包封产热型前脂肪细胞并移植至脂肪组织库

本实验的总体目标是展示一种产热代谢细胞系的包封技术，并演示其在体外以及潜在的体内应用。开始本实验时，先制备海藻酸钠细胞悬浮液，并将其转移至5毫升注射器中。下一步是使用包封装置制备海藻酸盐微珠。

随后，微珠被聚阳离子聚-L-赖氨酸溶液包被，并去除海藻酸盐核心，从而在细胞悬液周围形成一层半透膜。最后一步是将包封的细胞与其他细胞系共培养，或将其注射到小鼠的脂肪组织中。最终，免疫血液分析显示，与醛脱氢酶缺陷型脂肪细胞共培养的脂肪细胞具有更高的脂解活性，后者含有微胶囊。

尽管免疫组织化学显示包封细胞成功移植到小鼠的脂肪组织中，该方法仍可为产热作用和白色脂肪组织提供研究依据。此外，该方法还可应用于其他现有的动物模型，为体内测试细胞亚群提供低成本的实验模型系统。在进行生物医学研究时，所有操作均应在具有层流的二级生物安全柜中进行。

首先，从细胞培养瓶中移除旧的培养基，并用 10 毫升 PBS 冲洗前脂肪细胞。吸除 PBS，将细胞重悬于 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液中。从细胞悬液中取出 10 微升等分试样，使用血细胞计数板进行细胞计数。

根据制造商说明书，向剩余细胞中加入DMEM，以获得理想数量的细胞，并在室温下以480 × g离心五分钟。在按照方案文本中的指示确定所需细胞数量后，将细胞沉淀重悬于适当体积的2%海藻酸钠溶液中。将含有细胞的海藻酸钠溶液转移至5毫升注射器中。

去除溶液中的任何气泡，并将注射器倒置，形成一个一毫升的空气袋。为准备包埋，取一个含有144毫升100毫摩尔氯化钙溶液的小烧杯。在包埋装置的针头出口下方，将电极连接至包埋物，使其尖端位于氯化钙溶液表面上方约2.5厘米处。

将装有海藻酸钠细胞溶液的注射器牢固地放入注射泵中。将橡胶管连接到注射器的开口处。推动推杆，直至海藻酸钠细胞溶液进入橡胶管一半的位置。

将电压调节至5.4千伏，在注射泵上将直径设置为12.06毫米。调节流速为每小时3毫升。启动泵，打开包封装置，并维持电压在5.4千伏。

关闭生物安全柜的窗口，并在海藻酸微球形成过程中避免任何不必要的振动。待所有溶液通过针头后，将海藻酸钠球形微球在氯化钙溶液中继续固化20分钟，然后再用带多阴离子的聚赖氨酸（polyanionic polylysine）或PLL包被。一旦海藻酸钠细胞球形微球完全固化，将盛有微球的烧杯从包封装置中取出。

将微珠转移至一个50毫升离心管中。移除微珠沉淀中的氯化钙溶液。加入30毫升0.9%氯化钠溶液洗涤微珠，并用手轻轻振荡试管。

让微珠依靠重力自然沉降。然后用25毫升移液管以这种方式去除氯化钠溶液。总共洗涤微珠三次。

接下来，将0.05% PLL溶液加入微珠中。每1毫升海藻酸钠溶液使用10毫升PLL溶液。在1000转/分钟条件下涡旋振荡10分钟，通常足以完成PLL包被。

确认PLL包被形成后，移除PLL溶液，并用0.9%氯化钠溶液洗涤微囊三次（如前所示），以首先去除PLL包被微球中的可替换核心。向50毫升离心管中加入30毫升50毫摩尔的柠檬酸钠溶液，静置5分钟，或直至所有海藻酸钠完全溶解。随后按照之前方法，用0.9%氯化钠溶液将微囊洗涤三次。

第三次洗涤后，将20毫升培养基转移至试管中，然后将所有含细胞的胶囊转移至细胞培养瓶，并在标准细胞培养条件下培养包封的细胞。该操作的宿主细胞应在24孔板中培养至完全汇合。使用如配套方案中所述配制的成纤维细胞生长培养基。

用于培养前脂肪细胞的文本。将微胶囊转移至含有汇合宿主细胞的24孔板中，添加微胶囊以在每个孔中形成单层，使用分化培养基一诱导前脂肪细胞分化，孵育48小时。

48小时后，将培养基更换为分化培养基二。此后每隔48小时，用新鲜的分化培养基二更换培养基，并通过蛋白质印迹法分析细胞中的蛋白质。

可在显微镜下观察微珠制备的每一步。图中显示的是在20倍放大倍数下的海藻酸盐微珠。在PLL包被前、用PLL编码后，以及在定量研究中溶解明胶核心后，比较了三种T3L1脂肪细胞与无细胞的野生型或醛脱氢酶1A1缺陷型脂肪细胞微胶囊共培养时的脂肪甘油三酯脂肪酶（A TGL）表达水平。

在与含有微胶囊的L DH one A one缺陷型adipocyte共培养的脂肪细胞中，A TGL的表达水平更高，表明其具有更高的脂解活性。在一项体内研究中，将GFP标记的包封细胞注射到小鼠的腹腔内脂肪组织中。80天后，注射部位的脂肪组织中出现了着色的包封细胞簇。

经苏木精、伊红染色的腹腔内脂肪组织石蜡切片显示，移植的微胶囊包裹细胞与宿主脂肪细胞呈簇状分布。同一组织切片在荧光显微镜下观察，可见圆形完整胶囊内部带有GFP标记的移植细胞。GFP的表达也是细胞在移植后存活的指标。

这种包封技术为代谢疾病领域的研究人员探索肥胖、2型糖尿病中的胰岛素抵抗、炎症、癌症以及模式生物的潜在治疗方法铺平了道路。