Name: 高通量实时定量RT-PCR检测方法的确定I型和III型干扰素亚型的表达谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习高通量实时定量RT-PCR检测方法，用于分析I型和III型干扰素亚型的表达谱。该方法采用分子信标和锁核酸荧光探针技术，可区分高度相似序列间的单碱基差异，适用于感染性和自身炎症性疾病研究。

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本工作由 CBER/FDA-NIAID/NIH 机构间协议 YI-AI-6153-01、FDA/CBER 内部资金以及 FDA 医疗对策倡议项目资助。TCT、MNB、VPM、LMS 和 KDK 由橡树岭科学教育研究所管理的生物制品评价与研究中心研究参与项目资助，该项目由美国能源部与美国食品药品监督管理局之间的机构间协议支持。

1. 标准品系列稀释液的制备（图3A）
注意：将含有 Pr/Pb 引物组靶向序列的线性化质粒进行系列稀释，用作 qRT-PCR 检测的定量标准品。每种 IFN 亚型的标准品系列稀释液足以进行 90 块检测板的实验。用于检测的标准品稀释曲线的四个点位选择为覆盖 Ct 值在 20 至 32 范围内（表 3）。
<ol>
	<li>解冻标准品（50 pM）和鲑鱼精子DNA（SSDNA，10 mg/ml）储备液，涡旋混匀后短暂离心。</li>
	<li>通过将51 µl SSDNA与20.3 ml水混合，配制用于17个标准稀释系列的SSDNA/水混合液。</li>
	<li>为一个8联PCR管条标记，用于一个标准稀释系列。 
	注意：从储备液制备标准品系列稀释液需要2–3小时。</li>
	<li>向该管条中的第一管加入190 µl SSDNA/水混合液，向其余五管各加入180 µl SSDNA/水混合液。</li>
	<li>取10 µl的50 pM标准品储备液加入含190 µl SSDNA/水混合液的管中，进行1:20稀释，混匀；涡旋振荡并快速离心PCR管条。</li>
	<li>从最近一次稀释的管中转移20 µl至系列中的下一管，进行1:10稀释；涡旋振荡并快速离心PCR管条。</li>
	<li>重复步骤1.6，直至稀释系列的最后一管已加入标准品。</li>
	<li>对每个标准品重复步骤1.3–1.7。</li>
</ol>
见下表 3
2. 引物/探针（Pr/Pb）和无模板对照（NTC）工作储备液的配制（图3B）
注意：每1.7 ml Pr/Pb组工作储备液和128.6 µl无模板对照（NTC）工作储备液混合物可制备30块检测板。
<ol>
	<li>配制Pr/Pb组工作储备液混合物。 
	注意：从储备液配制Pr/Pb组和NTC工作储备液混合物需要2-3小时。
	<ol>
		<li>使用超纯水将引物和探针重悬至100 µM，用于制备储备液。</li>
		<li>标记最多十七个2 ml离心管，每管对应检测中包含的一个Pr/Pb组。</li>
		<li>解冻引物（100 µM）、探针（100 µM）和SSDNA（10 mg/ml）储备液，涡旋混匀并短暂离心。</li>
		<li>使用12.5 µl电子多通道移液器，向每管中加入2 µl SSDNA。向每个Pr/Pb组工作储备液管中加入相应的正向引物、反向引物和探针。人IFN亚型靶向的Pr/Pb组信息见表1，恒河猴Pr/Pb组信息见表2。加入超纯水，使每个Pr/Pb组工作储备液管的终体积达到200 µl。 
		注意：所需添加的引物、探针和水的体积取决于该Pr/Pb组在反应中的终浓度要求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制NTC工作储备液混合物。
	<ol>
		<li>标记两个5管PCR条排管，用于NTC工作储备液混合物。</li>
		<li>将每种Pr/Pb组各14.3 µl转移至对应的NTC工作储备液混合管中。NTC孔所用Pr/Pb组的组合信息见表4。向每个NTC工作储备液混合物中加入水，使终体积达到128.6 µl。</li>
		<li>涡旋混匀，短暂离心，并将管置于冰上避光保存，或于-20 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
见下表 4
<ol start="3">
	<li>稀释Pr/Pb组工作液。
	<ol>
		<li>在取出用于NTC工作液混合物所需的Pr/Pb组分装液后，加入1.5 ml水，使每管Pr/Pb组工作液的终体积达到1.7 ml。</li>
		<li>涡旋混匀，短暂离心，然后将试管置于冰上避光保存，或于-20 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用自动多通道移液器制备384孔检测板
<ol>
	<li>准备用于分装至384孔检测板的Pr/Pb试剂组和NTC混合液的96孔源板。 
	注意：从Pr/Pb工作储备液配制源板所需时间少于1小时。每块96孔源板足以制备六块384孔检测板（图3C）。
	<ol>
		<li>涡旋振荡并短暂离心Pr/Pb工作储备液和NTC工作储备液混合物。</li>
		<li>将一块新的96孔板置于预冷的96孔冷却块中，并标记各孔所对应的Pr/Pb试剂组或NTC混合液（见图2）。</li>
		<li>使用250 µl电子多通道移液器向96孔板中加入水：除Target 17的4个孔外，向每个Pr/Pb试剂组孔中加入66 µl水；向Target 17的4个孔中各加入82.5 µl水；向每个NTC混合液孔中加入27.5 µl水。</li>
		<li>向96孔板中对应孔加入正确的Pr/Pb工作储备液：除Target 17的4个孔外，向各Pr/Pb试剂组孔中加入54 µl相应的Pr/Pb工作储备液；向Target 17的Pr/Pb试剂组孔中加入67.5 µl Target 17 Pr/Pb工作储备液；向指定孔中加入22.5 µl相应的NTC工作储备液混合物。</li>
		<li>用粘性板封膜密封96孔板，并在700 × g条件下离心1分钟，确保液体沉至孔底。</li>
		<li>将96孔板放入涡旋混合器中（使用96孔板适配器），在1,000 rpm条件下混合1分钟，随后在700 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>若当天使用，将96孔源板避光保存于4 °C；否则保存于-20 °C直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动化多通道移液器向384孔检测板中添加Pr/Pb试剂组以制备检测板。 
	注意：从一块96孔源板制备六块检测板约需3–4小时。
	<ol>
		<li>在制板前，将冷却巢预冷至4 °C，将板蒸发仪预热至125 °C，底部加热块预热至80 °C，并保持20–25升&#160;每分钟（LPM）的气流。</li>
		<li>开启自动化多通道移液器，通过双击软件图标打开制备IFN检测板的程序。</li>
		<li>设置平台：在位置1放置装满移液枪头的盒，在位置4放置96孔源板，在位置6放置一块新的384孔板。按下播放按钮开始运行。 
		注意：运行完成后，每孔将含有5 µl Pr/Pb混合液。 
		注意：每孔384孔检测板中最终加入的ssDNA量为0.025 µg。</li>
		<li>轻轻敲击384孔检测板的表面，确保液体位于孔底，然后贴上粘性板封膜。</li>
		<li>在700 × g条件下离心1分钟。撕去粘性板封膜，将384孔检测板放入板干燥仪中，并将384孔歧管正对孔上方放置。</li>
		<li>当384孔检测板内容物完全干燥后，贴上新的粘性板封膜，用铝箔包裹，贴标签，并避光保存于4 °C直至使用。 
		注意：检测板可在4 °C下保存至少6个月。</li>
		<li>重复步骤3.2.3–3.2.6，直至完成6块384孔检测板的制备，或96孔源板中的液体耗尽。</li>
		<li>关闭冷却巢，退出软件，关闭自动化多通道移液器。关闭板干燥仪。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 加载和运行384孔检测板
<ol>
	<li>准备两种看家基因（HKG）反应孔混合液，每种包含针对一个看家基因的Pr/Pb引物探针组合、SSDNA、PCR预混液和水，用于加入已预先干燥的384孔检测板中图3D). 
	注意：配制混合液并加样至检测板需要 1–2 小时。运行检测板所需时间少于 2 小时。
	<ol>
		<li>为每个HKG混合液标记一个1.5 ml离心管。</li>
		<li>将2 µl SSDNA（10 mg/ml）与84.9 µl水混合稀释。取2 µl稀释后的SSDNA，加入11.8 µl水、23 µl预混液和9.2 µl正确的20x HKG Pr/Pr引物探针组至各管中，涡旋混匀后短暂离心。</li>
		<li>使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和泛素C（UBC）作为人源检测中的HKG（参见 材料表）。使用 GAPDH 以及18S核糖体RNA作为恒河猴检测的HKG。 
		注意：用于进行检测的HKG可根据具体情况灵活选择，应反映所测试细胞类型中适宜的基因。 GAPDH, 不列颠哥伦比亚大学（UBC），以及 18S 是常用看家基因（HKG）的示例；其他看家基因可能更合适。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备样本和阳性对照孔反应混合液，包含样本或阳性对照cDNA、主混合液和水，用于加入预置干燥的384孔检测板中。样本和阳性对照混合液需制备足量，以满足21个孔的加样需求（图3D).
	<ol>
		<li>在进行 cDNA 合成之前，按照试剂盒说明书对 RNA 样本进行 DNase 消化处理。</li>
		<li>提前准备样品和阳性对照：取至少 500 ng RNA 进行 cDNA 合成，随后按照制造商说明书用 RNase H 处理（每份样品终体积为 24 µl）。将制备好的 cDNA 储存于 -20 °C，直至使用。使用前解冻样品 cDNA，涡旋混匀并短暂离心。</li>
		<li>向每个24 µl样本和阳性对照管中加入78.8 µl的主混合液和54.8 µl的水。</li>
		<li>涡旋并短暂离心试管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制标准品和NTC孔的混合液，包含预混液和水，用于加入到干燥的384孔检测板中（图3D）。标准品混合液的配制：在1.5 ml离心管中，将165 µl水与275 µl预混液混合。无模板对照（NTC）混合液的配制：在1.5 ml离心管中，将52.5 µl水与52.5 µl预混液混合。涡旋振荡并短暂离心各管。</li>
	<li>准备一个干燥的384孔检测板，用于加入混合液和样品。
	<ol>
		<li>从4 °C取出一个干燥的384孔检测板，以700 × g离心1分钟。</li>
		<li>将培养板置于预冷的384孔冷却块上，移除粘性板封膜，并标记板上的孔位，以标明不同混合液和样品的加样位置（图1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将384孔检测板加入标准品孔混合液、标准品、NTC孔混合液、样本、阳性对照和HKG混合液（图3E). 使用前对所有溶液进行涡旋振荡并短暂离心。
	<ol>
		<li>使用30 µl电子多通道移液器，将6 µl标准品混合液加入每个标准品孔中。使用12.5 µl电子多通道移液器，将1.5 µl相应的标准品系列稀释液加入指定孔中。</li>
		<li>使用30 µl电子多通道移液器，向每个NTC孔中加入7.5 µl NTC孔混合液。使用30 µl电子多通道移液器，向指定孔中加入7.5 µl样本。使用12.5 µl电子多通道移液器，向指定孔中加入2.5 µl HKG引物/探针混合液。</li>
		<li>使用30 µl电子多通道移液器，向所有空孔中加入7.5 µl剩余的水和预混液混合物；仅加入7.5 µl水亦可。</li>
		<li>用光学粘性封膜密封384孔检测板，并在700 × g下离心1分钟。将密封后的384孔板在涡旋混合器中以2,600 rpm涡旋振荡2分钟，然后在700 × g下离心5分钟。</li>
		<li>将密封的384孔检测板放入qRT-PCR仪中，打开该检测布局的模板并开始运行。 
		注意：结果可导出为电子表格或文本文件，以便进行分析。</li>
		<li>使用以下最佳的热循环仪反应条件进行检测：i) 50 °C 2分钟，ii) 95 °C 10分钟，iii) 95 °C 25秒，iv) 59 °C 1分钟。重复步骤iii和iv共40个循环。</li>
		<li>将qRT-PCR平台的原始数据导出至电子表格应用程序。将每组4点标准品数据绘制成标准曲线以评估线性关系。通过计算∆Cq值或基于4点标准曲线的拷贝数进行数据分析。27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
见下图 3

<ol><li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li>
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</ol>

VPM 和 RLR 是用于检测 I 型和 III 型干扰素亚型表达的技术的共同发明人，并由此技术获得专利收入。其余作者声明无利益冲突。

本报告描述了一种在科研实验室环境中用于检测一组高度相似基因转录水平的检测方法的设计、批量生产及分析策略。本文报道的高通量qRT-PCR检测方法可高度特异性地检测IFN-和λ亚型。该方法包含两个关键方面：一是设计能够区分同源基因家族中不同成员的引物/探针（Pr/Pb）组合，二是建立一个可生产稳定且一致的384孔预装Pr/Pb组合检测板的生产平台。qRT-PCR探针采用了结构修饰（分子信标，MB）或化学修饰（锁核酸，LNA）策略以提高其特异性29。在恒河猴检测体系的两对引物组中（表2），引物序列中引入了扩增阻碍突变系统（ARMS），以进一步增强特异性30。尽管通常为提高qRT-PCR反应的特异性应优先靶向外显子-外显子连接区域，但由于Ⅰ型IFN基因不含内含子，此策略不可行。因此，PCR反应中将扩增基因组DNA，故需在RNA提取后通过DNase处理将其降解。
Pr/Pb 引物组的靶区域被限定为每种干扰素（IFN）成熟肽的编码区。由于 IFN-α 亚型之间，尤其是成熟肽区域的序列高度相似，在某些情况下，为了确保特异性，不得不在灵敏度上做出妥协。IFN-α17 就是典型例子，其成熟肽转录本与其他 IFN-α 亚型相比，仅有四个独特的碱基。针对 IFN-α17 的引物设计必须结合多个亚型的转录本，因此特异性只能依赖于探针。结果是，PCR 反应会扩增除 IFN-α17 以外的其他亚型，从而消耗大量 PCR 试剂，并降低 IFN-α17 特异性探针的荧光信号强度。针对 IFN 等高度相似基因设计灵敏且特异的 Pr/Pb 引物组时，另一个挑战在于 GenBank 数据库中注释的序列在设计时可能并不完整或全面。这一点在 IFN-α17 上再次体现，新近注释的序列与设计时数据库中的序列版本无法完全比对。因此，在针对尚未深入研究的基因设计 Pr/Pb 引物组时，定期核查目标基因的最新注释序列是十分必要的。最后，必须确保 Pr/Pb 引物组不会扩增可能被转录但不被翻译的假基因。
设计好引物/探针（Pr/Pb）组合后，下一步的挑战是在一个384孔板上对十七种不同的Pr/Pb组合优化PCR反应条件。转录本标准品在检测Pr/Pb组合特异性方面至关重要，并且对于协调大量不同PCR反应的qRT-PCR条件必不可少。通过转录本标准品对Pr/Pb组合进行测试，可确定其扩增效率和灵敏度；在某些情况下，可能需要使用表达高度相似假基因的质粒，以确保该Pr/Pb组合能够特异性地检测功能基因的转录。此外，转录本标准品还提供了定量分析手段（转录本数量），而不仅仅是相对于看家基因的半定量分析（ΔCq）。
使用机器人多通道移液系统将96孔源板中的样品移取至多个384孔检测板中，可提高板间结果的精确性和一致性。鲑鱼精子DNA（SSDNA）作为载体，可稳定并长期保存Pr/Pb试剂组，同时将分装至孔板中的试剂进行干燥处理也能实现类似效果。对孔板进行干燥还可减少获得可重复结果所需的反应体积，从而保护珍贵样品并减少昂贵试剂的使用。通过上述步骤制备的孔板批次可在六个月以上的时间内保持高精度和一致性。
在完成平板制备后，质量控制措施对于检测一批平板的一致性至关重要。为此，需在每块平板上额外运行四组标准品。“5x标准”平板用于追踪实验性能，并生成一个数据集，用于与单个平板上的标准品结果进行比较。在实验设计过程中，每种标准品会进行10次10倍稀释，但由于空间限制，每块检测平板以及5x标准平板上仅使用其中四个点构建标准曲线。此外，每块平板还应包含一个阳性对照，以确保平板结果的有效性。
通常，从一个Pr/Pb来源板制备六个检测板需要3-4小时；在研究实验室中，单日完成十二块板的制备是可行的。由于每块人干扰素（IFN）亚型检测板可检测十七个Pr/Pb组合，并可容纳十五个实验样本，因此一天的组装工作所产生的板批次最多可生成3,060个实验数据点。来自qRT-PCR平台的原始数据可通过电子表格应用软件中的编程脚本进行处理和整合，自动填充预设的分析模板。该方法最大限度减少了手动数据录入，从而避免了复制错误，并使研究人员能够专注于数据分析而非数据整理。如本文所述，这种高通量qRT-PCR检测可用于测定人或恒河猴样本中干扰素亚型的表达，也可经调整后用于其他物种或同源基因集。该检测板布局具有灵活性，用户可根据特定细胞类型或模型系统更换引物/探针组合，以定制目标基因。该方法可用于在病原体研究的细胞培养模型或疾病模型中的患者样本中测定IFN表达特征，以阐明免疫应答中涉及的信号传导机制。

I型和III型干扰素（IFN）在机体针对病毒及其他病原性刺激的免疫应答中发挥关键作用，存在于所有脊椎动物中1。免疫细胞和非免疫细胞均可表达并分泌干扰素，同时也可对干扰素产生应答2。先天免疫感受器（如Toll样受体（TLR）、STING和RIG-I）在识别病原体相关分子模式（PAMP）后，可诱导I型和III型干扰素的表达3,4。在人类中，I型干扰素包括IFN-β、-ω、-κ以及12种亚型的IFN-α，它们结合于IFNAR1/IFNAR2受体复合物2,5。III型干扰素包括IFN-λ1、-λ2和-λ3，结合于IL10RB/IL28RA受体复合物2。经典途径中，I型和III型干扰素分别与其特异性受体复合物结合，进而募集STAT1/STAT2异源二聚体，启动干扰素刺激基因（ISG）的转录6。ISG参与多种生物学功能，包括抗病毒和抗增殖活性，以及适应性免疫应答的激活7。
病原体已进化出多种机制来逃避、破坏和劫持干扰素（IFN）信号通路中的组分，这表明干扰素在先天免疫应答中具有重要作用8。例如，痘苗病毒表达一种具有IFNAR1同源性的诱饵受体，可结合并隔离I型干扰素9，而类似雅巴病毒则分泌一种糖蛋白，抑制I型和III型干扰素蛋白的功能10。除了在宿主防御中的作用外，干扰素还参与肿瘤监视以及多种自身炎症性疾病的发病过程：乳腺癌细胞中干扰素表达的沉默会限制免疫监视11，IFN-α的过度产生是系统性红斑狼疮发病的机制之一12，而STING的异常激活会导致干扰素过量，从而引发STING相关血管病中的系统性炎症13。在治疗方面，干扰素被用于治疗多发性硬化症14、慢性病毒感染（如乙型肝炎病毒15和丙型肝炎病毒16,17）以及某些癌症，例如毛细胞白血病18和慢性粒细胞白血病19。关于干扰素在特定生理过程中作用的研究不断揭示出这一细胞因子家族的广泛生物学意义。
I型干扰素（IFN），尤其是IFN-α亚型，通常被视为单一实体20-23，而非一组密切相关但各不相同的蛋白质。多种IFN物种（包括IFN-α亚型）在脊椎动物进化过程中长期存在24，表明其中至少有一部分亚型具有特定或独特的功能。明确IFN表达的模式可能有助于解析并表征一种或多种亚型的具体功能17。研究I型和III型IFN亚型的难点在于它们具有较高的序列同源性：12种IFN-α亚型的氨基酸序列相似度超过&#62;50%25，而IFN-λ亚型之间的氨基酸序列相似度则为81–96%26。在本研究所描述的qRT-PCR检测中，分子信标（MB）和锁核酸（LNA）荧光探针能够区分高度相似的IFN亚型序列之间的单个碱基对差异，从而实现对IFN表达特征的鉴定。该检测采用384孔板格式，同时包含定量（转录本标准品）和半定量（看家基因，HKG）分析指标，可分别用于基于转录本拷贝数和∆Cq值的分析。通过自动化多通道移液器实现批量制备，以及将引物/探针（Pr/Pb）组合干燥保存于板上以实现长期储存，显著提高了该检测方法的可重复性、适用性和实用性。
本方案描述了制备384孔qRT-PCR检测板的流程（图1），每块板最多可包含十七种不同的引物/探针（Pr/Pb）组合，用于靶向人干扰素（IFN）亚型（表1）。通过使用引物/探针组合工作液来源板（图2），可在多块384孔检测板的制备过程中实现操作，该过程可采用机器人多通道移液器进行自动化操作。尽管最初的重点是建立用于研究人IFN表达特征的实验方案，但该方法也已应用于恒河猴。尽管板式布局略有不同，且引物/探针组合（表2）各不相同，但制备人源和恒河猴源检测板的整体方法完全相同。通过对该方案进行少量修改，该方法还可用于开发针对其他密切相关基因群的研究检测。
见下图 1 和图 2
见下文表1和表2

<table><tbody><tr><td>0.2 ml PCR管条&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>E0030 124 286</td><td></td></tr><tr><td>12通道384等量电子移液器，0.5–12.5 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-139</td><td>*已停产</td></tr><tr><td>12通道384等量电子移液器，1–30 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-137</td><td>*已停产</td></tr><tr><td>12通道电子移液器，5–250 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-118</td><td>*已停产</td></tr><tr><td>2.0 ml 微型离心管，无菌</td><td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>8通道电子移液器，15–1250 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-115</td><td>*已停产</td></tr><tr><td>一次性试剂储液槽&amp;nbsp;</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>89094-668</td><td>25 mL 储液槽，带2个分隔</td></tr><tr><td>E-Centrifuge</td><td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td><td>1090003</td><td></td></tr><tr><td>真核生物18S rRNA (18S)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs99999901_s1</td><td>恒河猴HKG引物/探针组</td></tr><tr><td>固定转速迷你涡旋混合器</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>透气性压敏板密封膜</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB-0580</td><td>板制备过程中使用的一次性板密封膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>定制订单</td><td>人HKG引物/探针组</td></tr><tr><td>甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Rh02621745_g1</td><td>恒河猴HKG引物/探针组</td></tr><tr><td>Hudson Solo自动化多通道移液器&amp;nbsp;</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800200</td><td>配备384孔冷却模块的改装型号</td></tr><tr><td>线性化质粒 (IFN基因)</td><td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td><td>定制订单</td><td>货号3000、3580；用于检测标准品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LNA抑制剂</td><td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td><td>定制订单</td><td>货号500100</td></tr><tr><td>LNA探针</td><td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td><td>定制订单</td><td>材料编号VC00023</td></tr><tr><td>Matrix过滤移液吸头，12.5 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-193</td><td></td></tr><tr><td>Matrix过滤移液吸头，30 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-196</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip加长移液吸头，1,250 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-160</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip加长移液吸头，250 µl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-152</td><td></td></tr><tr><td>带条形码的MicroAmp光学384孔反应板</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学96孔反应板</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学压敏膜</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4311971</td><td>qRT-PCR运行前用于密封反应板的压敏膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010电子表格</td><td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&amp;nbsp;</td><td>Office 2010</td><td>Visual Basic编程语言&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MixMate涡旋混合器</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>5353 000.014</td><td>二维板式涡旋混合装置</td></tr><tr><td>分子信标探针</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>PCR冷却器，用于96孔板和PCR管的无冰冷藏系统</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>板干燥器（歧管）</td><td>NIH研究服务办公室机械与电气设计制造部 (Bethesda, MD, USA)</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>引物组</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>pUC57质粒DNA</td><td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 1.5 ml 微量离心管</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>无RNase DNase试剂盒（50）</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒（250）</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>机器人移液吸头（透明、预灭菌吸头）</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800350-S</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子DNA溶液</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>SoftLinx Version V</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>定制订单</td><td>用于编程移液步骤的软件</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x)，不含AmpErase UNG</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>ABgene压敏板密封膜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB0580</td><td></td></tr><tr><td>泛素C (UBC)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs01871556_s1</td><td>人HKG引物/探针组</td></tr><tr><td>Verso cDNA合成试剂盒</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td><td>351-029-101</td><td></td></tr><tr><td>Zipvap 384（板干燥器加热元件）</td><td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td><td>384-109A</td><td>板干燥器</td></tr></tbody></table>

高通量定量实时rt-pcr检测法用于确定i型和iii型干扰素亚型的表达谱

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

本报告描述了一种在384孔板中分析十七种人类干扰素（IFN）亚型的qRT-PCR检测方法，该方法结合了高度特异性的锁核酸（LNA）和分子信标（MB）探针、转录本标准品、自动化多通道移液以及平板干燥技术。I型干扰素（IFN）的表达检测，尤其是十二种IFN-α亚型，受限于它们高度相似的序列同源性；同样，III型干扰素（特别是IFN-λ2和IFN-λ3）的序列也极为相近。本检测方法为十七种干扰素亚型转录本的表达分析提供了一种可靠、可重复且相对经济的手段。

所述qRT-PCR检测可用于分析多种细胞类型和条件下I型和III型干扰素（IFN）的表达模式。例如，分析了来自6名供体的外周血单个核细胞（PBMC）在经Toll样受体（TLR）配体刺激后的人I型和III型IFN表达特征；所用配体包括聚肌胞苷酸（poly I:C，25 μg/ml）、脂多糖（LPS，10 ng/ml）、咪喹莫特（imiquimod，10 μM）和CpG寡核苷酸（1 μM）（图4）。数据使用电子表格应用软件进行分析，并以雷达图形式展示，其中IFN-α亚型按照其蛋白序列的系统发育树顺时针排列27。人IFN表达的雷达图采用对数刻度表示，该刻度基于检测设计中包含的两种不同分析方法：相对于持家基因（HKG）归一化的绝对Cq值（ΔCq），以及每微克（μg）总RNA中模板的拷贝数。拷贝数数值由转录本标准曲线的结果计算得出。数据表明，TLR激动剂诱导的人IFN表达特征具有配体特异性。
见下文图4
如人类干扰素（IFN）表达谱所示，恒河猴的I型和III型干扰素表达谱也具有Toll样受体（TLR）配体特异性。来自3名供体的外周血单个核细胞（PBMC）分别用聚肌胞苷酸（poly I:C，50 μg/ml）、脂多糖（LPS，10 μg/ml）和咪喹莫特（imiquimod，10 μg/ml）刺激3小时（图5）。未刺激细胞在基线时的IFN亚型表达水平较低。LPS和poly I:C仅诱导少量IFN亚型表达。相比之下，咪喹莫特刺激引起的IFN表达水平较高，且亚型表达谱更广泛。所有三种TLR激动剂均可增强IFN-β和IFN-λ1的表达28。
见下图 5
<img alt="基因表达分析，热图，qPCR结果，靶标检测，样本比较分析。" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：含十七组Pr/Pb引物探针组合的384孔检测板布局。 靶标编号对应一组Pr/Pb引物探针组合。四点标准曲线（深灰色三角形）加入第1至第5列。内参基因（HKG）Pr/Pb组合（白色背景）加入第6列和第7列。其余第8至第24列分别用于十七组Pr/Pb组合中的某一组。样本加入第A至P行、第6至第24列（黑色箭头所示）。第5列底部两个孔（O5、P5）仅加入水和预混液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于DNA扩增的PCR板布局；包含目标孔和NTC孔的示意图，用于污染控制。" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：含十七组Pr/Pb引物探针组合的96孔源板布局。 目标编号指一组Pr/Pb引物探针组合。黑色箭头表示某组Pr/Pb引物探针被加入多个孔中。NTC混合液被加入指定孔位（深灰色背景）。带有斜线的两个孔（F3、G3）未使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="PCR 设置工作流程图，详细说明系列稀释、引物混合物制备和 384 孔板加样步骤。" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：qRT-PCR 检测方案中特定步骤的示意图。 A-E 图示了该方案的若干关键部分。(A) 步骤 1：标准品系列稀释液的制备。(B) 步骤 2：Pr/Pb 和无模板对照（NTC）工作储备混合液的制备。(C) 步骤 3.1：制备包含 Pr/Pb 组和 NTC 混合液的 96 孔工作储备板。(D) 步骤 4.1-3：为加样至 384 孔检测板而进行的混合液制备。(E) 步骤 4.5：向 384 孔检测板加样。图示阅读顺序为从左上角至右下角。干扰素（IFN）检测所用试剂储存于 -20 oC，列于左侧栏；方案中的各操作步骤以横线分隔。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="ΔCq and Copy # spider charts analyzing gene expression, using control, Poly I:C, LPS, Imiquimod, CpG." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4：外周血单个核细胞（PBMC）中人干扰素表达特征对不同TLR配体刺激的响应存在差异。 PBMC 经 TLR 配体刺激后，收集 RNA 进行 qRT-PCR 分析。对聚肌胞苷酸（poly I:C）刺激的峰值反应取几何平均值（25 μg/ml) 在8小时（红色方块）、LPS（10 ng/ml）在4小时（绿色三角形）、咪喹莫特（10 μM) 在16小时（紫色菱形）、CpG（1 μM16小时刺激组（黑色圆圈）和16小时未刺激对照组（蓝色圆圈）来自6名供体，数据以对数形式显示10 作为持家基因（HKG）表达的函数的量表 UBC ΔCq（左侧）或每拷贝数 μg RNA（右侧）。IFN-α亚型按照氨基酸序列相似性的系统发育图进行排序。该图最初发表于《免疫学与细胞生物学》27.
<img alt="Poly I:C, LPS, Imiquimod radar charts; ΔCq and Copy #; gene expression comparison." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5：恒河猴外周血单个核细胞（PBMC）中干扰素表达特征对不同TLR配体刺激的响应存在差异。 从三只恒河猴（分别以方形、菱形和三角形标记）的全血中分离出外周血单个核细胞（PBMC），并用脂多糖（LPS）进行刺激（10 μg/ml），聚肌胞苷酸（poly I:C）（50 μg/ml）或咪喹莫特（10 μg/ml)。在 TLR 刺激 0 小时（空心图形）或 3 小时（实心图形）后收集细胞，用于检测 IFN 表达。I 型、II 型和 III 型 IFN 的转录水平以对数形式显示10 作为HKG表达量函数的量表 GAPDH ΔCq（左）或拷贝数/μg RNA（右侧）。该图最初发表于《干扰素与细胞因子研究杂志》（Journal of Interferon and Cytokine Research）28.
<img alt="干扰素基因测序的PCR引物表；GenBank登录号、引物序列、位置。" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1：人干扰素（IFN）引物/探针序列及反应信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>
<img alt="显示基因序列、位置和浓度的PCR引物设计表格。" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 2"> 
表2：恒河猴IFN引物/探针序列及反应信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">质粒浓度 (fM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α1</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α2</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α4</td>
			<td>2500</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α5</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α6</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α7</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α8</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α10</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α14</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α16</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α17</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α21</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ1</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ2</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ3</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-β</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-ω</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：标准稀释系列浓度信息。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>添加的 IFN Pr/Pb 组</td>
			<td>添加的水体积 (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 1</td>
			<td>IFN-β, -ω, -λ3</td>
			<td>85.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 2</td>
			<td>IFN-α1, -α5</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 3</td>
			<td>IFN-α2</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 4</td>
			<td>IFN-α4</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 5</td>
			<td>IFN-α7</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 6</td>
			<td>IFN-α6, -α8, -α10</td>
			<td>85.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 7</td>
			<td>IFN-α14, -α16</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 8</td>
			<td>IFN-α17</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 9</td>
			<td>IFN-α21, -λ1</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 10</td>
			<td>IFN-λ2</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：NTC工作储备液混合物信息。

本方案描述了一种用于分析I型和III型干扰素（IFN）表达特征的高通量qRT-PCR检测方法。该检测方法能够区分这些基因高度相似转录本之间的单个碱基对差异。通过批量制备和机器人移液操作，确保了检测的一致性和可重复性。

高通量定量实时RT-PCR检测法用于确定I型和III型干扰素亚型的表达谱

本报告描述了一种在384孔板中进行的qRT-PCR检测方法，用于分析十七种人干扰素亚型，该方法采用了高度特异性的……

本实验的总体目标是制备并运行384孔检测板，用于对高度同源的基因群（如Ⅰ型和Ⅲ型干扰素亚型）进行高通量分析。首先制备用于运行检测板的标准系列稀释液，然后配制用于制板的引物探针工作液以及无模板对照工作液混合物。然后使用自动多通道移液器制备384孔检测板，并干燥后储存。最后，运行并分析384孔检测板。最终，高通量定量实时RT-PCR检测可用于定义组织培养模型中、病原体研究中或感染性及自身炎症性疾病背景下临床样本中的干扰素表达特征。与现有的定量 R 二 PCR 技术（使用标准线性探针或 SYBR Green）相比，该方法的主要优势在于能够利用分子信标和锁核酸荧光探针来区分高度相似序列之间的单个碱基对差异。解冻后，将标准品和鲑鱼精子 S-S-D-N-A 进行涡旋振荡并短暂离心。通过将 51 微升 S-S-D-N-A 与 20.3 毫升水混合，制备用于 17 个标准稀释组的 SS DNA 水混合液。取 190 微升 SS DNA 水混合液加入八联 PCR 管条的第一个管中，随后向接下来的五个管中各加入 180 微升。通过将10微升50皮摩尔标准储备液转移至含有190微升S-S-D-N-A水混合液的离心管中，进行1比20稀释，涡旋混匀后迅速离心。在PCR排管中，通过将20微升来自最近稀释的离心管转移至系列中的下一个离心管，进行1比10稀释，涡旋混匀后迅速离心PCR排管。重复1比10稀释，直至系列中的最后一个离心管接收到标准品。在标记最多17个2毫升离心管后，使用12.5微升电子多通道移液器，根据文本方案中制备的引物和探针，向每管加入2微升S-S-D-N-A。向每对引物中加入相应的正向引物、反向引物和探针。向探针组工作原液管中加入适当成分，以制备无模板对照（NTC）工作原液混合液。根据此表格，将每种引物探针组各14.3微升转移至相应的NTC工作储备混合管中。在取出用于NTC工作储备混合液所需的引物探针组后，向每管中加入1.5毫升水，使各引物探针组工作储备管的最终体积达到1.7毫升。随后，制备包含引物探针组和NTC混合液的96孔源板。将一个新的96孔板放入预冷的96孔冷却块中，并使用250微升电子多通道移液器，根据正确的引物探针组或NTC混合液标记各孔。向每个引物探针组中加入66微升水。向四个目标17孔中每孔分配82.5微升水。向每个抗C反应混合液中加入27.5微升水。接下来，将54微升正确的工作浓度引物探针加入指定的引物探针孔中。向指定的靶标17引物探针孔中加入67.5微升靶标17引物探针工作液。向指定的孔中加入 22.5 微升正确的 NTC 工作液混合物。然后使用粘性板密封膜密封 96 孔板，并在 700 ×g 条件下离心 1 分钟，以确保液体位于 96 孔板适配器中各孔的底部。将板放入涡旋混合器中，在 1000 rpm 条件下混合 1 分钟。然后以 700 ×g 离心 5 分钟。准备 384 孔检测板时，打开自动多通道移液器，双击软件图标以启动用于制备干扰素检测板的程序，从而建立检测平台。将装满移液器吸头的盒子放入平台位置 1，将 96 孔源板放入位置 4，将新的 384 孔板放入位置 6。运行完成后，按下播放按钮开始运行。将384孔检测板轻轻在平坦表面上敲击，确保液体位于孔底，然后在以700 ×g离心1分钟后，贴上粘性板封膜。移除粘性板封膜。将384孔检测板放入板式干燥仪中，并将384孔多通道管头置于孔板正上方。待384孔检测板内容物完全干燥后，贴上新的粘性板封，快速铝箔标签，并于4°C避光保存，直至使用时取出进行检测板的加载与运行。通过将2微升S-S-D-N-A加入84.9微升水中，配制两种看家基因（HKG）反应液。然后，在每个标记好的HKG管中加入2微升稀释后的SSD NA、11.8微升水、23微升预混液以及9.2微升对应的20×HKG引物探针组合，涡旋混匀。在完成样本和阳性对照cDNA的配制后，向每个24微升的样本管和阳性对照管中分别加入78.8微升预混液和54.8微升水。为制备将添加至干燥的384孔检测板中的标准品和无模板对照（NTC）反应液，取275微升预混液与165微升水加入1.5毫升离心管中配制NTC反应液；另取52.5微升预混液与52.5微升水加入1.5毫升离心管中配制标准品反应液。从4摄氏度取出先前制备的干燥384孔检测板，以700 ×g离心1分钟。使用30微升电子多通道移液器，向每个NTC孔中加入7.5微升NTC，充分混匀。向每个标准品孔中加入6微升标准品混合液和1.5微升标准品。然后使用12.5微升电子多通道移液器，向指定的样品孔中加入7.5微升样品。使用光学粘性密封膜密封反应板后，加入2.5微升HKG引物探针混合液至指定孔中，于700 ×g离心1分钟；将密封的384孔板在涡旋振荡器上以2,600 RPM振荡2分钟，再于700 ×g离心5分钟。最后，将密封的检测板放入Q-R-T-P-C-R仪中。打开检测布局的模板，并使用以下反应条件。启动运行，按照文本方案导出并分析数据，如本图所示，分析了来自六名供体的外周血单个核细胞（PBMCs）经Toll样受体配体刺激后的人I型和III型干扰素表达特征。数据以对数刻度的雷达图形式呈现，采用两种分析方法：一种是相对于看家基因归一化的绝对CQ值，另一种是每微克总RNA中模板的拷贝数。结果显示，在恒河猴中，TLR激动剂诱导的人干扰素表达特征为I型和III型干扰素的配体特异性表达特征。在本实验中，PBMC也表现出TLR配体特异性，来自三位供体的PBMC用三种配体刺激三小时。如图所示，未刺激细胞在基线状态下的干扰素亚型表达水平较低。在脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（poly I:C）刺激下，仅有少数干扰素α亚型被表达。相比之下，咪喹莫特刺激诱导的干扰素表达水平较高，且亚型表达谱广泛，包括干扰素β和多种干扰素亚型的表达。三种TLR激动剂均增强了Lambda 1的表达。在观看本视频后，您应充分理解如何制备、运行和分析3D四孔检测板，以对I型和III型干扰素亚型等高度相似的基因群进行高通量分析。

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