检测方法，以适应不同实验室在仪器、试剂和专业技术方面的差异。

为了研究 HIV-1 Gag-p24 中单个氨基酸变化对病毒适应性的影响，我们采用寡核苷酸介导的定点突变技术，将突变引入含有 HIV-1 COTB-p24 基因的 pNL4-3 质粒中23,32,33。通过转染 293T 细胞并在 48 小时后收集，制备病毒原液。我们采用 Reed-Muench 方法31估算每种病毒原液的 50% 组织培养感染剂量（TCID50）。原型病毒与突变病毒的 TCID50 值介于 104 至 105 IU/ml 之间（图 3A）。
在单一供体的PBMC中，以0.005的感染复数（MOI）建立了重组病毒的生长动力学。采用RT-qPCR每日检测病毒cDNA拷贝数，持续六天。所有突变株及原型病毒在第2天至第4天期间呈指数增长，此后病毒生长减缓，表现为病毒RNA拷贝数增长斜率降低（图3B）。从第0天（对应接种物）到第2天cDNA拷贝数的减少，是由于病毒吸附至细胞以及第1天洗涤步骤（步骤5.1.6）去除了未结合的病毒颗粒所致。在指数生长期，三种突变株的生长速率（g）均低于原型病毒（图3C）。
在总感染复数（MOI）为0.005的条件下，通过生长竞争实验将三种突变体与原型病毒进行竞争。双重感染培养物中的病毒生长动力学与单重感染相似；病毒的指数生长期出现在第2至第4天之间，病毒生长在第5天左右达到平台期（图4A）。
病毒生长速率差异是根据病毒比例随时间的变化计算得出的。病毒比例通过RT-qPCR检测参考病毒与突变病毒的cDNA拷贝数，并结合两种病毒在区分核苷酸位点处测序色谱图峰高的比较来确定（图4B）。采用峰高法与病毒RNA拷贝数法所测定的生长速率差异结果相似（图4C）。三种突变体的复制适应性均低于原型病毒，其中I256V突变体的适应性最低（图4C）。
<img alt="病毒制备流程图；质粒载体、定点突变、转染、病毒生长动力学分析。" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1： 本文所述实验方案的流程图。 病毒制备方案涉及构建 HIV-1 重组克隆及制备病毒储备液。适合度检测方案用于建立病毒生长动力学曲线并确定相对病毒适合度。虚线表示方案的可选流程。例如，可直接将突变引入 HIV-1 NL4-3 分子克隆，而无需构建重组克隆。
<img alt="PCR基因编辑示意图；显示引物、插入片段、重组质粒构建步骤。" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2： 利用重叠延伸PCR构建HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24重组分子克隆。（A）设计嵌合引物。引物的5’端包含NL4-3载体序列，3’端包含插入片段序列的末端。（B）使用嵌合引物扩增插入片段COTB Gag-p24。（C）将插入片段用作引物进行第二轮PCR，以生成新的重组质粒。
<img alt="病毒突变研究；柱状图与折线图；比较TCID50、cDNA、生长速率；突变影响。" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3：病毒在PBMCs中的生长特性。（A）病毒毒种的Log10 TCID50。（B）从MOI = 0.005起始的单一感染中病毒的生长动力学。（C）六天内的病毒生长速率，包括根据图（B）得出的指数生长期（第2–4天）。所示数值为一次实验中三个重复样本的平均值，误差线表示95%置信区间。
<img alt="cDNA合成与PCR图表；RNA提取过程；病毒株生长速率图；数据分析。" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4： 病毒生长及相对适应性测定。（A）双重感染的PBMC培养物中的病毒生长情况。（B）通过RT-qPCR或测序峰高法测定的T242N突变株与原型病毒的比例。（C）在双重感染培养物中，突变株与原型病毒之间的净病毒生长速率差异（d），如图（A）所示。d值由（B）中所示的病毒比例数据计算得出。图中数值代表一次实验中三个重复样本的平均值。误差线表示95%置信区间。

近等基因病毒之间的生长竞争可为确定相对复制适合度提供一种灵敏的测量方法。本文所述方案包括重组HIV-1克隆的构建、病毒扩增以及优化的生长竞争实验与分析方法，以获得灵敏且一致的结果。

体外适合度检测是确定HIV-1等病毒复制适合度的重要工具。已有多种测量方法用于……

本实验的总体目标是确定感兴趣的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）毒株的相对复制适合度。首先构建含有全长HIV-1目标序列的病毒分子克隆或DNA质粒来实现这一目标。第二步是通过DNA转染为每个分子克隆制备病毒储备液。接下来，通过纵向取样单感染的细胞培养物，确定每种HIV-1毒株的生长动力学及指数生长期。最后一步是在细胞培养物中进行成对生长竞争或双重感染实验。最终利用逆转录、定量实时PCR以及Sanger DNA测序获得的DNA序列色谱图峰高来确定病毒比例，并据此计算病毒相对复制适合度。与现有的单感染平行法或双时间点双重感染法相比，该技术的主要优势在于能够更灵敏、更可靠地测量两种病毒株之间的复制适合度差异。本文所介绍的实验方案包括构建HIV-1重组克隆，通过定点突变引入感兴趣的突变，制备病毒原液，以及开展适合度测定实验，以建立病毒生长动力学曲线并确定病毒相对适合度。本视频将演示竞争性生长实验及两种不同的检测方法。为了确定用于计算适应度的病毒比例，请参考方案文本中的所有其他步骤。为进行生长竞争实验，将经PHA刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）以每孔500微升的总体积接种于48孔平底板中，每孔接种3 × 10⁵个细胞。将培养板置于37°C、5%二氧化碳气氛中，直至接种病毒。接下来，制备3毫升接种物，每种病毒含6,000 IU。在典型的实验中，通常会测试多个突变株，但为了演示目的，本实验仅测试一种突变株与原型病毒的感染情况。正确制备病毒接种物是该实验的关键步骤，因为对于感染滴度极高的病毒储备液，可能需要进行系列稀释。将每种病毒接种物各1.5毫升转移至无菌管中，以制备双重感染接种物。向48孔板的每个孔中的PHA刺激的PBMC中加入500微升双接种物。最终培养体积为每孔1毫升。将双接种物每孔200微升分装至两个96孔板中用于RNA提取。保留一个板作为备用。将接种后的细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育16至24小时。接种后16至24小时，洗涤培养物，移除并弃去每孔750微升培养上清液，加入750微升新鲜的完全Iscove改良Dulbecco培养基（cIMDM）。用塑料封口膜包裹培养板，以300 × g离心10分钟。离心后移除并弃去750微升上清液。加入750微升新鲜cIMDM培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育。采样时间点应至少包含病毒指数生长期内的三个时间点。采集样品时，将500微升培养上清液转移至1.8毫升离心管中，在3000 ×g条件下离心1分钟。取200微升无细胞上清液加入两个96孔样品板中，用于RNA提取，并保留其中一个板作为备用。将上清液于-80°C保存，直至进行RNA提取。向每种培养物中加入 500 µL 新鲜的 cIMDM，并将培养板放回培养箱中，直至下一次取样时间。随后，从样品中提取 RNA，进行 cDNA 合成。将演示两种测定病毒比例的方法。第一种方法采用反转录定量实时PCR（RT qPCR），第二种方法采用色谱峰高法。对于qPCR，将质粒pNL4-3VifA进行系列倍比稀释，制备标准品，每步稀释10倍，从每微升3 × 10⁶拷贝至每微升30拷贝，每个浓度设三个复孔。设置一个96孔qPCR反应板。每块板上应至少包含一个阴性对照、标准稀释系列的三个复孔以及每个cDNA样本的两个复孔。使用vFIA引物探针检测阴性对照、标准稀释系列以及一个cDNA样本复孔中的信号。对另一个cDNA样本复孔使用vIFB引物探针。每个qPCR反应使用12.5 µL的qPCR预混液，0.2 µM的qPCR探针，正向和反向引物各0.8 µM，以及1 µL cDNA；对于标准稀释系列，加入pNL4-3VifA的系列稀释液代替cDNA；对于阴性对照，使用水或缓冲液代替cDNA。根据qPCR仪器制造商的说明设置PCR扩增循环参数。利用标准稀释系列的扩增数据计算标准曲线。将cDNA样品的扩增数据与标准曲线进行比较，以确定拷贝数。使用病毒生长率计算方法或GRC网络工具来计算相对病毒适应性。按照所示的指定格式输入RT-qPCR步骤获得的cDNA拷贝数。点击“计算”将输出两种竞争性病毒之间的净生长率差异。若需通过色谱图峰高确定病毒比例，请使用VIF正向引物和VIF反向引物对包含VIFAB序列标签的HIV-1 VIF片段进行PCR扩增。每次PCR反应体系中加入1 µL cDNA、1× NH4缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、2.5 U Taq聚合酶以及每种引物各0.45 µmol/L。加水至终体积为 50 µL。PCR 扩增程序设置为：94 °C 变性 1 分钟，55 °C 退火 1 分钟，70 °C 延伸 1 分钟，共 3 个循环；随后进行 34 个循环：94 °C 15 秒，58 °C 30 秒，70 °C 1 分钟；最后在 4 °C 保存。随后使用 commercially available kit 纯化 PCR 产物，并将纯化后的 PCR 产物送至 DNA 测序服务公司进行 Sanger 测序。检查测序服务提供的平均读长质量分数。如果平均碱基识别准确率低于85%，则重复PCR扩增、PCR产物纯化及Sanger测序步骤。使用Chromat定量网络工具计算每个时间点的病毒比例。所需的输入为引导序列以及以 .ab1 格式保存的序列色谱文件。该工具可测量指定位点的峰强度。峰强度的比值对应于两种病毒的比值。使用GRC网络工具计算相对病毒适合度，输入数据为采用Chromat定量网络工具获得的序列色谱图峰高，格式如指定所示。GRC网络工具将计算两种竞争性病毒株之间的净生长速率差异。构建了一种原型病毒和三种HIV突变病毒，并表征了它们在PBMC中的生长情况。TCID50值范围为10的4次方至10的5次方IU/毫升。所有病毒在第2天至第4天均呈指数增长。在指数生长期，所有三种突变株的生长速率均慢于原型病毒。在总感染复数（MOI）为0.005的条件下，通过生长竞争实验将每种突变株与原型病毒进行竞争，结果发现双重感染培养物中的病毒生长动力学与单感染相似。病毒的指数生长期出现在第2至第4天之间，病毒生长在第5天左右达到平台期。病毒生长速率差异通过病毒比例随时间的变化计算得出。病毒比例根据参考病毒和突变病毒的cDNA拷贝数，利用RT-qPCR测定，并结合在能够区分两种病毒的核苷酸位点处测序色谱图中的峰高比较进行计算，其中T242-N突变体与原型病毒进行比较。本示例中，采用两种方法测定的生长速率差异结果相似。三种突变体的复制适应性均低于原型病毒，其中I256-V突变体的适应性最低。观看本视频后，您应能够充分理解如何进行成对生长竞争实验，以确定HIV-1的相对复制适应性。

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测定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验

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