高通量实时定量RT-PCR检测方法的确定I型和III型干扰素亚型的表达谱

本实验的总体目标是制备并运行384孔检测板，用于对高度同源的基因群（例如Ⅰ型和Ⅲ型干扰素亚型）进行高通量分析。首先制备用于运行检测板的标准系列稀释液，然后配制用于制板的引物探针工作液混合物以及无模板对照工作液混合物。

然后使用自动多通道移液器制备384孔检测板，并将其干燥后储存。最后，运行并分析384孔检测板。最终，高通量定量实时逆转录PCR检测可用于定义组织培养模型中、病原体研究中或感染性及自身炎症性疾病背景下临床样本中的干扰素表达特征。

与现有的定量 R 二 PCR 方法（使用标准线性探针或赛伯绿）相比，该技术的主要优势在于，分子信标和锁核酸荧光探针可用于区分高度相似序列之间的单碱基对差异。解冻后，对标准品和鲑鱼精子 S-S-D-N-A 进行涡旋振荡并短暂离心。通过将 51 微升 S-S-D-N-A 与 20.3 毫升水混合，配制用于 17 个标准稀释组的 SS DNA 水混合液。将 190 微升 SS DNA 水混合液加入八联 PCR 管条的第一个管中，将 180 微升加入接下来的五个管中。

通过将10微升50皮摩尔标准储备液转移至含有190微升S-S-D-N-A水混合液的离心管中，进行1比20稀释，涡旋混匀后立即离心。在PCR条板中，通过将20微升上一步最新稀释的溶液转移至系列中的下一管，进行1比10稀释，涡旋混匀后立即离心PCR条板。重复1比10稀释步骤，直至系列中的最后一管接收到标准品。

标记最多17个2毫升离心管后，使用12.5微升电子多通道移液器，按照文本方案中制备的引物和探针，向每管加入2微升S-S-D-N-A。向每对引物中加入相应的正向引物、反向引物和探针。向探针组工作原液管中加入相应成分，以制备无模板对照（NTC）工作原液混合液。

根据此表格，将每种引物探针组各 14.3 µL 转移至相应的 NTC 工作储备混合管中。在取出配制 NTC 工作储备混合液所需的引物探针组后，向每管中加入 1.5 mL 水，使各引物探针组工作储备管的最终体积达到 1.7 mL。以制备包含引物探针组和 NTC 混合液的 96 孔源板。

将一个新的 96 孔板放入预冷的 96 孔冷却块中，并使用 250 微升电子多通道移液器，向各孔中加入相应的引物探针混合液或 NTC 混合液。向每份引物探针混合液对应的孔中加入 66 微升水。向四个目标 17 的孔中分别加入 82.5 微升水。

向每个抗C反应管中加入27.5 µL水。接下来，向指定的引物探针孔中加入54 µL正确的工作浓度引物探针。向指定的目标17引物探针孔中加入67.5 µL目标17引物探针工作液。

向指定孔中加入 22.5 微升的正确 NTC 工作储备液混合物。然后使用粘性板封膜密封 96 孔板，并在 700 ×g 条件下离心 1 分钟，确保液体沉降至 96 孔板适配器中各孔底部。将该板放入涡旋混合器中，以 1000 转/分钟（RP）混合 1 分钟。

然后以 700 ×g 离心 5 分钟。准备 384 孔检测板时，打开自动多通道移液器，双击软件图标以启动用于制备干扰素检测板的程序，用于建立检测平台。在平台位置 1 放置装满移液枪头的枪头盒，将 96 孔源板置于位置 4，将新的 384 孔板置于位置 6。

运行完成后，按下播放按钮开始运行。将384孔检测板轻轻在平坦表面上敲击，确保液体位于孔底，然后在以700 ×g离心1分钟后，贴上粘性板封膜。移除粘性板封膜。

将384孔检测板放入板式干燥仪中，并将384孔多通道管头置于孔板正上方。待384孔检测板内容物完全干燥后，贴上新的粘性板封，快速铝箔标签，并于4°C避光保存，直至使用时取出进行检测板的加载与运行。

通过将2微升S-S-D-N-A加入84.9微升水中，配制两种看家基因（HKG）反应液。然后，在每支标记好的HKG管中加入2微升稀释后的SSD NA、11.8微升水、23微升预混液和9.2微升对应的20×HKG引物探针组，涡旋混匀。在完成样本和阳性对照cDNA的制备后，向每个24微升的样本管和阳性对照管中分别加入78.8微升预混液和54.8微升水。为制备将添加至干燥的384孔检测板中的标准品和无模板对照（NTC）反应液，取一个1.5毫升离心管，加入165微升水至275微升预混液中，用于配制NTC反应液；另取一个1.5毫升离心管，将52.5微升水与52.5微升预混液混合。

从4摄氏度取出一个预先制备好的干燥384孔检测板，以700 ×g离心1分钟。使用30微升电子多通道移液器，向每个NTC孔中加入7.5微升NTC，充分混匀。

向每个标准品孔中加入6微升的标准品混合液和1.5微升的标准品。然后使用12.5微升电子多通道移液器，向指定的孔中加入7.5微升样品。使用光学粘性封板膜密封反应板后，以700 ×g离心1分钟；随后向指定的孔中加入2.5微升HKG引物探针混合液。将密封好的384孔板在涡旋混合器上以2,600 RPM涡旋2分钟，再以700 ×g离心5分钟。

最后，将密封的检测板放入实时荧光定量 PCR 仪中。打开检测布局的模板，并使用以下反应条件。启动运行，按照文本方案导出并分析数据，如本图所示，分析了来自六名供体的外周血单个核细胞（PBMCs）在经 Toll 样受体配体刺激后的人 I 型和 III 型干扰素表达特征。

数据以对数刻度的雷达图形式呈现，采用两种分析方法：一种是相对于看家基因归一化的绝对CQ值，另一种是每微克总RNA中模板的拷贝数。结果显示，在恒河猴（Resus Maccas）中，由TLR激动剂诱导的人干扰素表达谱具有配体特异性的I型和III型干扰素表达特征。在本实验中，PBMC来自三位供体，用三种配体刺激三小时，也显示出TLR配体特异性。

如图所示，未刺激细胞在基线状态下的干扰素亚型表达水平较低。对LPS和poly ic刺激，仅少数干扰素α亚型被表达。相比之下，对咪喹莫特刺激，干扰素表达水平较高，且亚型表达谱广泛，包括干扰素β和干扰素的广泛表达。

三种TLR激动剂均增强了Lambda一型的表达。观看本视频后，您应充分掌握如何制备、运行和分析3D四孔检测板，用于对I型和III型干扰素亚型等高度相似的基因群进行高通量分析。