3D器官联合培养模型支持胸腺髓质上皮细胞增殖，分化和混杂基因表达

该程序的总体目标是在三维器官型培养物或 OTC 系统中培养胸腺、髓质、上皮细胞或 mtech。这是通过首先将纤维支架材料放入 12 孔过滤器插件中，然后将含有人皮肤成纤维细胞的新鲜制备的纤维蛋白凝胶分层来实现的。经过 4 到 5 天的预培养后，将 MTS 放在支架上，并在浸没培养条件下进行培养。

最终，可以在共培养物上进行免疫组织化学、RNA 分离和 FACTS 以评估 CED Mtech 的发展。与现有的 2D 培养系统相比，3D 器官型共培养系统的主要优势在于，它们在概括 mtech 分化、增殖和维持混杂基因表达方面远远优于 mtech。今天演示这项技术的是我们合作实验室的技术人员 Iris Martin。

当人真皮成纤维细胞达到共流度时，通过煮沸、干燥和熨烫 0.4 至 0.6 毫米厚的粘性无纺布纤维片来制备支架纤维。使用金属打孔器将它们切成 11 毫米的圆圈。将切割的纤维材料放在两张载玻片之间，用箔纸包裹载玻片并高压灭菌。

灭菌后，将插件放入无菌 12 孔板的孔中，然后将每个支架放入相应的插件中。接下来，将 100 微升胎牛血清中的 2.7 乘以 10 至第五成纤维细胞混合到每个支架 100 微升新鲜稀释的凝血酶中。将凝血酶成纤维细胞混合物分配到每个支架上，然后加入 200 微升新鲜稀释的纤维蛋白原。

然后在每个孔中混合细胞混合物，轻轻移液，将溶液均匀分布在整个支架上。该图像显示了在培养的第 1 天和第 4 天使用纤维蛋白凝胶的人真皮成纤维细胞的生长情况。在没有支架的对照孔中准备测试凝胶，以跟踪此时凝块的时间和形成。

使用移液器吸头或在成纤维细胞后倒置板评估凝块形成，将凝结的器官培养物浸入培养基中，补充 la 山梨酸和 TGF β 1 4 至 5 天在 mtech 接种当天，用每毫升蛋白质含有 500 单位的 RFAD 培养基替换该培养基，以防止性早熟纤维蛋白溶解。7 到 8 小时后，将 2.5 倍 10 至第 5 个 MT E 悬浮在 100 微升 RFAD 中，放在每个支架的顶部，并将共培养物孵育 24 小时。第二天，用每毫升含有 250 单位 proin 的新鲜培养基替换培养基，再培养 4 到 7 天。

为了在培养结束时通过免疫组织化学评估 m Texs 的发展，使用一对镊子将支架真皮等效物与每个支架的过滤器分开。将 OTC 插入并包埋在 OCT 化合物中。用液氮在气相中冷冻 OTC 以分离 O-T-C-R-N-A。

将支架组织与过滤器分离后，用手术刀将 OTC 切成碎片，然后将碎片转移到含有 1 毫升变性溶液的 2 毫升 RNA 免费管中。使用快速制备仪器以 6.0 的速度机械切碎 OTC 两次，每次 30 秒，每次切碎之间在冰上休息 2 分钟。然后按照制造商的说明使用酸 guad dium 硫氰酸苯基氯仿提取分离 RNA。

要通过流式细胞术分析 OTC，请去除膜并将支架与纤维蛋白成纤维细胞 mtech 凝胶分离。最后，用手术刀切割凝胶，如刚才所示。将组织转移到传真管中。

继续服用两毫升胶原酶 dis 糊剂。然后将试管置于 37 摄氏度的水浴中，磁力搅拌 20 分钟。当组织完全消化后，每 5 分钟一次搅拌旁路移液器。

通过 70 微米过滤器过滤所得细胞悬液，并使用适当的抗体对细胞进行染色，如图所示。MTS 可以通过其角蛋白 14 表达来识别，使其很容易与芒通阳性成纤维细胞区分开来。有趣的是，未成熟和成熟的 M Tex 在培养中表现出不同但高度可重复的生长模式。

例如，未成熟的 CD 80 D 低 M Tex 通常在与成纤维细胞密切接触时形成双层。虽然 CD 80 D 高 MTS 倾向于形成由成纤维细胞分隔的致密细胞聚集体，但 mtech 亚群不仅存活，而且在证明的 3D OTC 条件下增殖，它们的 EDU 掺入证明了这一点。有趣的是，在 rankl 存在的情况下，CD 80 低 MT 技术以更高的速度增殖。

虽然 CD 80 高 MT 技术人员的情况正好相反，但观看此视频后，您应该对如何培养 MT 有很好的了解。使用 3D OTC 的技术人员。在技术差异化和 PGE 维护和诱导方面，这种方法远优于使用 2D 培养系统，具有研究或纵多个 take 参数的潜力。