Name: 捕获组织修复的斑马鱼幼虫与时间推移明视立体显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学习使用明视立体显微镜延时成像技术捕获斑马鱼幼虫尾鳍再生动态的方法。该技术可在单细胞分辨率下实时观察组织修复过程，为研究伤口愈合机制提供有力工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢MDI生物实验室动物核心服务中心对斑马鱼饲养工作的支持。本出版物中报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）资助，资助编号为P20GM104318（COBRE项目）和P20GM103423（INBRE项目），以及美国国防部—美国陆军医学研究与Materiel司令部（USAMRAA）（W81XWH-BAA-1）的资助。

斑马鱼（nacre 品系）的繁殖和培育均按照既定方案进行。所有操作均尽可能减少动物痛苦，使用 0.4 mM 三卡因（Tricaine）进行麻醉，1 mM 三卡因（Tricaine）实施安乐死。斑马鱼胚胎和幼鱼的操作严格遵循经适当委员会批准的良好动物实验规范（MDI 生物学实验室动物核心 IACUC 编号 13-20）。本研究已获国家人类基因组研究所动物护理与使用委员会批准，MDIBL 机构保证编号 # A-3562-01，方案编号 # 14-09。
注意：以下步骤总结了捕获幼年斑马鱼鳍再生过程的成像流程：
1. 斑马鱼幼体阶段的培育
<ol>
	<li>收集卵子，将约50枚卵放入盛有含0.00004%亚甲蓝的0.03% Instant Ocean盐溶液（溶于去离子水）的100 × 25 mm培养皿中。在28.5 °C培养箱中过夜孵育。</li>
	<li>次日早晨，用玻璃移液管移除死亡的胚胎，并用去离子水配制的含0.03% Instant Ocean盐的溶液（称为胚胎培养液）在滤网中冲洗卵。 
	注意：诸如林格氏液之类的培养基 18，汉克斯 18，E2 19，E3 20，和 Danieau 21 可能更受青睐。</li>
	<li>sup&#62;向培养皿中加入新鲜的胚胎培养基。如果使用有色品系，可选择性地加入0.2 mM 1-苯基-2-硫脲（PTU），因为PTU可抑制黑色素生成，从而防止幼虫色素沉着。将胚胎继续置于培养箱中发育至受精后2天或其他所需幼虫阶段。</li>
</ol>
2. 成像室的制备
<ol>
	<li>方法1：使用PVC或聚四氟乙烯（Teflon）管制作成像室（图1） 
	注意：本方法类似于Concha和Adams（1998）22的方法。
	<ol>
		<li>从五金店获取饮用水级塑料或聚四氟乙烯（Teflon）管，外径为25 mm，内径为20 mm。将管材切割成厚度约为10 mm的环状，两侧表面平整。使用&#62;200目的砂纸打磨边缘使其光滑。</li>
		<li>用温水和70%乙醇清洗环状物，并使其自然风干。</li>
		<li>用移液器吸头将硅脂涂抹在环的一侧，然后将该环固定在75 mm × 25 mm的玻璃盖玻片上。或者，也可使用装有硅脂的3 ml注射器代替移液器吸头。 
		注意：由于将硅脂装入3 ml注射器较为困难，可先将硅脂加入30 ml注射器中，再用其填充3 ml注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法2：将培养皿制备为成像室。
	<ol>
		<li>获取直径为35 mm或60 mm、盖子上附有玻璃盖玻片的培养皿（图2A）。或者，如Distel &amp;#38; Koester（2007）23中的图3所示，可在小型培养皿盖上钻一个刚好能固定盖玻片的小孔，并用3 ml注射器在外侧涂上硅脂。使用洁净的移液器吸头，小心地将所需厚度的圆形或方形盖玻片固定在外侧（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保用于固定样品的琼脂糖在成像过程中牢固附着，在环内侧贴附一层细塑料网。首先，使用带角度的精细剪刀将从五金店获得的窗纱剪裁成与环内径相同的尺寸。然后，在网中央剪出一个略大于幼虫两倍尺寸的小矩形开口&#62;（图1、2）。</li>
	<li>在盖玻片与成像室环之间的接口处涂抹四小滴无毒硅脂（图1A）。</li>
	<li>使用镊子将网牢固地固定在玻璃盖玻片底部。</li>
</ol>
3. 预损伤幼虫的封片与成像（此步骤为可选）
注意：此步骤适用于比较截肢后与再生后的鳍长度，因为在斑马鱼幼体中，鳍再生后的截肢平面已无法辨认。
<ol>
	<li>在胚胎培养基中配制0.5-1.2%的低熔点琼脂糖溶液，用于固定样本。</li>
	<li>将琼脂糖在微波炉中加热，然后将液态琼脂糖转移至已在加热金属块中预热至42 °C的1.5 ml离心管中。</li>
	<li>让热的琼脂糖冷却至42 °C，并可在该温度下维持数周。尽量避免将幼体移入高于42 °C的琼脂糖中，因为这会对动物造成伤害。</li>
	<li>在60 mm直径的培养皿中，使用10 ml含0.4 mM Tricaine（pH 7）的胚胎培养基麻醉若干幼体。Tricaine溶液的配制请参照《斑马鱼手册配方》18。
	<ol>
		<li>也可选用在60 mm直径培养皿中加入10 ml 99% 2-苯氧乙醇按1:1000比例稀释的溶液。在继续操作前，使用带帽的微量移液器吸头轻触幼体以评估其触觉反应。仅使用无反应的幼体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将一条幼体转移至42 °C的琼脂糖溶液中。转移时避免带入过多液体，否则琼脂糖会被过度稀释而无法凝固。</li>
	<li>弃去吸管中多余的液体，将幼体连同少量琼脂糖液滴转移至小型培养皿（35或60 mm直径）中。将幼体侧放，以便对尾鳍进行成像。</li>
	<li>让琼脂糖自然凝固。可用塑料移液器吸头测试琼脂糖状态：若吸头可陷入其中，则说明琼脂糖仍过稀；当琼脂糖完全凝固后，用吸头轻触表面会出现微小凹陷。凝固完成后，加入Tricaine溶液，并将样本转移至后续用于延时成像的体视显微镜下。 
	注意：此步骤也可通过将麻醉后的幼体置于涂有1.5%琼脂糖（溶于胚胎培养基）的培养皿表面来完成。</li>
	<li>使用配备延时成像软件的体视显微镜。选择合适的物镜和放大倍数，用于后续的延时成像。此处使用体视显微镜上3.5倍、工作距离16 mm的物镜。可根据需要选用其他显微镜和物镜，但应选择适当的放大倍数，以补偿成像过程中可能出现的xy轴漂移及鳍的生长变化。</li>
	<li>在显微镜上选择相机检测模式。</li>
	<li>在软件中选择“实时”模式，以便在屏幕上观察幼体。</li>
	<li>打开“属性”窗口，自动检测亮度。</li>
	<li>手动调节显微镜透射照明底座的对比度。</li>
	<li>将幼体移出视野，启用阴影校正功能以最小化背景噪声。</li>
	<li>将幼体重新移回视野，拍摄一张快照并保存图像。</li>
	<li>首先刮除头部周围的琼脂糖，然后用带帽的微量移液器吸头或昆虫针轻轻将头部从剩余琼脂糖中拉出，使幼体滑脱出来。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将幼体转移至新鲜的Tricaine溶液中。</li>
</ol>
4. 截肢实验
<ol>
	<li>使用胚胎培养基配制1.5%的琼脂糖溶液，并将其倒入培养皿中形成薄层。让琼脂糖凝固。</li>
	<li>在体视显微镜下，将幼体侧向放置于已凝固的琼脂糖上，用23 G&#160;注射针头轻轻施压，切除尾鳍（图3A）。</li>
</ol>
5. 胚胎幼虫的固定以进行延时成像
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 – 3.5 的描述进行操作（图 3B）。</li>
	<li>将一滴含有幼虫、浓度为 0.5–1.2% 且温度为 42 °C 的液态琼脂糖转移至成像室环（步骤 2.1）中，调整幼虫方向并让琼脂糖凝固。用三卡因溶液填充该环。或者，若使用培养皿成像室（步骤 2.2），则将幼虫固定在盖玻片盖上，并用三卡因溶液填充盖子部分。</li>
	<li>为促进伤口正常愈合或组织再生，使用带帽的微量移液器吸头或昆虫针小心刮除远端尾鳍周围的琼脂糖。注意避免反复损伤尾鳍（图 3C）。</li>
	<li>倾去含有去除琼脂糖的三卡因溶液，并用新鲜的三卡因溶液重新填充成像室环。</li>
	<li>在成像室环顶部涂抹硅脂，然后贴附一块 75 mm × 25 mm 的玻璃载片。应尽量避免产生气泡，因为气泡会影响明场成像，并随时间推移导致幼虫脱水。</li>
	<li>若使用培养皿作为成像室，需在底部腔室的上缘涂抹硅脂，并向底部腔室中加入三卡因溶液。小心倾去盖子中的三卡因溶液，然后将盖子翻转，以轻微倾斜的角度使幼虫浸入底部腔室的三卡因溶液中，以避免产生气泡。由于硅脂的存在，腔室将被密封。</li>
</ol>
6. 时间序列成像
<ol>
	<li>按照文献23,24所述方法组装加热培养室（图4）。将加热培养室放置在显微镜周围并开启加热，调节温度至28 °C，持续约10–20分钟，直至温度稳定。</li>
	<li>打开加热培养室的前部，将成像 chamber 放置在显微镜载物台上，盖玻片朝上，面向物镜。</li>
	<li>调整幼鱼鳍的位置，使视野中约2/3区域保持空置。这可确保在成像过程中完整记录鳍的生长与再生过程，而无需重新调整幼鱼位置。
	<ol>
		<li>在开始延时成像前，将固定好的幼鱼在28 °C条件下适应约30分钟，以避免明场强度变化或琼脂糖可能发生位移。或者，也可使用预热的缓冲液，以缩短适应时间后立即开始成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为设置延时成像，请在 Axiovision 软件中打开6D多维采集窗口，并选择z轴层扫（z-stack）和延时成像（time-lapse）模式。</li>
	<li>（可选）在z轴层扫选项卡的切片模式（Slice Mode）中，设置切片厚度，然后选择起始/终止模式（Start/Stop mode）。</li>
	<li>定义层扫（stack）的上限和下限位置。</li>
	<li>在延时成像选项卡中，设置成像时间间隔和总时长，然后点击开始按钮启动成像。我们发现30分钟的时间间隔已足够，且不会产生过多数据；但也可根据需要使用更短的时间间隔。</li>
	<li>若幼鱼未预先充分适应，需在成像开始后的第一个小时内检查其位置及z轴层扫范围。如有必要，在一天后再次重新调整幼鱼位置，因其可能发生位移。</li>
	<li>延时成像结束后保存文件，并使用现有的图像分析软件（如 Imaris25，或开源软件 Image J26 和 Fiji27）进行后续处理与定量分析。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>测定鳍的长度。
	<ol>
		<li>在成像软件中打开延时电影，并以专有文件格式保存文件，以提升软件性能。</li>
		<li>选择正交视图以将各个切片显示为投影堆栈。为进行漂移校正，在 Fiji 菜单中选择 Plugins，然后选择 Registration，再选择“Correct 3D drift”。这将打开一个 Fiji 窗口并执行漂移校正。在 Imaris Spots 功能中校正旋转漂移。或者，在 ImageJ 中安装 StackReg 和 TurboReg 插件并导入 Fiji。在 StackReg 插件中选择所需的变换算法。</li>
		<li>为测量距离（例如，伤口直径或鳍长度），在左上角工具栏中选择“Add New Measurement Points”选项。
		<ol>
			<li>在左下角菜单中的“Configure list of visible Statistics Values”下，选择要显示的统计值。</li>
			<li>在“设置”选项卡下的“Line Mode”中选择“Pairs (AB, CD ...)”。</li>
			<li>在“Labels Properties”中选择“Name”和“Distance”，以在测量线旁边显示点 A 和点 B 之间的距离。</li>
			<li>切换到“Edit”模式，按住 Shift 键，使用鼠标左键选择脊索末端的第一个点。然后使用相同的配置选择远端鳍边缘的第二个点。</li>
			<li>在“Statistics”选项卡下，点击右下角的磁盘按钮（Export All），以显示并导出图像中的距离。</li>
			<li>通过将图像下方的滑块向右移动至选定时间点，重复进行测量。无需创建新的测量点，可通过先用鼠标左键选中已有测量点，然后在新位置同时按下 Shift 键和鼠标左键，重新定位之前的测量点。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>除使用测量点选项外，也可利用切片查看器（slice viewer）测量距离。在切片视图模式下，滚动至所需位置，用鼠标左键点击第一和第二位置，距离将被显示。但此选项不支持数据导出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 ImageJ 中测定鳍长度和面积。
	<ol>
		<li>使用可识别 .zvi 文件格式的插件在 ImageJ 中打开延时电影。或者，加载 QuickTime 文件或 tiff 序列。 
		注意：若使用未压缩的 tiff 文件格式，则无需指定图像尺寸。</li>
		<li>若打开的文件格式不包含文件信息，请在“Analyze”菜单下选择“Set Scale”，首先定义图像距离和单位。在“Set Scale”菜单中，输入“Distance in pixels”，其下方输入像素值的“Known distance”（可通过测量图像中标尺条上的像素数获得，然后点击 Measure 获取结果），以及“Unit of length”（通常为“µm”）。然后点击确定。</li>
		<li>为测量鳍面积，在工具栏中选择“Freehand Selection”工具，按住鼠标左键沿鳍边缘描绘轮廓。为测量鳍长度，选择“Straight”直线工具，在需测量的两点之间绘制一条直线。</li>
		<li>在“Analyze”菜单下点击“Measure”选项，以显示鳍的面积和长度。根据需要对电影中的多个时间点重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可使用统计软件对数据进行图形化展示。</li>
</ol>

<ol><li>San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cellular+events+occur+during+wound+healing+and+organ+regeneration+in+the+sea+cucumber+Holothuria+glaberrima%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima.</a> BMC Dev Biol. 7, 115(2007).</li>
<li>Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+of+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tales of regeneration in zebrafish.</a> Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).</li>
<li>Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+questions%2C+new+tools%2C+and+some+answers+to+the+mystery+of+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration.</a> Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).</li>
<li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+research+today%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regeneration research today.</a> Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).</li>
<li>Seifert, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561-565 (2012).</li>
<li>Goss, R. J., Grimes, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+downgrowths+in+regenerating+rabbit+ear+holes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes.</a> J Morphol. 146, 533-542 (1975).</li>
<li>Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ear+tissue+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparison of ear tissue regeneration in mammals.</a> J Anat. 149, 55-63 (1986).</li>
<li>Allan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+response+and+Msx1+expression+after+human+fetal+digit+tip+amputation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro.</a> Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Dev Biol. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+four+msx+homeobox+genes+during+fin+development+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish.</a> Development. 121, 347-357 (1995).</li>
<li>Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+tip+regeneration+correlates+with+regions+of+Msx1+%28Hox+7%29+expression+in+fetal+and+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice.</a> Development. 121, 1065-1076 (1995).</li>
<li>Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+development+of+skin+cells+and+cutaneous+sensory+axons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).</li>
<li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).</li>
<li>Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+functional+analysis+of+zebrafish+larval+fin+fold+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration.</a> Dev Biol. 325, 71-81 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+part+A.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface.</a> Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).</li>
<li>Dahm, N. -V. a <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDahm%2C+N-Va+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%2C+Issue+975%22">Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975</a>. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish%3A+2nd+Edition+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics</a>. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).</li>
<li>Concha, M. L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+cell+divisions+and+cellular+morphogenesis+in+the+zebrafish+gastrula+and+neurula%3A+a+time-lapse+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis.</a> Development. 125, 983-994 (1998).</li>
<li>Distel, M., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Heated+Incubation+Chamber+around+a+Microscope+Stage+for+Time-Lapse+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Bitplane. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Imaris+V+6.1.0+Reference+Manual%22">Imaris V 6.1.0 Reference Manual</a>. , (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Mateus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+and+tissue+dynamics+underlying+zebrafish+fin+fold+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration.</a> PLoS One. 7, e51766(2012).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240(2009).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li>
<li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li>
<li>Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法可用于在活体斑马鱼幼鱼中观察伤口愈合和组织再生过程 体内 在体视显微镜上进行明场延时成像，使用相对简单的装置。该方法需注意若干经我们测试可优化实验结果的重要因素：1）低浓度琼脂糖（约0.5%）可最大限度减少对持续生长的斑马鱼幼鱼生长的阻碍；2）去除鳍周围琼脂糖至关重要，以避免遮蔽愈合过程；3）使用塑料网筛固定琼脂糖，可使琼脂糖和实验动物在整个过程中保持稳定位置；4）适宜的温度控制环境，对幼鱼存活至关重要。我们已采用加热培养室进行调控。 23,24，该装置利用贴在纸板上的气泡膜和带电线的穹顶加热器，可在成像过程中实现温度控制和适当的空气循环，同时将温度波动降至最低。这种结构简单且成本低廉的培养室可适配任意显微镜。类似的加热培养室也已被用于小鼠和鸡胚胎发育的成像研究 24,29.
我们建议将截肢前的幼虫先固定以获取截肢前图像，随后取下进行截肢操作，再重新固定用于延时成像。尽管这些步骤可以在最终的成像腔室中一次性完成，但根据我们的经验，直接在玻璃盖玻片上截除尾鳍并不理想，因为这样容易撕裂组织，无法获得整齐的切口。使用注射器针头在琼脂糖中进行截肢的方法最初由Kawakami及其同事（2004）16描述，而根据我们的经验，该方法也非常适合进行截肢操作。因此，我们所介绍的这一系列相对复杂的操作步骤是合理且必要的，可确保获得最佳的再生结果。
我们证明了在琼脂糖和三卡因溶液中，可以对2天龄的幼年斑马鱼进行长达1.5天的成像。我们使用pH优化的三卡因（pH 7）溶液，并以Instant Ocean盐配制，该条件在所述成像期间不会影响样本的健康状态。然而，我们此前也已证明，在Danieau培养基中使用三卡因，可在共聚焦显微镜下对2.5天龄的斑马鱼幼体进行至少持续2天的时间序列成像30。因此，最佳缓冲条件可延长幼鱼的存活时间和成像时长。此外，也可采用较低浓度的三卡因作为麻醉剂，或使用2-苯氧乙醇，我们发现其在28 °C条件下，至少60小时内对斑马鱼幼体及成体均具有良好的耐受性。
为避免影响鳍的再生，我们在成像前去除了尾鳍中的琼脂糖。我们的数据显示，在1.5天内，鳍的再生程度已达到约60%。该再生速率与先前一项研究结果一致，该研究将斑马鱼幼鱼尾鳍再生的平均时间定义为3天，适用于至6 dpf的幼鱼16。然而，也可采用其他替代琼脂糖的方法来固定鱼类以进行成像。例如，薄层血浆凝块31，或涂有甲基纤维素并填充极低浓度琼脂糖（0.1%）的氟化乙烯丙烯（FEP）管，已被推荐用于光片显微镜成像32，并可能适用于本文所述方法。但我们不推荐使用甲基纤维素和0.1%琼脂糖，因为这些介质无法凝固，需将样本置于成像腔底部进行固定。此外，根据我们的经验，高浓度的甲基纤维素会产生气泡，可能干扰成像过程。若选择在底部腔室中使用这些介质，则必须确保物镜与样本之间具备适当的工作距离。需要注意的是，甲基纤维素作为封片介质仅建议使用不超过1天，因其可能影响幼鱼的健康状况32。
将样本置于盖子上可能导致样本因重力作用而缓慢下移。因此建议在每个时间点采集多个层面的图像，这些图像可投影至单一平面，或仅选取处于焦平面的图像用于最终影片的拼接。作为避免潜在下移的替代方法，可将样本置于底部腔室中进行成像。使用血浆凝块可能有助于防止漂移，因为血浆会黏附于外层包被结构（EVL，表皮层）31，从而稳定样本。然而，该方法仍需验证，包括幼年斑马鱼在血浆凝块中可维持多久而不影响其健康或鳍的再生能力。
我们的视频是通过利用记录的Z轴层扫数据中各个切片（26 µm）组装而成，这些切片覆盖了鳍的完整厚度（约10 µm），并考虑了成像过程中鳍可能发生的Z轴漂移。为了保留三维信息，也可以将Z轴层扫数据投影为单幅图像。但由于这可能导致图像模糊，可能需要进行明场去卷积处理。可使用如Deconvolve或Autoquant X3等软件实现此目的。或者，也可应用数学算法（见Tadrous33所述）来获得高信噪比（SNR）的点扩散函数。获得高信噪比是明场去卷积中的主要难点之一。尽管该方法要求样品具有高对比度且厚度较薄，但由于尾鳍宽度较小，因此适用于尾鳍的成像。
本研究所展示的成像方法具有明显优势，即能够快速适配任何配备CCD相机和延时成像软件的体视显微镜，并为更昂贵的共聚焦成像系统提供一种低成本替代方案。尽管该方法未采用荧光技术进行细胞检测，但通过使用快门控制的自动化系统以及成像后的去卷积软件34，可将其拓展应用于此类场景。这将使研究人员能够在更长时间内以单细胞或亚细胞分辨率进一步观察伤口修复与再生过程。
斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，且易于操作，该方法可适配任意体视显微镜，因此适用于课堂教学中基础脊椎动物生物学的教学。本方法可帮助学生更好地理解组织修复与再生背后的基本生物学过程。采用类似方法已成功记录的其他生物学过程包括斑马鱼胚胎发育23,34以及心脏功能（未发表）。此外，该方法还为监测经遗传学或药理学干预后的斑马鱼幼体中伤口修复与再生过程提供了可能。

生物体在受伤后协调组织修复过程的能力对其生存至关重要1。尽管所有动物都具备伤口愈合的能力，但不同物种间组织再生的程度存在显著差异。某些脊椎动物，如斑马鱼、蝾螈和蛙类蝌蚪，具有显著的组织再生能力，能够再生其附属肢体、眼睛部分结构、心脏以及中枢神经系统2-4。哺乳动物中，如非洲多刺鼠和兔子，能够再生耳廓上的穿孔5-7；而人类和小鼠在胎儿期和幼年阶段也具备部分肝脏及指尖组织的再生能力8-12。尽管目前尚不完全清楚为何某些物种的组织再生能力明显优于其他物种，但相似遗传通路的存在提示，这些再生机制可能在再生能力较弱的物种中处于休眠状态13,14。因此，阐明具有较强再生能力物种中的组织修复与再生机制，将有助于推动人类组织再生的研究与应用。
我们选择斑马鱼幼体尾鳍作为范例，以展示通过延时明场体视显微镜观察其再生过程。与结构更为复杂的成体组织相比，斑马鱼幼体尾鳍在解剖结构上较为简单，由双层折叠的上皮构成，其中躯体感觉轴突支配包围内侧间充质细胞的皮肤15。尽管在解剖结构上存在差异，但在分子特征和外生性再生反应方面，幼体尾鳍的再生过程在一定程度上可与成体鳍的再生相比较16,17。与成体鳍相比，对幼体尾鳍再生进行成像具有若干优势：1）幼体鳍的再生在短短2–3天内即可完成16；2）幼体可被固定于低熔点琼脂糖中；3）由于卵黄囊的存在，幼体在受精后约5天（dpf）内无需喂食。这些特点使斑马鱼幼体成为在活体（in vivo）条件下观察组织修复动态的理想模型。
本文所述方法能够捕捉鳍再生早期过程中潜在的详细动态。许多研究已利用基于荧光的共聚焦显微镜来观察斑马鱼胚胎和幼体中的细胞及亚细胞生物学过程。然而，复杂的共聚焦成像系统通常难以被广泛获取，且与其他成像技术相比成本高昂。相比之下，本文介绍的方法采用配备Axiovision软件和延时成像模块的Discovery V12体视显微镜，为昂贵的成像设备提供了一种更为经济的替代方案，可用于观察组织行为。我们证明，该方法能够以极低的成本实现对组织再生的高时间分辨率成像。该方法的应用前景不仅限于基础生物学研究，还可通过器官培养推动哺乳动物再生研究，通过药理学和遗传筛选促进治疗手段的开发，并可用作课堂教学中的教学工具。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bullseye Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-GCA500</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 水族盐</td><td>宠物商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝（0.1% 溶液）</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10505</td><td></td></tr><tr><td>2-苯氧基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 35 × 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 60 × 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100 × 25 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351013</td><td></td></tr><tr><td>5.75 英寸硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃顶玻璃底培养皿（玻璃厚度：0.085–0.115 mm）</td><td>MatTek Corporation</td><td>D35-20-0-TOP</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72191-75</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Phifer Phiferglass 昆虫筛网 活性炭 - 48&quot;</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量加样吸头 20 &amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - 上翘尖头型</td><td>Fine Science Tools</td><td>14037-10</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lok&amp;trade; 一次性注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Luer-Lok&amp;trade; 一次性注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>23 G 注射针头</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LabDoctor Mini Dry Bath</td><td>MidSci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discovery.V12 复式显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo S 3.5X 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision 软件，版本 4.8.2SP1（2011 年 12 月）</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用延时亮场体视显微镜捕捉斑马鱼幼虫的组织修复过程

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

斑马鱼幼体尾鳍是研究组织再生的理想模型，因为幼体鳍褶结构简单，仅由两层皮肤包裹未分化的间充质组成，且尾鳍在截断后可在2-3天内快速再生。利用该系统，我们展示了一种通过延时亮场体视显微镜记录截断尾鳍修复动态的方法。我们发现，鳍的截断会引发伤口收缩以及伤口边缘周围细胞的排出，进而导致这些细胞被清除。在短暂延迟后，鳍的再生从近端向远端方向进行。此外，在各个阶段均可同时观察到幼体的发育性生长。本方法提供了一种在简单的显微镜条件下观察和分析整个组织尺度行为（如鳍的发育与生长）的机会，且该方法易于适配于任何具备延时成像功能的体视显微镜。

本研究所展示的技术适用于阐明截肢后组织修复的动态过程。视频显示，鳍的截肢最初会引发一种束带效应，其特征是鳍褶内存在的肌动蛋白-肌球蛋白束介导的收缩28（图5 A,B）。与此同时，细胞从伤口处被挤出（见视频）。因此，这种收缩可能是为了排出那些可能即将发生细胞死亡的细胞。我们的进一步结果表明，幼体的发育性生长与再生过程相互独立（视频），而鳍的再生则在截肢后约14小时才开始启动，该结论基于截肢后36小时时间范围内鳍长度和面积的测量结果（图5C, D）。截肢后1.5天内的总再生鳍生长量约为原始鳍长度的60%（图5E）。综上所述，这些结果表明，截肢会触发鳍的收缩、细胞从伤口的挤出以及时间上延迟的再生反应。尽管被挤出的细胞可能注定会发生细胞死亡，但这些细胞的具体性质仍有待进一步阐明。
<img alt="静态平衡实验；载玻片上的过滤装置，显微镜下观察网格。" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 成像室环形组件装配示意图
（A）图示为一个用硅脂固定在盖玻片上的塑料环。塑料网通过四小点硅脂固定在腔室内部。（B）装有固定幼虫的腔室中加入三卡因溶液，并在顶部贴附一张载玻片。（C）固定好的2日龄幼虫（箭头所示）在更高放大倍数下显示，以展示其相对于网格的大小。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样品分析的显微镜装置；用于观察和测量的网格和镜头。" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 由培养皿制成的成像室组装示意图。（A）显示的是商用玻璃底玻璃顶培养皿，其塑料网格附着在玻璃盖玻片上。（B）显示的是自制培养皿腔室，其盖子上钻有一个孔，并从外部用硅脂将盖玻片固定。网格和幼虫被安置在含有三卡因溶液的腔室内。为密封腔室，将硅脂涂抹在底部腔室的上部外缘，然后盖上顶部盖子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="尾鳍截除过程；示意图；胚胎在琼脂糖中的固定；延时成像装置。" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 用于成像的幼鱼截尾与固定的示意图。（A）进行截尾时，将麻醉后的幼鱼置于涂有琼脂糖的培养皿上，用注射器针头截除尾鳍。（B）固定时，用移液器将幼鱼转移至装有42 °C液态琼脂糖的1.5 ml离心管中，吸取含有幼鱼的一滴液体至成像腔室，调整鱼体方向，并在凝固的琼脂糖上覆盖胚胎培养液。（C）使用带盖的微量加样器吸头或类似工具刮除尾鳍周围的琼脂糖，并更换为新鲜的胚胎培养液。（D）在体视显微镜下对尾鳍进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发研究的低温显微镜装置；隔热包裹、透镜系统、相机。" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 自制加热培养室。（A-C）图示为一个由纸板、气泡膜和魔术贴制成的加热培养室。使用铝箔胶带将一个有线球形加热器（最初设计用于鸡卵孵化）固定在培养室上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼鳍再生研究；截肢示意图、显微镜图像、生长曲线、数据分析。" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 鳍再生动态过程。（A）尾鳍截肢实验及定量方法示意图，用于测定鳍的长度（红色箭头）和面积（红色轮廓线标示的鳍区域）。（B）尾鳍截肢最初引发鳍组织的收缩，随后启动再生组织的向外生长。同时，鳍也经历发育性生长，表现为横向尺寸的增加。（C）显示鳍长度随时间的变化，表明再生生长在约 14 hpa 开始呈线性增长。（D）对鳍面积的定量分析显示，初期尺寸有所减小，这可归因于鳍的收缩；约 14 小时后，鳍的尺寸以线性速率增加。（E）截肢前与截肢后 36 小时的鳍长度比较显示，再生程度约为 60%。比例尺：100 µm 缩写：pre-amp，截肢前；hours post amputation，hpa，截肢后小时数；regen，再生；amp，截肢 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/Movie_1_H264.mov">视频</a>。鳍在36小时时间过程中的再生。 展示的是一个2.5天龄幼鱼尾鳍在再生过程中的情况。从截断后30分钟开始，在体视显微镜下使用3.5倍物镜，以30分钟为间隔对再生生长进行成像。

我们介绍了一种利用明场体视显微镜在全组织尺度上捕捉斑马鱼幼体尾鳍再生动态的实验方案。该技术能够以单细胞分辨率记录再生过程中的动态变化。此方法可适用于任何配备CCD相机和延时成像软件的体视显微镜。

斑马鱼幼体尾鳍是研究组织再生的理想模型，因为幼体鳍褶结构简单，由两层……组成

本视频演示了一种利用延时成像在体视显微镜下捕捉组织修复动态的方法。该方法首先将斑马鱼胚胎培育至幼虫阶段，此时尾鳍已充分发育，达到可方便进行截肢操作的尺寸。这一阶段通常在孵化后实现。第二步是使用注射器针头切除尾鳍。第三步是将幼鱼固定于成像室中，并在体视显微镜下采集延时录像。最后一步是利用图像分析软件（如 Bit Plains S 或开源软件 ImageJ）对尾鳍再生进行定量分析。你好。我的实验室以斑马鱼为模型，研究伤口修复与组织再生。今天，我们将演示一种利用明场体视显微镜实时捕捉这些过程动态变化的方法。我们将展示一种利用斑马鱼幼体尾鳍来观察组织再生早期过程的技术。该成像方法能够在简单的显微镜设置下，对整个组织尺度上的行为进行观察和分析，且易于适配于任何具备延时成像功能的体视显微镜系统。那么，让我们开始吧。将斑马鱼培育至幼体阶段。尾鳍的伤口修复在孵化后阶段观察效果最佳，因为此时尾鳍已充分发育，且进行截肢操作时不易损伤脊髓或其他组织。在近距离下收集卵子，并在28摄氏度的培养箱中过夜培养。次日早晨，移除死亡的胚胎，并用含有0.03% Instant Ocean水族盐溶液的胚胎培养基冲洗。如需要，可在培养皿中加入含0.003%苯硫脲的胚胎培养基，以防止幼虫色素沉着。在本演示中，我们将胚胎在培养箱中培养至受精后两天，此时幼虫已从卵膜中孵出，接着进行成像室的制备。在这一步骤中，我们提供了两种构建成像室的方法。方法一包括使用饮用水级别的PVC或聚四氟乙烯（Teflon）管材制作成像室，这类材料可在任何五金店获得。使用外径25毫米、内径20毫米的管材，因其尺寸适合盖玻片的固定。将管材切割成尽可能均匀的10毫米厚环状结构。用砂纸打磨边缘使其光滑，并用水和乙醇冲洗。让培养皿在空气中自然干燥。方法二包括使用预先制备的哑光技术玻璃底、玻璃顶成像室，或使用小型培养皿自制成像室。自制成像室时，使用直径为35或50毫米的培养皿，并在盖子上钻一个直径为10毫米的孔。接下来，将硅脂涂抹在盖玻片外侧，然后用干净的移液器吸头将一块 25 × 25 毫米的方形或圆形盖玻片固定在外侧，以确保封固的琼脂糖牢固附着。在成像过程中，将一层细塑料网固定在盖玻片内侧。可通过将网剪裁成与内环直径相同的尺寸，然后在网中央剪出一个约为幼虫大小三倍的小矩形来实现。固定并成像损伤前的幼虫。此步骤适用于后续对鳍再生进行定量分析。首先，在胚胎培养基中制备0.5%的低熔点琼脂糖溶液，用于固定样本，将麻醉后的幼虫转移至已维持在42摄氏度的琼脂糖溶液中。在加热金属块上，用一滴琼脂糖将幼虫转移至一个小培养皿中，并将幼虫侧置。使用带盖的微量移液器吸头，待琼脂糖凝固后加入三氯乙酸溶液。随后转移至后续将使用的体视显微镜。对于延时成像，我们使用 ZES Discovery V12 体视显微镜和 Axio Vision 软件进行演示。首先，通过在成像时选择合适的物镜和放大倍数来调整显微镜设置。然后在 Alvis 软件中选择显微镜的相机检测模式。选择实时模式以在屏幕上查看幼虫。打开属性窗口，自动检测亮度，并手动调节显微镜透射照明底座的对比度。将幼虫移出视野，并选择阴影校正功能。为尽量减少背景噪声，将幼虫重新置于视野中并拍摄快照。保存图像以准备进行损伤处理。首先将幼虫头部的aeros刮除，然后从aros中移出幼虫。通过轻轻将幼体头部从剩余的琼脂中拉出，可使幼体从琼脂中顺利脱出，完成尾鳍截除实验。使用Instant Ocean盐溶液制备1.5%琼脂平板。在体视显微镜下，将幼体侧向放置于凝固的琼脂上，使用23号注射器针头截除尾鳍远端部分。为幼虫进行延时成像的封片。我们将介绍两种延时成像方法。在第一种方法中，我们将展示幼虫封片后如何在成像 chamber ring 中对幼虫进行成像。用带盖的微量移液器吸头小心刮除远端尾鳍周围凝固的琼脂糖。这有助于伤口正常愈合或组织再生。在不固定组织的情况下操作时，注意避免反复损伤尾鳍。在此过程中，通过更换旧溶液，从成像腔室中清除干扰成像操作的多余碎屑。使用新鲜的Trica溶液，将硅脂涂抹在腔室顶部，并用新鲜的Trica溶液填充腔室环。将一块盖玻片贴在顶部以密封腔室，此为方法二。在此方法中，我们将向您展示如何在玻璃底培养皿中对幼虫进行成像。将幼虫固定在盖玻片上，盖上盖玻片并填充盖子。用三卡溶液处理，从尾鳍上刮除琼脂糖。接下来，将硅脂涂抹在底部腔室的上边缘，并用三钙溶液填充该腔室。小心地将三钙溶液从盖子中倾倒出来，然后将盖子翻转，以使幼虫浸入底部腔室的三钙溶液中，此操作可略微倾斜进行。为避免产生气泡，需使用硅脂密封腔室，并进行延时成像，以确保维持在28摄氏度的适宜温度。使用纸板和气泡膜组装一个加热培养室，以气泡膜作为隔热材料，并使用孵蛋用的带加热丝的穹顶作为热源。将该培养室放置在显微镜周围，并调节温度至28摄氏度。打开加热培养室的前部，将成像室置于显微镜上，保持约10至20分钟，或直至温度稳定。将盖玻片朝上，面向物镜放置。调整幼鱼鳍的位置，使视野中三分之二的区域保持空置，以确保在成像过程中能够完整捕捉鳍的生长与再生过程。无需在软件的60个多维采集窗口中重新调整幼鱼位置，在Zack选项卡中选择Z轴层扫和延时成像模式以及切片模式。选择切片厚度，然后选择开始-停止模式。在延时成像表中定义图像栈的上层和下层位置。设置时间间隔和视频持续时间，然后按下开始按钮以开始记录。在第一个小时内，检查幼虫的前端和后端边界。如有必要，随着时间推移重新调整幼虫的位置，因为其位置可能因生长或琼脂糖成分的差异而发生偏移。在延时成像记录结束时保存文件，然后进行后续处理与定量分析步骤的数据分析。在本节中，我们讨论分析方法一 imas 生成数据的几种方式。首先，我们将介绍如何使用 imas 软件测定鳍的生长情况。在 Amaris 软件中打开延时视频，并将文件保存为 MRS 文件格式。为了提升软件性能，选择正交视图以投影方式显示视频。要测量鳍的长度，请在左上角工具栏中选择“添加新的测量点”选项。在“配置可见统计值列表”中，选择以线条模式显示的统计值。在“设置”选项卡中，于标签属性内选择“配对”，并选择“名称”和“距离”，以在测量线旁边显示点 A 与点 B 之间的距离；切换至编辑模式，按住 Shift 键以在远端鳍处选择第一个点，然后使用相同配置在无吻合处的远端选择第二个点。距离将显示在图像中，并可在“统计”选项卡下导出。通过单击右下角的磁盘按钮“全部导出”。或者，除了测量点选项外，还可以利用切片查看器在切片视图模式下测量距离。滚动至所需位置，使用鼠标左键单击第一个和第二个位置，距离将被显示出来。然而，此选项不支持数据导出。现在我们将简要讨论如何使用开源软件 ImageJ 确定鳍面积。使用能够识别 Zeiss Axio Vision 文件格式的插件，在 ImageJ 中打开时间序列视频。或者导入未压缩的 TIFF 序列。如果文件中未保留相关信息，则需在“分析”中选择“设置比例尺”，以定义像素与已知距离之间的对应关系。同时，将长度单位设置为微米。在工具栏中，选择自由手绘选择工具，通过按住鼠标左键并沿伤口边缘绘制来勾勒伤口轮廓。点击“分析”下的“测量”选项，以显示伤口代表结果的面积。鳍的截除在截除后36小时内会导致部分再生。鳍的面积测量结果显示，截除后鳍组织面积会减少至约14小时，推测是由于细胞死亡所致，随后出现轻微的再生长度。截肢后再生的鳍相比显示，在36小时内鳍长度增加了2.48倍。截肢最初会引发一种收缩环效应，其特征是通过存在于鳍褶细胞中的肌动蛋白-肌球蛋白束产生收缩，这些细胞从截肢伤口处挤出，随后被清除。身体长度最初增加，但鳍无法再生。在早期阶段。大约在截肢后14小时，鳍开始从近端向远端位置再生。总之，我们的结果表明，截肢会引发伤口收缩，这可能对促进细胞外排至关重要。一旦该过程完成，鳍便开始再生。可见鳍的发育性生长随之出现。与此过程无关的是，我们已提出一种方法，可利用活体斑马鱼幼鱼观察组织修复的动态过程。该实验流程需要某些特定条件，我们已对此进行了测试，以优化实验结果。所展示的成像方法具有明显优势，即能够轻松适配任何配备CCD相机和TimeLapse软件的体视显微镜。此外，该方法还为成本较高的共聚焦成像系统提供了一种低成本的替代方案。尽管该方法未使用荧光或细胞检测技术，但通过采用自动化系统进行防震控制以及成像后的去卷积软件，可将其拓展应用于此类研究，从而以亚细胞分辨率进一步观察伤口修复与再生过程。该方法有助于学生更好地理解组织修复和再生背后的基本生物学过程。由于斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，易于操作，且该系统可适配任意体视显微镜，因此适用于课堂教学中脊椎动物基础生物学的教学。

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

捕获组织修复的斑马鱼幼虫与时间推移明视立体显微镜

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

来源： Volpe, B. A., et al. 基于共聚焦显微镜的斑马鱼中间神经丘细胞激光消融与再生检测实验. J. Vis. Exp. (2020)...

使用共聚焦显微镜监测斑马鱼激光消融后中间神经丘细胞的恢复

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。...

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

本文所述方法利用能够进行光学切片的荧光解剖显微镜，以及简单的重新调整策略来校正焦平面和层面漂移，从而实现对斑马鱼胚胎器官发育过程的延时分析。...

利用配备光学切片功能的解剖显微镜通过延时成像分析斑马鱼肾脏发育

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

本文描述了在斑马鱼中性粒细胞中进行趋化因子受体动态活体成像和定量分析的实验方案...

斑马鱼中性粒细胞在伤口反应期间趋化因子受体的活体成像

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。...

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层压技术制备微流控器件的创新方法，显著降低了对多个活体斑马鱼胚胎进行捕获和成像的成本与复杂性。...

低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯层压微流控设计用于多重斑马鱼成像

学习使用明视立体显微镜延时成像技术捕获斑马鱼幼虫尾鳍再生动态的方法。该技术可在单细胞分辨率下实时观察组织修复过程，为研究伤口愈合机制提供有力工具。

利用延时亮场体视显微镜捕捉斑马鱼幼虫的组织修复过程

探索更多视频