高通量实时定量RT-PCR检测方法的确定I型和III型干扰素亚型的表达谱

该程序的总体目标是准备和运行 384 孔检测板，用于对高度同源的基因组进行高通量分析，例如 1 型和 3 型干扰素亚型。这是通过首先制备用于运行检测板的标准连续稀释液来实现的。接下来，制备用于制备板的引物探针和无模板对照工作储备液混合物。

然后使用自动多通道移液器制备 384 孔分析板，并将其干燥以储存。最后，运行 384 孔测定板并进行分析。最终，高通量定量实时 RT PCR R 检测用于定义组织培养模型中的干扰素表达特征，研究病原体或在感染性或自身炎症性疾病背景下的临床样本中。

与使用标准线性探针或 cyberg green 的定量 R two PCR 等现有方法相比，该技术的主要优点是分子信标和锁定核酸荧光探针可用于区分高度相似序列之间的单碱基对差异解冻后，涡旋并短暂离心标准和鲑鱼精子或 S-S-D-N-A。通过将 51 微升 S-S-D-N-A 与 20.3 毫升水混合，制备 SSD NA 水混合物，用于 17 个标准稀释组。将 190 μL SS DNA 水混合物分配到 8 管 PCR 试管的第一管中，将 180 μL 分配到接下来的 5 管中。

10 μL 从 50 Picomolar 标准储备液中转移到装有 190 μL S-S-D-N-A 水混合物的试管中，涡旋并快速离心，进行 1 至 20 稀释。PCR 试纸条通过将 20 μL 从最近稀释的试管转移到系列涡旋中的下一个试管中，并快速离心 PCR 试纸条，进行 1 比 10 的稀释。重复 1 至 10 次稀释，直到系列中的最后一管收到标准品。

在标记多达 17 个 2 毫升试管后，使用 12.5 微升电子多通道移液器，使用根据文本方案制备的引物和探针向每个试管中加入 2 微升 S-S-D-N-A。向每个引物中添加适当的正向引物、反向引物和探针。探针组工作储备管以制备无模板对照或 NTC 工作储备液混合物。

根据此表，将 14.3 μL 的每种引物探针组转移到适当的 NTC 工作储备液混合管中。去除 NTC 工作储备液所需的引物探针组的 Eloqua 后，在 1.5 毫升水中混合，使每个引物探针组工作储备管的最终体积达到 1.7 毫升。制备引物探针组和 NTC 混合物的 96 孔源板。

将新的 96 孔板置于冷却的 96 孔冷却块中，并使用 250 微升电动多通道移液器用正确的引物探针组或 NTC 混合物指定孔。向每个引物探针组中加入 66 微升水。井向 4 个 Target 17 井分配 82.5 微升水。

将 27.5 微升水分配到每种抗 C 混合物中。接下来，在孔分配时，将 54 微升工作原液中的正确引物探针添加到指定的引物探针中。67.5 μL 靶标 17 引物探针工作套装原液在孔中加入指定的靶标 17 引物探针。

将 22.5 微升正确的 NTC 工作原液混合物添加到指定的孔中。然后使用粘板密封件密封 96 孔板，并以 700 Gs 离心 1 分钟，以确保内容物使用 96 孔适配器位于孔底部。将板放入涡旋混合器中，以 1000 RP 混合 1 分钟。

然后以 700 Gs 离心板 5 分钟。要制备 384 孔检测板，请打开自动多通道移液器，然后双击软件图标以打开用于制作干扰素检测板的方案，以设置平台。将一个完全装满的移液器吸头盒放在平台 1 位置，将 96 孔源板放在位置 4，将新的 384 孔板放在位置 6。

运行完成后，按下播放按钮开始运行。在平坦的表面上轻轻敲击 384 孔检测板，以确保液体位于孔底部，并在以 700 Gs 离心板 1 分钟后贴上粘板密封。取下粘合板密封件。

将 384 孔检测板放入板式干燥器中，并将 384 孔歧管直接放置在孔上方。一旦 384 孔检测板内容物干燥。贴上新的粘性板密封，快速贴上铝箔标签，并在 4 摄氏度的黑暗中储存，直到用于加载和运行检测板。

通过在 84.9 微升水中稀释两微升 S-S-D-N-A，制备两种管家基因或 HKG 井混合物。然后将 2 微升稀释的 SSD NA、11.8 微升水、23 微升预混液和 9.2 微升正确的 20 XHKG 引物探针组添加到每个标记的 HKG 管中，涡旋，并在制备样品和阳性对照 CDNA 后以 78.8 微升预混液和 54.8 微升水向每个 24 微升样品和阳性对照管中短暂离心。为了制备要添加到干燥的 384 孔测定板中的标准品和 NTC 孔混合物，在 1.5 mL 试管中加入 165 μL 水和 275 μL 预混液，对于 NTC 孔混合物，在 52.5 μL 水中与 52.5 μL 预混液在 1.5 mL试管中。

从 4 摄氏度中取出先前制备的干燥 384 孔检测板，并以 700 GS 离心 1 分钟。使用 30 μL 电动多通道移液器分配 7.5 μL NTC。充分混合到每个 NTC 中。

将 6 μL 标准品充分混合，向每个标准品中分配 1.5 μL 标准品。然后用 7.5 μL 电动多通道移液器将 12.5 μL 样品分配到指定的孔中。使用光学胶膜密封板并以 700 G 离心 1 分钟，将 2.5 μL HKG 引物探针混合物分配到指定孔中，将密封的 384 孔板在涡旋混合器中以 2， 600 RPM 的速度涡旋 2 分钟，然后在 700 个奶酪下离心 5 分钟。

最后，将密封的检测板放入 Q-R-T-P-C-R 机器中。打开分析布局的模板，并使用以下反应条件。根据文本方案开始运行、导出和分析数据，如图所示，在来自 6 个用 toll 样受体配体刺激的供体的外周血单核细胞或 p BMC 中分析了人 1 型和 3 型干扰素表达特征。

使用两种分析方法将数据以对数刻度的雷达图表示，包括归一化为管家基因的绝对 CQ 值和每微克总 RNA 模板的拷贝数。数据显示，TLR 激动剂引发的人干扰素表达特征是 Resus Maccas 中 1 型和 3 型干扰素的配体特异性表达特征。在该实验中也是 TLR 配体特异性的，来自三个供体的 PBMC 用三个配体刺激 3 小时。

基线时未刺激细胞中的干扰素亚型表达较低，如图所示。有限数量的干扰素 α 亚型响应 LPS 和 poly ic 而表达。相比之下，咪喹莫特反应的干扰素表达高，亚型表达是干扰素 β 和干扰素的广泛表达。

Lambda one 被所有三种 TLR 激动剂增强 观看此视频后，您应该对如何准备、运行和analyze. 3D四个孔检测板有很好的了解，以便对高度相似的一组基因（如 1 型和 3 型干扰素亚型）进行高通量分析。