利用延时亮场体视显微镜捕捉斑马鱼幼虫的组织修复过程

本视频演示了一种利用延时成像在体视显微镜下捕捉组织修复动态的方法。该方法首先将斑马鱼胚胎培育至幼虫阶段，此时尾鳍已充分发育，达到可方便进行截肢操作的尺寸。这一阶段通常在孵化后实现。

第二步是使用注射器针头切除尾鳍。第三步是将幼鱼固定于成像室中，并在体视显微镜下采集延时录像。最后一步是利用图像分析软件（如 Bit Plains S 或开源软件 ImageJ）对尾鳍再生进行定量分析。你好。我的实验室以斑马鱼为模型，研究伤口修复与组织再生。

今天，我们将演示一种利用明场体视显微镜实时捕捉这些过程动态变化的方法。我们将展示一种利用斑马鱼幼体尾鳍来观察组织再生早期过程的技术。该成像方法能够在简单的显微镜设置下，对整个组织尺度上的行为进行观察和分析，且易于适配于任何具备延时成像功能的体视显微镜系统。

那么，让我们开始吧。将斑马鱼培育至幼体阶段。尾鳍的伤口修复在孵化后阶段观察效果最佳，因为此时尾鳍已充分发育，且进行截肢操作时不易损伤脊髓或其他组织。

在近距离下收集卵子，并在28摄氏度的培养箱中过夜培养。次日早晨，移除死亡的胚胎，并用含有0.03% Instant Ocean水族盐溶液的胚胎培养基冲洗。如需要，可在培养皿中加入含0.003%苯硫脲的胚胎培养基，以防止幼虫色素沉着。

在本演示中，我们将胚胎在培养箱中培养至受精后两天，此时幼虫已从卵膜中孵出，接着进行成像室的制备。在这一步骤中，我们提供了两种构建成像室的方法。方法一包括使用饮用水级别的PVC或聚四氟乙烯（Teflon）管材制作成像室，这类材料可在任何五金店获得。

使用外径25毫米、内径20毫米的管材，因其尺寸适合盖玻片的固定。将管材切割成尽可能均匀的10毫米厚环状结构。用砂纸打磨边缘使其光滑，并用水和乙醇冲洗。

让培养皿在空气中自然干燥。方法二包括使用预先制备的哑光技术玻璃底、玻璃顶成像室，或使用小型培养皿自制成像室。自制成像室时，使用直径为35或50毫米的培养皿，并在盖子上钻一个直径为10毫米的孔。

接下来，将硅脂涂抹在盖玻片外侧，然后用干净的移液器吸头将一块 25 × 25 毫米的方形或圆形盖玻片固定在外侧，以确保封固的琼脂糖牢固附着。在成像过程中，将一层细塑料网固定在盖玻片内侧。可通过将网剪裁成与内环直径相同的尺寸，然后在网中央剪出一个约为幼虫大小三倍的小矩形来实现。

固定并成像损伤前的幼虫。此步骤适用于后续对鳍再生进行定量分析。首先，在胚胎培养基中制备0.5%的低熔点琼脂糖溶液，用于固定样本，将麻醉后的幼虫转移至已维持在42摄氏度的琼脂糖溶液中。

在加热金属块上，用一滴琼脂糖将幼虫转移至一个小培养皿中，并将幼虫侧置。使用带盖的微量移液器吸头，待琼脂糖凝固后加入三氯乙酸溶液。随后转移至后续将使用的体视显微镜。

对于延时成像，我们使用 ZES Discovery V12 体视显微镜和 Axio Vision 软件进行演示。首先，通过在成像时选择合适的物镜和放大倍数来调整显微镜设置。然后在 Alvis 软件中选择显微镜的相机检测模式。

选择实时模式以在屏幕上查看幼虫。打开属性窗口，自动检测亮度，并手动调节显微镜透射照明底座的对比度。将幼虫移出视野，并选择阴影校正功能。

为尽量减少背景噪声，将幼虫重新置于视野中并拍摄快照。保存图像以准备进行损伤处理。首先将幼虫头部的aeros刮除，然后从aros中移出幼虫。

通过轻轻将幼体头部从剩余的琼脂中拉出，可使幼体从琼脂中顺利脱出，完成尾鳍截除实验。使用Instant Ocean盐溶液制备1.5%琼脂平板。在体视显微镜下，将幼体侧向放置于凝固的琼脂上，使用23号注射器针头截除尾鳍远端部分。

为幼虫进行延时成像的封片。我们将介绍两种延时成像方法。在第一种方法中，我们将展示幼虫封片后如何在成像 chamber ring 中对幼虫进行成像。

用带盖的微量移液器吸头小心刮除远端尾鳍周围凝固的琼脂糖。这有助于伤口正常愈合或组织再生。在不固定组织的情况下操作时，注意避免反复损伤尾鳍。在此过程中，通过更换旧溶液，从成像腔室中清除干扰成像操作的多余碎屑。

使用新鲜的Trica溶液，将硅脂涂抹在腔室顶部，并用新鲜的Trica溶液填充腔室环。将一块盖玻片贴在顶部以密封腔室，此为方法二。在此方法中，我们将向您展示如何在玻璃底培养皿中对幼虫进行成像。

将幼虫固定在盖玻片上，盖上盖玻片并填充盖子。用三卡溶液处理，从尾鳍上刮除琼脂糖。

接下来，将硅脂涂抹在底部腔室的上边缘，并用三钙溶液填充该腔室。小心地将三钙溶液从盖子中倾倒出来，然后将盖子翻转，以使幼虫浸入底部腔室的三钙溶液中，此操作可略微倾斜进行。为避免产生气泡，需使用硅脂密封腔室，并进行延时成像，以确保维持在28摄氏度的适宜温度。

使用纸板和气泡膜组装一个加热培养室，以气泡膜作为隔热材料，并使用孵蛋用的带加热丝的穹顶作为热源。将该培养室放置在显微镜周围，并调节温度至28摄氏度。打开加热培养室的前部，将成像室置于显微镜上，保持约10至20分钟，或直至温度稳定。

将盖玻片朝上，面向物镜放置。调整幼鱼鳍的位置，使视野中三分之二的区域保持空置，以确保在成像过程中能够完整捕捉鳍的生长与再生过程。无需在软件的60个多维采集窗口中重新调整幼鱼位置，在Zack选项卡中选择Z轴层扫和延时成像模式以及切片模式。

选择切片厚度，然后选择开始-停止模式。在延时成像表中定义图像栈的上层和下层位置。设置时间间隔和视频持续时间，然后按下开始按钮以开始记录。

在第一个小时内，检查幼虫的前端和后端边界。如有必要，随着时间推移重新调整幼虫的位置，因为其位置可能因生长或琼脂糖成分的差异而发生偏移。在延时成像记录结束时保存文件，然后进行后续处理与定量分析步骤的数据分析。

在本节中，我们讨论分析方法一 imas 生成数据的几种方式。首先，我们将介绍如何使用 imas 软件测定鳍的生长情况。在 Amaris 软件中打开延时视频，并将文件保存为 MRS 文件格式。

为了提升软件性能，选择正交视图以投影方式显示视频。要测量鳍的长度，请在左上角工具栏中选择“添加新的测量点”选项。在“配置可见统计值列表”中，选择以线条模式显示的统计值。

在“设置”选项卡中，于标签属性内选择“配对”，并选择“名称”和“距离”，以在测量线旁边显示点 A 与点 B 之间的距离；切换至编辑模式，按住 Shift 键以在远端鳍处选择第一个点，然后使用相同配置在无吻合处的远端选择第二个点。距离将显示在图像中，并可在“统计”选项卡下导出。

通过单击右下角的磁盘按钮“全部导出”。或者，除了测量点选项外，还可以利用切片查看器在切片视图模式下测量距离。滚动至所需位置，使用鼠标左键单击第一个和第二个位置，距离将被显示出来。

然而，此选项不支持数据导出。现在我们将简要讨论如何使用开源软件 ImageJ 确定鳍面积。使用能够识别 Zeiss Axio Vision 文件格式的插件，在 ImageJ 中打开时间序列视频。

或者导入未压缩的 TIFF 序列。如果文件中未保留相关信息，则需在“分析”中选择“设置比例尺”，以定义像素与已知距离之间的对应关系。同时，将长度单位设置为微米。

在工具栏中，选择自由手绘选择工具，通过按住鼠标左键并沿伤口边缘绘制来勾勒伤口轮廓。

点击“分析”下的“测量”选项，以显示伤口代表结果的面积。鳍的截除在截除后36小时内会导致部分再生。鳍的面积测量结果显示，截除后鳍组织面积会减少至约14小时，推测是由于细胞死亡所致，随后出现轻微的再生长度。

截肢后再生的鳍相比显示，在36小时内鳍长度增加了2.48倍。截肢最初会引发一种收缩环效应，其特征是通过存在于鳍褶细胞中的肌动蛋白-肌球蛋白束产生收缩，这些细胞从截肢伤口处挤出，随后被清除。身体长度最初增加，但鳍无法再生。

在早期阶段。大约在截肢后14小时，鳍开始从近端向远端位置再生。总之，我们的结果表明，截肢会引发伤口收缩，这可能对促进细胞外排至关重要。

一旦该过程完成，鳍便开始再生。可见鳍的发育性生长随之出现。与此过程无关的是，我们已提出一种方法，可利用活体斑马鱼幼鱼观察组织修复的动态过程。

该实验流程需要某些特定条件，我们已对此进行了测试，以优化实验结果。所展示的成像方法具有明显优势，即能够轻松适配任何配备CCD相机和TimeLapse软件的体视显微镜。此外，该方法还为成本较高的共聚焦成像系统提供了一种低成本的替代方案。

尽管该方法未使用荧光或细胞检测技术，但通过采用自动化系统进行防震控制以及成像后的去卷积软件，可将其拓展应用于此类研究，从而以亚细胞分辨率进一步观察伤口修复与再生过程。该方法有助于学生更好地理解组织修复和再生背后的基本生物学过程。由于斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，易于操作，且该系统可适配任意体视显微镜，因此适用于课堂教学中脊椎动物基础生物学的教学。