Name: 封装产热前脂肪细胞移植到脂肪组织仓库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解封装产热前脂肪细胞的方法，用于研究能量代谢与肥胖治疗。该技术通过海藻酸钠微珠包裹细胞，实现体外共培养或体内移植，为代谢疾病研究提供新策略。

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我们感谢 Jennifer Petrosino 和 David DiSilvestro 提供的编辑帮助。本研究得到了美国蛋品委员会资助项目（编号 20020728）和诺和诺德制药公司资助项目（编号 10040042）的支持，同时也得到了俄亥俄州立大学（OSU）食品创新中心、国际事务办公室、先进功能食品研究中心及创业部门，以及美国国家科学基金会项目 EEC-0914790（L.J.L.）的资助。本项目还获得了美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）资助项目 R21OD017244（O.Z.）和 UL1RR025755（OSUCCC）的支持，上述资助由美国国立卫生研究院院长办公室（OD）提供资金，并得到 NIH 医学研究路线图以及 &#160;NCI P30CA16058 的支持。本内容仅由作者负责，不代表研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。

本研究方案已获得俄亥俄州立大学伦理委员会批准。动物实验已获IACUC方案批准。所有操作均在II级生物安全柜中进行，且气流为层流。我们遵循了所有标准安全要求和操作规程。微胶囊制备的微囊化技术已如文献17,18所述进行。
1. 材料准备
<ol>
	<li>在灭菌生理盐水（0.9% NaCl 水溶液）中配制 10 ml 2% 海藻酸钠溶液。在生理盐水中配制 0.05% 聚赖氨酸（PLL）溶液。上述溶液均于前一日配制，搅拌过夜。使用前用 0.22 μm 滤膜过滤。</li>
	<li>配制 50 mM 柠檬酸钠和 100 mM CaCl₂2 在0.9% NaCl溶液中并进行高压灭菌。</li>
	<li>对所有溶液、针头、电极和烧杯进行高压灭菌。使用带线的针头彻底清洁，以防止堵塞。</li>
	<li>确定用于制备微胶囊的合适细胞数量（每厘米需要102个微胶囊）2 每孔约有500个细胞18使用1 ml海藻酸钠处理两百万个细胞。</li>
	<li>配制含有10% 小牛血清和100 U/ml 青霉素/链霉素的“成纤维细胞生长培养基”，即高糖（4,500 mg/l 葡萄糖）杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
	<ol>
		<li>在DMEM中配制“分化培养基I”，包含10%胎牛血清、10 µg/ml胰岛素、1 µM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和100 U/ml青霉素/链霉素。</li>
		<li>在DMEM中配制含有10%胎牛血清、10 µg/ml胰岛素和100 U/ml青霉素/链霉素的“分化培养基II”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制裂解缓冲液，每10 ml放射免疫沉淀测定缓冲液（RIPA缓冲液）中加入一片蛋白酶抑制剂。</li>
</ol>
2. 海藻酸盐微珠的制备（图1A）
<ol>
	<li>从细胞培养瓶中移除旧的培养基。用 10 ml PBS 清洗细胞。使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液使细胞悬浮（每瓶汇合度为 100% 的 T175 培养瓶使用 2 ml）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞进行计数。取 10 ml 细胞悬液，按照制造商说明书进行细胞计数。将剩余细胞在离心培养基中以 480 × g 在室温下离心 5 分钟。</li>
	<li>按照步骤 1.4 所述，将细胞沉淀重悬于海藻酸钠溶液中。将海藻酸钠-细胞混合液转移至 5 ml 注射器中。</li>
	<li>去除溶液中的气泡，安装 23 号针头，并将注射器倒置，形成约 1 ml 的空气腔。</li>
	<li>在包封装置的针头出口下方放置一个含有 144 ml 100 mM CaCl2 溶液的小烧杯（180 ml）。将电极连接至包封装置，电极尖端距离 100 mM CaCl2 溶液液面约 2.5 cm。</li>
	<li>将装有海藻酸钠-细胞混合液的注射器牢固地安装在注射泵上。将橡胶管连接至注射器开口处。推动活塞，使海藻酸钠-细胞混合液进入橡胶管约一半长度。调节电压至 5.4 kV。在注射泵上设定直径为 12.06 mm。调节流速至 3 ml/hr。启动注射泵。打开包封装置，并保持电压为 5.4 kV。</li>
	<li>关闭生物安全柜的窗口，并在整个海藻酸盐微球形成过程中避免任何不必要的振动。待全部溶液通过针头后，将形成的球形海藻酸盐微球在 100 mM CaCl2 溶液中继续固化 20 分钟，之后再进行 PLL 包被处理。</li>
</ol>
3. 使用PLL包被微珠（图1B）
<ol>
	<li>取出含有海藻酸钠-细胞球形微珠的烧杯，将这些微珠转移至一个50 ml离心管中。去除微珠沉淀中的CaCl2溶液。</li>
	<li>加入30 ml 0.9% NaCl溶液洗涤海藻酸钠-细胞球形微珠。用手轻轻振荡离心管。待微珠自然沉降后，用25 ml移液器吸除0.9% NaCl溶液。重复此步骤两次，共洗涤3次。</li>
	<li>每1 ml海藻酸钠溶液使用10 ml 0.05%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。加入0.05% PLL后，在1,000转/分钟条件下涡旋振荡10分钟。 
	注意：通常，10分钟足以完成PLL包覆。</li>
	<li>形成PLL包覆层后，去除PLL溶液，并按照步骤3.2所述方法洗涤微囊3次。</li>
</ol>
4. 去除海藻酸盐核心（图1C）
<ol>
	<li>加入30 ml的50 mM柠檬酸钠溶液。等待5分钟，或直至所有海藻酸钠完全溶解。按照步骤3.1.1所述方法洗涤胶囊三次。</li>
	<li>去除0.9% NaCl，向50 ml离心管中加入20 ml培养基，并将所有含细胞的胶囊转移至细胞培养瓶中。在标准细胞培养条件下操作包封的细胞18。</li>
</ol>
5. 体外 用于研究异种移植与宿主细胞相互作用，或细胞间代谢物流入/流出动力学的应用（图2）
<ol>
	<li>在24孔板中培养宿主细胞至融合，用于共培养。培养前脂肪细胞时使用“成纤维细胞生长培养基”。</li>
	<li>将微胶囊转移至含有融合宿主细胞的24孔板中。加入微胶囊以形成单层（10² 个微胶囊/cm²）2 孔中的液体量）</li>
	<li>使用分化培养基I诱导前脂肪细胞分化。每隔48小时，更换为分化培养基II &#160;孵育六天。使用RIPA缓冲液裂解细胞。每种条件下使用50 µg蛋白，通过蛋白质印迹法分析蛋白表达水平。</li>
</ol>
6. 体内 肥胖治疗的应用（图3）
<ol>
	<li>使用4%异氟烷与氧气混合进行麻醉诱导，使用2%异氟烷与氧气混合维持麻醉。通过夹捏脚趾确认麻醉深度是否充分。
	<ol>
		<li>在眼睛上涂抹抗瘙痒软膏，以防止角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用永久标记了人工荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）的包封细胞。</li>
	<li>使用3 ml注射器和20号针头注射包封的细胞。
	<ol>
		<li>将0.5 × 106个细胞悬浮于0.2 ml PBS中，注射至位于腹腔内性腺与肾脏之间的每个iAb脂肪库中，如图3所示。对于平均体重为40 g的小鼠，使用此PBS体积和细胞数量。对于体重不同的小鼠或为确定剂量依赖性效应时，应调整细胞数量和注射体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

已采用多种方法对细胞进行包封，包括干燥、挤出和乳化19在此方法中，海藻酸盐珠通过针头挤出，随后包被PLL，再溶解海藻酸盐核心以完成包封。尽管该方法已使用多年，但制备具有理想尺寸和球形形态的微珠仍具挑战性。微囊的尺寸高度依赖于海藻酸钠溶液的黏度、挤出器直径以及针尖与CaCl₂溶液之间的距离。2 溶液20针尖与CaCl₂表面之间的距离越短2 溶液浓度越高，产生的微珠越小。所述方案可制备出具有孔隙的APL&#60;32 kD）。可使用荧光标记的免疫球蛋白通过实验测定孔径大小（&#62;32 kD）以及荧光小肽，方法如前所述18该孔径大小足以支持细胞存活 体外 培养2周后 体内 植入脂肪组织至少80天18微珠的形状是影响包封细胞存活的重要因素。带有多个卫星微珠的破裂微珠会增加细胞的突出。21当使用较低浓度和低粘度的中等G型藻酸盐溶液时，会发生卫星液滴形成现象22，而尾部的形成是由于高G型海藻酸盐所致23由于剪切力也...

慢性疾病发病率的不断上升1推动了治疗性细胞群体移植的研究2。同基因型或异基因型干细胞是这些应用中最常用的细胞类型2。然而，这些治疗方法无法控制干细胞植入后的分化和迁移过程，且成本效益较低。移植具有有益功能的基因修饰细胞有望改善多种疾病的治疗。但基因修饰的细胞会被宿主免疫系统识别，因此这类治疗需要伴随免疫抑制3。Chang 博士开发了胰岛素生成细胞的包封技术4。该技术基于将细胞包裹在海藻酸盐液滴中，并将其浸入氯化钙溶液中。海藻酸分子由甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）组成，可通过 Ca2+ 连接。凝胶化后，微珠被悬浮于聚-L-赖氨酸（PLL）溶液中。在此步骤中，PLL 与海藻酸分子中的 G 和 M 结合，从而形成胶囊的膜结构。胶囊膜的孔隙率可通过调节 M 和 PLL 的浓度、孵育时间及温度进行调控。PLL 的结合还取决于海藻酸的类型和浓度。由 Ca2+ 离子交联的海藻酸盐基质在生理环境或含有高浓度磷酸盐和柠檬酸盐离子的常见缓冲液中不稳定。这些缓冲液可从海藻酸中提取 Ca2+，导致核心液化。海藻酸核心的液化为胶囊内部的细胞运动和生长提供了空间。使用多阴离子海藻酸与多阳离子聚-L-赖氨酸（APL）包封的细胞对免疫球蛋白不可渗透，但允许营养物质流入和毒素流出。APL 的这些特性使得包封细胞在移植到遗传背景不同的宿主体内后能够长期存活。Elliott 等 报道了一例人类患者在植入包封的猪胰腺细胞九年后，这些细胞仍保持功能并存活5。
包封技术可分为微包封（3-800 µm）和大包封（大于 1,000 µm）。微胶囊比大胶囊更耐用6。自1964年张博士及其同事发现以来，微包封已广泛用于包封产生胰岛素、其他激素和生物活性分子的合成细胞7。这些治疗方法在宿主组织中面临多种挑战，包括纤维化和免疫反应8。最初与生物聚合物质量相关的副作用已得到解决。然而，由于激素在特化腺体外过量产生，合成细胞的移植仍会引发纤维化等副作用。
近几十年来，肥胖症和2型糖尿病已达到流行病的程度9。全球超过30%的成年人超重或肥胖10。腹腔内（iAb）脂肪的增加会提高慢性炎症的发生率，并促进2型糖尿病、心血管疾病、某些癌症及其他并发症的发展11-13。多项证据表明，特定脂肪细胞可预防与iAb脂肪相关的发病过程。最近的研究显示，在活体动物（in vivo）中，将皮下脂肪细胞移植至iAb区域可改善代谢状况，并减少啮齿类动物的肥胖和胰岛素抵抗14。有效减轻肥胖和胰岛素抵抗与具有以热能形式耗散能量能力的产热型脂肪细胞相关15,16。通过稳定转染参与线粒体质子解偶联的基因（如解偶联蛋白1（Ucp1）），或调控Ucp1及其他产热基因表达的基因，可实现脂肪细胞的产热性改造15,16。我们近期的研究表明，醛脱氢酶1a1（Aldh1a1）缺陷可导致iAb脂肪发生产热性重塑，从而减轻这些小鼠的肥胖和胰岛素抵抗17,18。值得注意的是，将产热型Aldh1a1缺陷（Aldh1a1-/-）前脂肪细胞进行包封后，可在肥胖野生型小鼠的iAb脂肪中产生相同的治疗效果，提示了治疗iAb脂肪的新策略18。在实验条件下，包封细胞使研究人员能够以经济有效的方式研究特定细胞群体的作用19。本文将讨论一种产热型分解代谢细胞系的包封方法，及其在肥胖小鼠模型中的实验室与治疗应用。该方案描述了微胶囊制备的三个阶段（图1）：海藻酸微珠的形成（图1A）、在微珠表面形成聚阳离子聚-L-赖氨酸（PLL）膜（图1B），以及去除海藻酸核心（图1C）。

<table><tbody><tr><td>包封装置（VAR V1）</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>无</td></tr><tr><td>KD 科学注射泵</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>无</td></tr><tr><td>奥林巴斯显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>无</td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>无</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>无</td></tr><tr><td>柠檬酸三钠三碱二水合物</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>无</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>无</td></tr><tr><td>ATGL 一抗（兔源）</td><td>Cell Signaling</td><td>2138S</td><td>无</td></tr><tr><td>二抗（抗兔）</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>无</td></tr><tr><td>放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA buffer）</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>无</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>无</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>无</td></tr><tr><td>可的松10止痒软膏</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>无</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>无</td></tr><tr><td>新生牛血清（CS）</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>无</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>无</td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>无</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>无</td></tr><tr><td>胰岛素（牛源）</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>无</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>无</td></tr></tbody></table>

包封产热型前脂肪细胞并移植至脂肪组织库

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

细胞封装技术旨在将活细胞包裹于半透膜内。移植后的封装细胞可与宿主组织交换低分子量代谢物，从而实现长期存活。半透膜可使移植的封装细胞避免受到免疫系统的排斥。该封装技术旨在实现对生物活性物质（如胰岛素、其他激素和细胞因子）的可控释放。本文介绍一种用于封装产热分解代谢细胞的方法，这类细胞可在肥胖小鼠的腹腔内脂肪组织中通过消耗脂质产生热量并耗散能量（即产热作用）。封装产热型分解代谢细胞可能适用于肥胖症和2型糖尿病的预防与治疗。分解代谢细胞的另一潜在应用还包括清除酒精或其他有毒代谢物及环境污染物。

图1显示，在显微镜下可控制微珠制备的每一步骤。图2A展示了如何将脂肪细胞与一层包封细胞共培养。图2B是使用第5节所述脂肪细胞/微胶囊共培养体系进行定量研究的代表性示例。脂肪细胞裂解物通过蛋白质印迹法进行分析。本实验未对包封细胞进行分析。一抗ATGL和β-actin的使用稀释比例均为1:1,000。ATGL与β-actin的比值以三次独立实验的均值±标准差（S.D.）表示。类似的共培养方法也可用于分析mRNA，并研究共培养体系中包封细胞与脂肪细胞相互作用的影响。数据显示，与包封的野生型（WT）脂肪细胞相比，包封的产热型Aldh1a1-/-脂肪细胞可显著诱导脂肪细胞中更高水平的ATGL脂肪酶表达及脂解作用18。
图3 显示GFP可指示胶囊在宿主脂肪组织中的位置及其完整性。GFP的表达也是细胞活力的指标。
定性评估
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本文介绍了一种用于包封消耗脂肪以产生热量的分解代谢细胞的实验方案，这些细胞存在于腹腔内脂肪组织中，并可在肥胖小鼠中增加能量消耗。

细胞封装技术旨在将活细胞包裹于半透膜内。移植后的封装细胞可交换小分子物质……

本实验的总体目标是展示一种产热代谢细胞系的包封技术，并演示其在体外以及潜在的体内应用。开始本实验时，先制备海藻酸钠细胞悬浮液，并将其转移至5毫升注射器中。下一步是使用包封装置制备海藻酸盐微珠。随后，微珠被聚阳离子聚-L-赖氨酸溶液包被，并去除海藻酸盐核心，从而在细胞悬液周围形成一层半透膜。最后一步是将包封的细胞与其他细胞系共培养，或将其注射到小鼠的脂肪组织中。最终，免疫血液分析显示，与醛脱氢酶缺陷型脂肪细胞共培养的脂肪细胞具有更高的脂解活性，后者含有微胶囊。尽管免疫组织化学显示包封细胞成功移植到小鼠的脂肪组织中，该方法仍可为产热作用和白色脂肪组织提供研究依据。此外，该方法还可应用于其他现有的动物模型，为体内测试细胞亚群提供低成本的实验模型系统。在进行生物医学研究时，所有操作均应在具有层流的二级生物安全柜中进行。首先，从细胞培养瓶中移除旧的培养基，并用 10 毫升 PBS 冲洗前脂肪细胞。吸除 PBS，将细胞重悬于 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液中。从细胞悬液中取出 10 微升等分试样，使用血细胞计数板进行细胞计数。根据制造商说明书，向剩余细胞中加入DMEM，以获得理想数量的细胞，并在室温下以480 × g离心五分钟。在按照方案文本中的指示确定所需细胞数量后，将细胞沉淀重悬于适当体积的2%海藻酸钠溶液中。将含有细胞的海藻酸钠溶液转移至5毫升注射器中。去除溶液中的任何气泡，并将注射器倒置，形成一个一毫升的空气袋。为准备包埋，取一个含有144毫升100毫摩尔氯化钙溶液的小烧杯。在包埋装置的针头出口下方，将电极连接至包埋物，使其尖端位于氯化钙溶液表面上方约2.5厘米处。将装有海藻酸钠细胞溶液的注射器牢固地放入注射泵中。将橡胶管连接到注射器的开口处。推动推杆，直至海藻酸钠细胞溶液进入橡胶管一半的位置。将电压调节至5.4千伏，在注射泵上将直径设置为12.06毫米。调节流速为每小时3毫升。启动泵，打开包封装置，并维持电压在5.4千伏。关闭生物安全柜的窗口，并在海藻酸微球形成过程中避免任何不必要的振动。待所有溶液通过针头后，将海藻酸钠球形微球在氯化钙溶液中继续固化20分钟，然后再用带多阴离子的聚赖氨酸（polyanionic polylysine）或PLL包被。一旦海藻酸钠细胞球形微球完全固化，将盛有微球的烧杯从包封装置中取出。将微珠转移至一个50毫升离心管中。移除微珠沉淀中的氯化钙溶液。加入30毫升0.9%氯化钠溶液洗涤微珠，并用手轻轻振荡试管。让微珠依靠重力自然沉降。然后用25毫升移液管以这种方式去除氯化钠溶液。总共洗涤微珠三次。接下来，将0.05% PLL溶液加入微珠中。每1毫升海藻酸钠溶液使用10毫升PLL溶液。在1000转/分钟条件下涡旋振荡10分钟，通常足以完成PLL包被。确认PLL包被形成后，移除PLL溶液，并用0.9%氯化钠溶液洗涤微囊三次（如前所示），以首先去除PLL包被微球中的可替换核心。向50毫升离心管中加入30毫升50毫摩尔的柠檬酸钠溶液，静置5分钟，或直至所有海藻酸钠完全溶解。随后按照之前方法，用0.9%氯化钠溶液将微囊洗涤三次。第三次洗涤后，将20毫升培养基转移至试管中，然后将所有含细胞的胶囊转移至细胞培养瓶，并在标准细胞培养条件下培养包封的细胞。该操作的宿主细胞应在24孔板中培养至完全汇合。使用如配套方案中所述配制的成纤维细胞生长培养基。用于培养前脂肪细胞的文本。将微胶囊转移至含有汇合宿主细胞的24孔板中，添加微胶囊以在每个孔中形成单层，使用分化培养基一诱导前脂肪细胞分化，孵育48小时。48小时后，将培养基更换为分化培养基二。此后每隔48小时，用新鲜的分化培养基二更换培养基，并通过蛋白质印迹法分析细胞中的蛋白质。可在显微镜下观察微珠制备的每一步。图中显示的是在20倍放大倍数下的海藻酸盐微珠。在PLL包被前、用PLL编码后，以及在定量研究中溶解明胶核心后，比较了三种T3L1脂肪细胞与无细胞的野生型或醛脱氢酶1A1缺陷型脂肪细胞微胶囊共培养时的脂肪甘油三酯脂肪酶（A TGL）表达水平。在与含有微胶囊的L DH one A one缺陷型adipocyte共培养的脂肪细胞中，A TGL的表达水平更高，表明其具有更高的脂解活性。在一项体内研究中，将GFP标记的包封细胞注射到小鼠的腹腔内脂肪组织中。80天后，注射部位的脂肪组织中出现了着色的包封细胞簇。经苏木精、伊红染色的腹腔内脂肪组织石蜡切片显示，移植的微胶囊包裹细胞与宿主脂肪细胞呈簇状分布。同一组织切片在荧光显微镜下观察，可见圆形完整胶囊内部带有GFP标记的移植细胞。GFP的表达也是细胞在移植后存活的指标。这种包封技术为代谢疾病领域的研究人员探索肥胖、2型糖尿病中的胰岛素抵抗、炎症、癌症以及模式生物的潜在治疗方法铺平了道路。

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医学

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