捕获组织修复的斑马鱼幼虫与时间推移明视立体显微镜

本视频演示了一种使用延时成像在立体显微镜上捕获组织修复动力学的方法。这是通过首先将斑马鱼胚胎抚养到幼虫阶段来实现的，此时尾鳍已经充分发育到可以轻松进行截肢的大小。这通常是在影线后实现的。

第二步是使用注射器针头截肢尾鳍。第三步是将幼虫安装到成像室中，并在体视显微镜上捕获延时电影。最后一步是使用成像分析软件（如 Bit Plains S）或开源软件量化尾鳍再生 J.Hi.My 使用斑马鱼作为模型进行实验室研究伤口修复和组织再生的实验室图像。

今天，我们将演示一种使用明场立体显微镜实时捕捉这些过程动态的方法。今天，我们将演示一种使用斑马鱼幼虫尾鳍捕捉组织再生早期过程的方法。所提出的成像方法为在简单的显微镜设置中观察和分析整个组织尺度的行为提供了机会，这很容易适应任何配备延时功能的体视显微镜。

那么让我们开始吧。斑马鱼饲养到幼虫阶段。尾鳍的伤口修复可以在孵化阶段后最好地观察到，因为此时尾鳍已经充分发育，并且可以轻松进行截肢，而不会损坏脊髓或其他组织。

在附近收集种蛋并在 28 摄氏度的培养箱中孵育过夜。第二天早上，取出死胚胎，用含有 0.03% 速溶海洋水族馆盐溶液的胚胎培养基冲洗。如果需要，向培养皿中加入含有 0.003% pheno thyroid 的胚胎培养基，以防止幼虫色素沉着。

为了进行此演示，我们让胚胎发育到在培养箱中受精后两天，此时幼虫已从成像室的 kons 准备中孵化出来。在此步骤中，我们提供了两种构建成像室的方法。方法一包括一个由饮用水级 PVC 或特氟龙管制成的成像室，可以在任何五金店买到。

使用外径为 25 毫米、内径为 20 毫米的管子，因为其尺寸适合盖玻片连接。切割管子，使 10 毫米厚的圆环尽可能均匀。使用砂纸抹平边缘，然后用水和乙醇冲洗。

让腔室风干。方法二包括利用预制的哑光技术玻璃底部、玻璃顶部成像室，或用小培养皿制作成像室。要制作自己的成像室，请使用 35 或 50 毫米的培养皿并在盖子上钻一个 10 毫米的孔。

硅脂涂抹在盖玻片的外侧，并用干净的移液器吸头将 25 x 25 毫米的方形或圆形盖玻片连接到外侧，以确保安装格栅保持牢固连接。在成像过程中，将细塑料网连接到盖玻片的内侧。这可以通过将网片切成内环直径的大小，然后在网片中间切一个大约三倍于幼虫大小的小矩形来实现。

受伤前幼虫的安装和成像。此步骤适用于鳍再生的后期定量。首先，在胚胎培养基中制备 0.5% 低熔点的 agro 溶液，用于将标本固定，将麻醉的幼虫转移到维持在 42 摄氏度的 aro 溶液中。

在加热块中，将幼虫和一滴 agros 转移到一个小培养皿中，并将幼虫侧放。使用带盖的微型装载器尖端，让 aros 凝固并添加 trica 溶液。继续进行稍后将使用的体视显微镜。

对于延时成像，我们使用 zes discovery V 12 体视显微镜和 Axio 视觉软件进行演示。首先，通过选择合适的物镜和放大倍率进行成像来调整显微镜设置。然后在 alvis 软件中选择显微镜上的相机检测模式。

选择实时模式以在屏幕上查看幼虫。打开属性窗口以自动检测亮度，手动调整显微镜透射基座的对比度。将幼虫移出视野，然后选择阴影校正功能。

为了最大限度地减少背景噪音，请将幼虫放回视野中并拍摄快照。保存图像以准备受伤。首先从头部刮下 aeros，从 aros 上去除幼虫。

这使得幼虫能够通过轻轻地将头部从剩余的 Aeros 截肢测定中拉出。使用速溶海洋盐溶液准备 1.5%aeros 板。在立体显微镜下，将幼虫侧向放在凝固的 aros 上，并用 23 号注射器针头截去尾鳍的远端部分。

安装幼虫以进行延时成像。我们将介绍两种延时成像方法。在第一种方法中，我们将展示如何在安装幼虫后对腔室环中的幼虫进行成像。

用带盖的微型装载器移液器吸头小心刮掉远端尾鳍周围凝固的 agros。这允许适当的伤口愈合或组织再生 在不限制组织的情况下，尽量不要反复伤害鳍。在此过程中，通过更换旧溶液从腔室中清除干扰成像过程的不需要的碎屑。

使用新鲜的 Trica 溶液，将硅脂涂抹在腔室顶部，并用新鲜的 trica 溶液填充腔室环。将载玻片涂在顶部以密封腔室方法二。在这种方法中，我们将向您展示如何在玻璃顶部培养皿中对幼虫进行成像。

将幼虫放在盖子上，盖上衬片并装满盖子。使用 trica 解决方案。从尾鳍上刮掉 agros。

接下来，将硅脂涂抹在底部腔室的顶部边缘，并用 trica 溶液填充腔室。小心地从盖子中倒出 trica 溶液，然后将盖子翻转过来，将幼虫浸入底腔的 trica 溶液中，这可以以一个小角度进行。为避免气泡，腔室将用硅脂延时成像密封，以确保保持 28 摄氏度的适当温度。

组装一个由纸板气泡膜制成的加热孵化室作为绝缘，并组装一个用于鸡蛋孵化的有线圆顶作为热源。将孵育室放在显微镜周围，并将温度调节至 28 摄氏度。大约 10 到 20 分钟或直到温度稳定下来，打开加热的孵育室前部，将成像室放在显微镜上。

站立，盖玻片朝上朝向物镜。将幼虫鳍放置在三分之二的视野中未被占用的位置，以确保在成像过程中捕获鳍的生长和再生。无需在软件的 60 多维采集窗口中重新定位幼虫，即可在 Zack 选项卡和切片模式中选择 Z 堆栈和延时选项。

选择切片厚度，然后选择开始停止模式。在延时表中定义堆栈的 upper 和 Lower 位置。选择电影的间隔和持续时间，然后按开始按钮开始录制。

在第一个小时内，检查幼虫的 和 Zack 边界。如有必要，随着时间的推移重新定位幼虫，因为它可能由于生长或农产品成分的差异而发生了变化。在延时记录结束时保存文件，然后继续进行后处理和量化步骤数据分析。

在本节中，我们将讨论分析数据生成的方法 1 imas 的几种方法。首先，我们将讨论如何使用 imas 软件确定翅片生长情况。在 Amaris 软件中打开延时影片，并以 MRS 文件格式保存文件。

要增强 Software 性能，请选择正交视图以将影片显示为投影。要测量翅片长度，请选择左上方工具栏中的 Add new measurement points 选项。在 configure list of visible statistics value （配置可见统计值列表） 下，选择要以行模式显示的统计值。

在设置选项卡下，在标签属性中选择对，选择名称和距离以在测量线旁边显示点 A 和 B 之间的距离，切换到编辑模式并按住 shift 按钮以选择远端鳍的第一个点。然后使用相同的配置选择 no accord 远端的第二个点。距离将显示在图像中，并且可以在统计信息选项卡下导出。

通过选择右下角的光盘按钮 export all 。除了测量点选项之外，切片查看器可用于在切片视图模式下测量距离。滚动到所需位置，然后用鼠标左键单击第一个和第二个位置，将显示距离。

但是，此选项不允许导出数据。现在我们将简要讨论如何使用开源软件确定鳍片面积。图像 J.使用可识别 Zeiss Axio 视觉文件格式的插件打开图像 J 中的 TimeLapse 视频。

或者，在未压缩的 TIFF 序列中加载。这将确保文件信息保存在 analyze select set scale to define the distance and pixels and known distance（如果未保留在文件中）下。此外，将 unit length （单位长度） 设置为 micrometers（微米）。

在工具栏中。选择自由手选择工具，然后按住鼠标左键勾勒伤口。沿着伤口边缘绘制。

单击 analyze 下的测量选项以显示伤口代表性结果的区域。鳍截肢导致截肢后 36 小时内部分再生。鳍的面积测量表明，直到截肢后约 14 小时，鳍截肢会触发鳍组织减少，这可能是由于细胞死亡，随后是较薄的再生长度。

截肢和再生鳍的比较显示，36 小时内鳍长度增加了 2.48 倍。截肢最初会触发荷包线效应，其特征是通过存在于鳍皱襞细胞中的肌动蛋白肌球蛋白电缆收缩，从截肢伤口中挤出，随后被清除。体长最初增加，但鳍不会再生。

在早期阶段。截肢后约 14 小时，鳍开始从近端向远端生长。总之，我们的结果表明，截肢会触发伤口收缩，这对于促进细胞挤压可能是必不可少的。

一旦该过程完成，鳍就开始再生。发育中的鳍似乎生长。独立于这个过程，我们提出了一种方法，允许使用活斑马鱼幼虫观察组织修复的动态过程。

此过程需要某些方面，我们已经对其进行了测试，以优化结果。所提出的成像方法的一个明显优点是它很容易适应任何配备 CCD 相机和 TimeLapse 软件的体视显微镜。它还为更昂贵的共聚焦成像系统提供了一种低成本的替代方案。

虽然这种方法不使用荧光或细胞检测，但可以通过利用自动化系统进行破碎控制和成像后反卷积软件来进一步观察具有亚细胞分辨率的伤口修复和再生过程，从而针对此类应用进行扩展。这种方法可以让学生更好地了解基本的生物过程、潜在的组织修复和再生。斑马鱼胚胎和幼鱼的光学清晰度和易用性，以及该系统对任何体视显微镜的适应性，使其适合在课堂环境中教授基本的椎骨生物学。