Name: 3D器官联合培养模型支持胸腺髓质上皮细胞增殖，分化和混杂基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解三维器官型培养系统中胸腺髓质上皮细胞的培养方法，使用纤维蛋白凝胶和纤维支架实现细胞增殖与分化。该技术优于传统二维培养，可维持混杂基因表达并促进免疫学研究。

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本工作得到了德国癌症研究中心（DKFZ）、欧盟“Tolerage”联盟、德国研究基金会（SFB 938）以及巴登-符腾堡州基金会的资助。

本研究已获得卡尔斯鲁厄政府地区委员会伦理委员会的批准。所有动物均饲养于德国癌症研究中心（DKFZ）的无特定病原体环境中。所有培养实验均使用出生后1至7天的小鼠幼崽。
1. 从胸腺中分离 mTEC
注意：以下消化步骤按照先前所述方法1在无菌条件下进行，但有一些修改，如下所述。
<ol>
	<li>处死小鼠幼崽并取出胸腺。将胸腺置于含有 RPMI 1640 培养基（含 5% FCS）的培养皿中，并置于冰上。</li>
	<li>将胸腺切成细小碎片，放入圆底试管中，加入约 5–30 mL RPMI 培养基，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌 10 分钟。</li>
	<li>随后，倾去上清液（主要含胸腺细胞），将剩余组织依次进行消化：首先使用 IV 型胶原酶（终浓度为 0.2 mg/mL 和 57 U/mL）在 37 °C 水浴中磁力搅拌消化 15 分钟，接着使用胶原酶/分散酶（终浓度为 0.2 mg/mL 和 1.2 U/mL）在 37 °C 水浴中磁力搅拌消化 25 分钟，直至胸腺组织完全消化。每两至三个胸腺使用 1 mL 酶液。</li>
	<li>每隔 7–10 分钟用巴斯德吸管轻轻振荡组织一次。收集胶原酶/分散酶消化液，并通过 70 µm 滤网过滤。</li>
	<li>通过磁性细胞分选（MACS）富集 mTEC。按照先前描述的方法11并如图 1所示进行 mTEC 的磁性细胞分选纯化。 
	注意：用于 mTEC 磁性分选的抗体如下：anti-CD80-PE（16-10A1，使用稀释度为 1:100）和 anti-EpCAM-bio（G8.8，使用稀释度为 1:100）12。使用 MACS 定义的未成熟和成熟 mTEC 分别为：CD45- EpCAM+ CD80- 和 CD45- CD80+。</li>
	<li>经 MACS 纯化后（未成熟 mTEC 纯度为 83.1 ± 6.3%，成熟 mTEC 纯度为 79.23 ± 3.42%），将 mTEC 接种至器官型培养系统中，具体操作如下文第 2.3 节所述。</li>
	<li>或者，在 CD45 MACS 耗竭后，使用 FACS（采用 100 µm 喷嘴）对 mTEC 进行分选，所用抗体如下：anti-CD45-PerCP（30-F11，使用稀释度为 1:100）、anti-Ly51-FITC（6C3，使用稀释度为 1:100）、anti-EpCAM-Alexa647（G8.8，使用稀释度为 1:500）和 anti-CD80-PE（16-10A1，使用稀释度为 1:100）。使用碘化丙啶（1:5,000）排除死细胞（第 4 天）。使用 FACS 定义的未成熟和成熟 mTEC 分别为：PI- CD45- Ly51-EpCAM+ CD80- 和 PI- CD45- Ly51- EpCAM+ CD80+。</li>
</ol>
2. 三维类器官共培养（OTCs）
注意：用于角质形成细胞类器官培养的3D-皮肤构建物的制备方法如前所述9,13。所有步骤均在37 °C和5% CO2条件下进行细胞孵育。使用mTECs制备OTCs的方法略有修改，如下所述。
<ol>
	<li>人成纤维细胞的制备 
	注意：人真皮成纤维细胞通过之前所述的方法从去表皮的真皮组织块培养中获得9。
	<ol>
		<li>简言之，将人皮肤切成条状（约5 cm长），在4 °C下用热蛋白酶（0.5 mg/ml溶于生理盐水，含10 mM Hepes，pH 7.4）处理过夜（O/N）。</li>
		<li>随后用镊子将表皮与真皮分离。</li>
		<li>将真皮组织精细剪碎成小块，置于10 cm培养皿中，在无菌气流下干燥1-2小时。定期补充含20 % FBS的DMEM培养基以维持组织块生长。</li>
		<li>当细胞长满（通常约3周）时，使用0.1 %胰蛋白酶消化并传代扩增成纤维细胞，确保组织块仍附着于培养皿，以便后续连续出芽生长。</li>
		<li>将来自同一组织块的成纤维细胞在含10 % FBS的DMEM中最多扩增3次，并进行冷冻保存14。每一系列实验应使用同一批次的成纤维细胞。 
		注意：构建真皮等效物时，成纤维细胞未进行照射处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架的制备
	<ol>
		<li>使用锋利的11 mm直径金属打孔器，将厚度为0.4-0.6 mm的粘胶非织造纤维材料（产品详情见附带的Excel表格）切割成边界清晰的圆形，使其恰好适配12孔滤膜插入物。然后将其放入12孔滤膜插入物（聚酯毛细孔膜，孔径3 µm）中作为支架。将完整的滤膜装置放入无菌的12孔板中。</li>
		<li>使用外科用纤维蛋白胶试剂盒（包含纤维蛋白原和凝血酶组分）制备纤维蛋白凝胶。将试剂盒中的纤维蛋白原和凝血酶组分分别预稀释至8 mg/ml和10单位/ml。针对单个12孔板孔的操作步骤如下：
		<ol>
			<li>将100 µl纤维蛋白原（8 mg/ml）与100 µl不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）混合。将100 µl凝血酶（10单位/ml）与100 µl含270,000个成纤维细胞的FCS混合。</li>
			<li>将含成纤维细胞的凝血酶混合液200 µl加入支架上，再加入200 µl纤维蛋白原溶液（1:1混合），最终纤维蛋白原浓度为2 mg/ml，凝血酶浓度为2.5单位/ml。轻轻吹打混匀，并均匀分布在整个支架表面（第1天）。 
			注意：在37 °C下孵育30分钟后，将形成包裹成纤维细胞的凝块，完全填充支架内部空间并形成光滑的上表面。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与mTECs共培养
	<ol>
		<li>预培养阶段，将器官培养物浸没于含10 % FBS、50 µg/ml L-抗坏血酸和1 ng/ml TGF-β1的DMEM中，每隔一天更换一次培养基，持续4-5天。</li>
		<li>在接种mTECs当天，将培养基更换为rFAD培养基（1:1 DMEM + DMEM/F12），其中含10% FBS、10-10 M霍乱毒素、0.4 mg/ml氢化可的松、50 µg/ml L-抗坏血酸、RANK配体（0.1 μg/ml）和500单位/ml抑肽酶，以防止成纤维细胞分泌的丝氨酸蛋白酶引起过早的纤维蛋白溶解。</li>
		<li>7-8小时后，在支架上方每孔加入100 µl含250,000个mTECs（完整mTECs或CD80lo和CD80hi亚群）进行共培养。使用Neubauer计数板计数细胞（第4天）。 
		注意：在整个过程中，胸腺三维类器官培养物始终浸没在培养基中，不同于皮肤OTC采用的气液界面培养法。</li>
		<li>孵育24小时后，更换全部培养基（总换液），培养基成分同上（步骤2.3.2），但抑肽酶浓度降低至250单位/ml（第5天）。</li>
		<li>为评估mTECs的增殖活性，在终止培养前4小时向OTC中加入EdU（6.7 µM/ml，即&#160;每孔10 µM）。按照EdU成像试剂盒说明对OTC冷冻切片进行染色，并联合角蛋白14共染色。通过计数每个样本两个切片中的K14+ EdU+细胞，或通过流式细胞术（EdU流式检测，第1.7节，但以CDR1-PB15抗体1:100稀释替代Ly51-FITC，见2.3.6.4）测定mTECs的增殖指数。</li>
		<li>共培养4-7天后，终止OTC培养并进行RNA提取、冷冻切片或FACS分析（第8-11天）。
		<ol>
			<li>使用镊子终止培养，将支架/真皮等效物从插入孔的滤膜上分离。</li>
			<li>用于冷冻切片时，将整个OTC包埋于OCT包埋剂中，在液氮蒸气中速冻后进行冷冻切片。使用恒冷切片机制备5-7 µm厚的OTC切片，存于-20 °C直至使用。对冷冻切片的OTC进行免疫组织化学染色时，使用抗角蛋白14抗体（AF64，1:1,000稀释）和抗波形蛋白抗体（GP53，1:100稀释）。采用相应的二抗进行间接免疫组织化学染色。</li>
			<li>用于RNA提取时，在2 ml无RNase的螺口管盖中加入1 ml变性液（含苯酚和硫氰酸胍）。用手术刀将整个OTC切碎并加入含变性液的管中。使用FastPrep仪器在6.0速度下机械剪切两次，每次30秒，中间在冰上放置2分钟（此后样品可在-80 °C保存）。若在-80 °C冷冻保存，需在冰上解冻。在4 °C下以11,500-13,000 rpm离心10分钟。将上清液转移至新管中，室温孵育5分钟，随后按照制造商说明，采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法进行RNA提取。</li>
			<li>用于FACS分析时，移除支架并将膜从纤维蛋白/成纤维细胞/mTEC凝胶中分离。用手术刀将凝胶精细切碎，在37 °C水浴中加入2 ml胶原酶/分散酶，在FACS管中消化约20分钟或直至完全消化，同时使用磁力搅拌。每5分钟用巴斯德吸管轻轻吹打酶溶液一次。消化完全后，将细胞悬液通过70 µm滤网过滤；按照1.7节所述使用相应抗体对单细胞悬液染色，并通过流式细胞术分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li>
<li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
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<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li>
<li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li>
<li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li>
<li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li>
<li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li>
</ol>

作者声明不存在任何财务或商业利益冲突。

与RTOCs相比，3D OTCs在胸腺上皮细胞（TEC）分化以及前体生发上皮（pGE）的维持/诱导方面显著优于其他培养系统（表1），包括：(i) 仅使用成纤维细胞但无支架的“简化3D培养”；(ii) 采用成纤维细胞/饲养细胞与TECs共培养的2D体系10；(iii) TEC克隆可在3T3-J2细胞上形成，但pGE会丢失；(iv) Matrigel或(v) 细胞外基质（ECM）组分（未发表数据）。在3D OTCs中，pGE可维持长达7天，其中第4天为最佳时间点，此后pGE开始下降。其他TEC的形态学特征可维持达14天。值得注意的是，OTCs支持mTEC终末分化的阶段，表现为偶尔形成的类似哈塞尔小体（Hassall-like）的结构10。
用于器官型胸腺培养（OTC）的胸腺组织取自新生幼鼠，因为与成年小鼠胸腺相比，其在体外培养中具有更高的存活倾向。目前尚未在OTC中测试来源于胚胎期胸腺的胸腺上皮细胞（TEC）。此外，在长时间消化后（未使用胰蛋白酶，以避免裂解某些表位），使用磁珠分选（MACS）获得的细胞比使用...

发育中的胸腺细胞约占胸腺细胞总数的98%，其余2%由多种细胞组成， collectively 构成胸腺基质（即 上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞）。外层皮质上皮细胞（cTECs）负责从骨髓招募前体T细胞，诱导多能前T细胞的T细胞谱系分化，并对具有自身MHC限制性的未成熟胸腺细胞进行阳性选择。内层髓质上皮细胞（mTECs）则通过诱导阴性选择或促使其分化为调节性T细胞谱系，来实现对高亲和力TCR识别自身肽/MHC复合物的胸腺细胞的耐受诱导。在中枢耐受诱导过程中，mTECs的独特之处在于其能够表达广泛谱系的组织限制性自身抗原（TRAs），从而模拟外周组织的自身抗原表达。这一现象被称为异位基因表达（promiscuous gene expression, pGE）1,2。
目前大多数关于这种迷人细胞类型的研究都依赖于ex vivo分离的细胞，因为各种短期二维培养系统均会在前2天内不可避免地导致pGE以及MHC II类分子、FoxN1和Aire等关键调控分子的丢失3-6。然而，此前尚不清楚完整的胸腺三维网状结构中哪些特定组分和特征在二维模型中缺失。胸腺再聚集器官培养（RTOC）迄今为止是唯一一种能够在完整胸腺微环境中同时研究T细胞发育和基质细胞生物学的三维体系7。然而，RTOC存在一定的局限性，即其本身已包含复杂的混合细胞群体，需要输入胎鼠基质细胞，且最长培养时间仅为5至10天。
还原论的缺失 体外 培养系统已阻碍了对T细胞发育和胸腺器官发生多个方面的研究，尤其是pGE的分子调控机制及其与mTECs发育生物学之间关系的研究。
由于皮肤和胸腺上皮细胞在结构组织上具有密切关联，我们选择了一种三维类器官培养（OTC）系统，该系统最初是为模拟角质形成细胞的分化而开发的 体外 从而构建真皮等效物。OTC系统由一个惰性支架基质组成，其上覆盖有被困在纤维蛋白凝胶中的真皮成纤维细胞，再在该结构上接种角质形成细胞8,9在此，我们将角质形成细胞替换为纯化的胸腺上皮细胞（mTECs）。在保留该模型基本特征的同时，我们优化了某些参数。
在采用的OTC模型中，mTEC发生增殖，经历终末分化，并维持mTEC身份特征及pGE，从而高度模拟 体内 mTECs 的发育10本技术说明提供了一套详细的方案，用于逐步建立胸腺器官型培养物（thymus OTCs）。

<table><tbody><tr><td>妊娠 C57BL/6 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 微珠（小鼠）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>抗 PE 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM（G8.8-Alexa 647 和 -生物素）</td><td>参考文献 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-太平洋蓝</td><td>参考文献 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>角蛋白 14 抗体</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白抗体</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 标记的 AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 标记的 AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗豚鼠 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 流式细胞术检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12 孔滤膜插件（thincerts）</td><td>Greiner bio-one</td><td>657631</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原 TISSUECOL-试剂盒 免疫级</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝血酶 TISSUECOL-试剂盒 免疫级</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶（Trasylol）</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;szlig;1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R&amp;D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>嗜热菌蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol（又称变性液——酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法）</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>终浓度为 0.2 mg/ml 和 57U/ml</td></tr><tr><td>中性蛋白酶（Dispase）</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>终浓度为 0.2 mg/ml 和 1.2U/ml</td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>终浓度为 25 &amp;micro;g/ml</td></tr></tbody></table>

支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

胸腺内T细胞发育需要由多种基质细胞构成的复杂三维网状结构， 即， 非T细胞。胸腺细胞在迁移过程中以高度协调的时间和空间顺序穿越这一支架，并依次通过必需的检查点， 即， T细胞谱系定向，随后在T细胞输出至外周前进行T细胞受体库的生成与选择。构成该支架的两种主要常驻细胞类型是皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质胸腺上皮细胞（mTECs）。mTECs的一个关键特征是所谓大量组织限制性抗原的异位表达。这些组织限制性抗原分别由mTECs或胸腺树突状细胞直接或间接呈递给未成熟胸腺细胞，从而诱导自身耐受。
合适的 体外 目前尚缺乏能够模拟皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）发育通路及其功能的模型。这种实验模型的缺失，例如阻碍了对异位性基因表达的研究，而该过程在细胞和分子水平上仍知之甚少。我们改进了一种三维类器官共培养模型用于培养 离体 分离的mTECs。该模型最初设计用于以生成皮肤等效物的方式培养角质形成细胞 体外3D 模型保留了胸腺上皮细胞（mTEC）生物学的关键功能特征：（i）CD80 的增殖与终末分化lo，Aire阴性至CD80你好，表达 Aire 的胸腺上皮细胞，（ii）对 RANKL 的反应性，以及（iii）在 CD80 阳性细胞中持续表达 FoxN1、Aire 和组织限制性基因你好 mTECs

我们采用了一种最初为...而开发的三维类器官共培养模型（3D OTC） 体外 角质形成细胞的长期培养9. 经MACS富集的mTECs（参见MACS富集方案） 图1) 接种到由纤维蛋白凝胶和包埋的成纤维细胞组成的支架上。成纤维细胞提供支持mTECs所需的必需细胞外基质（ECM） 体外MTECs 在 OTCs 中以 RANKL 处理，在淹没培养条件下培养 4–14 天，与角质形成细胞不同，后者采用气液界面培养以模拟其生理环境 体内 环境（参见OTC设置示意图） 图2).
此处分析的两种 mTEC 亚群（即， CD80lo 和 CD80你好 mTECs）在整个长达14天的培养期间均存活。mTECs通过角蛋白14表达进行鉴定，并可与波形蛋白阳性的成纤维细胞明确区分。图 3A, 3B）。有...

研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。

胸腺内T细胞发育需要由多种基质细胞（即非T细胞）构成的复杂三维网状结构。胸腺细胞穿越……

本实验的总体目标是在三维类器官培养（OTC）系统中培养胸腺髓质上皮细胞（mTEC）。该过程首先将纤维支架材料置入12孔滤膜插入式培养板中，随后覆盖一层含有新鲜制备的人皮肤成纤维细胞的纤维蛋白凝胶。经过四至五天的预培养后，将胸腺微组织（MTS）接种于支架上，并在浸没式培养条件下进行培养。最终，可对共培养物进行免疫组织化学、RNA提取和相关检测，以评估CED Mtech的发育情况。三维类器官共培养系统相较于现有的二维培养系统的主要优势在于，其在模拟Mtech的分化、增殖以及维持广泛性基因表达方面具有显著优越性。今天演示该技术的是来自我们合作实验室的技术员Iris Martin。当人真皮成纤维细胞达到汇合状态时，通过煮沸、干燥和平整厚度为 0.4 至 0.6 毫米的粘胶非织造纤维材料来制备支架纤维。使用金属打孔器将其切割成直径 11 毫米的圆形。将切割好的纤维材料置于两张载玻片之间，用铝箔包裹载玻片，并进行高压灭菌处理。灭菌后，将插入物放入无菌12孔板的各孔中，然后将每个支架放入相应的插入物内。接着，将每份支架对应的100微升新鲜稀释的凝血酶中加入2.7 × 10⁵个成纤维细胞和100微升胎牛血清。将凝血酶-成纤维细胞混合物滴加到每个支架上，随后加入200微升新鲜稀释的纤维蛋白原。然后轻轻吹打，使每个孔中的细胞混合物混合均匀，确保溶液在整个支架上分布均匀。图像显示了人真皮成纤维细胞在培养第一天和第四天时与纤维蛋白凝胶共同生长的情况。同时，在不含支架的对照孔中制备测试凝胶，以监测此时凝块形成的时间和过程。使用移液枪头或通过倒置培养板来评估凝块形成情况。在成纤维细胞凝结后，将器官培养物浸入培养基中，该培养基添加了山梨酸和TGF-β1，培养4至5天。在mTEC接种当天，将此培养基更换为含有500单位/毫升抑蛋白酶肽的RFAD培养基，以防止过早发生纤维蛋白溶解。7至8小时后，将2.5 × 10⁵个mTEC悬浮于100 µL RFAD培养基中，接种至每个支架表面，并将共培养体系继续培养24小时。次日，将培养基更换为新鲜培养基，其中含250单位/毫升抑蛋白酶肽，再继续培养4至7天。为了在培养结束时通过免疫组织化学评估 m Texs 的发育情况，使用一对镊子将每个孔插件中的支架真皮等效物与滤膜分离，并将 OTCs 包埋在 OCT 包埋剂中。将 OTCs 置于液氮的气相中冷冻，以分离 O-T-C-R-N-A。将支架组织从滤膜上分离后，使用手术刀将OTC切成小块，并将这些组织块转移至含有1毫升无RNA酶的变性溶液的2毫升无RNA酶离心管中。使用快速研磨仪以6.0的速度对OTC进行两次机械匀浆，每次30秒，两次匀浆之间在冰上静置2分钟。随后按照试剂盒说明书，采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取RNA。为了通过流式细胞术分析OTC，移除膜并从纤维蛋白成纤维细胞mtech凝胶中分离支架。然后，按照刚刚演示的方法，用手术刀切割凝胶。将组织转移至离心管中。继续加入2毫升胶原酶消化液。然后将试管置于37°C水浴中，磁力搅拌20分钟。组织完全消化后，每5分钟用移液器吹打一次。将所得的细胞悬液通过70微米滤网过滤，并使用相应的抗体对细胞进行染色，如图所示。MTS可通过其角蛋白14的表达来鉴定，从而可与波形蛋白阳性的成纤维细胞明确区分。有趣的是，在培养中，未成熟和成熟的MTS表现出不同但高度可重复的生长模式。例如，CD80低表达的不成熟M Texs通常与成纤维细胞紧密接触并形成双层结构。而CD80高表达的MTS则倾向于形成由成纤维细胞包绕的致密细胞聚集体。在所示的3D OTC条件下，mtech亚群不仅存活，而且通过EDU掺入可证实其具有增殖能力。有趣的是，CD80低表达的MTechs在RANKL存在时增殖速率更高。尽管这一情况在CD80高表达的MT.Techs中恰好相反，但在观看本视频后，您应能充分理解如何利用三维OTCs培养MT.Techs。该方法在细胞分化以及PGE的维持与诱导方面显著优于二维培养系统，并具有研究或调控多种细胞参数的潜力。

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

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